CN109395060A - 一种固有免疫激活肽的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固有免疫激活肽的应用，属于生物医学技术领域。本发明金环蛇抗菌肽cathelicidin‑BF可适当激活机体的吞噬细胞固有免疫应答，但并不显著和过度刺激巨噬细胞产生大量促炎细胞因子，显著降低了患者产生炎症性免疫损伤的可能性。在临床应用潜力方面，cathelicidin‑BF无溶血活性和细胞毒性且分子量小，结构简单，易于化学合成和蛋白表达。cathelicidin‑BF兼具直接杀菌功能和增强抗菌固有免疫应答功能，这些优点使其有望成为新一代临床肽类抗生素/免疫调节制剂研发的优良候选分子。

Description

一种固有免疫激活肽的应用

技术领域

本发明涉及一种固有免疫激活肽的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是导致人类化脓性感染 的最常见病原菌，可引起局部化脓感染，乃至引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎， 甚至败血症、脓毒血症等全身严重感染。因为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistantS.aureus,MRSA)的出现和新型抗耐药菌抗生素研发不 足，抗生素治疗在许多情况下失去其功效。这种情况加速了对抗感染治疗新方 法的积极寻求。目前研究的新方法中，免疫调节疗法是一种很有吸引力的疗法， 因为它是抗生素疗法的有益补充，且具有更广泛的应用，同时能减少细菌的耐 药性。临床部分免疫力低下者如新生儿、放化疗患者、HIV患者等，其细菌感 染风险显著高于普通人群，提前进行免疫生物制剂注射可以显著提高这一人群的抗感染免疫力。因此，亟待寻找合适的免疫调节制剂。固有免疫在宿主防御 感染中起早期第一道防线关键作用。早期巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬细胞为 代表的固有免疫的适度激活有利于早期局部清除细菌和部分病毒。有证据表明， 增强宿主抗菌固有免疫应答是预防和治疗细菌感染的有效策略。固有免疫反应 的非特异性允许其提供针对各种细菌的广谱保护，包括抗生素抗性细菌。然而， 固有免疫系统的过度活化也可能导致促炎细胞因子(例如TNF-α和IL-6)过量 产生。因此，成功应用免疫调节疗法需要避免全身性炎症反应的发生。

抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)是生物体产生的进化保守的一类具有 广谱抗菌、抗病毒、杀寄生虫、抗肿瘤等生物活性的小分子多肽的总称，广泛 分布于自然界的各种生物。抗菌肽是固有免疫的重要组成部分，是抵御外界病 原微生物侵袭的第一道防线。Cathelicidin是其中一种具有广谱抗微生物活性的 抗菌肽，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及部分病毒具有非常强 的抵抗活性，且对许多临床耐药微生物同样具有作用。目前仅在哺乳类、爬行 类、鸟类以及鱼类中发现其存在。Cathelicidin家族抗菌肽还具有趋化多种免疫 细胞、诱导肥大细胞脱颗粒、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管生 成等其他免疫调节活性。不同物种间cathelicidin表达多样性不同，在灵长类、 大鼠、小鼠和蛇类中目前只发现一种cathelicidin，人中为LL-37，小鼠和大鼠 中为CRAMP，银环蛇、眼镜蛇和眼镜王蛇中为cathelicidin-related protein，金 环蛇中为cathelicidin-BF。

金环蛇(Bungarus fasciatus)属眼镜蛇科(Elapinae)环蛇属(Bungarus)， 目前已从金环蛇蛇毒中发现多种活性成分。cathelicidin-BF是金环蛇毒腺来源的 一种重要的肽类抗生素，其氨基酸序列为 KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸组成，均为L型， 等电点为11.79，分子量为3637.5道尔顿。前期的研究多聚焦于cathelicidin-BF的直接杀菌功能，有研究证实其可以在几分钟内杀死细菌，且不产生耐药性， 而抗生素则至少需要3h，且易产生耐药性。近期研究发现，抗菌肽cathelicidin 还具有更为重要的免疫调节功能，而cathelicidin-BF的免疫调节功能目前尚未 完全阐明。

因为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的出现和新型抗耐药菌抗生素研发不足，抗生素治疗在许多情况下失去其功效。 这种情况加速了对抗感染治疗新方法的积极寻求。目前研究的新方法中，免疫 调节疗法是一种很有吸引力的疗法，因为它是抗生素疗法的有益补充，且具有 更广泛的应用，同时能减少细菌的耐药性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF通过激活 巨噬细胞等MAPK信号通路及NF-κB信号通路，促进单核细胞及中性粒细胞 趋化因子的分泌，显著促进单核/巨噬细胞和中性粒细胞向感染部位的募集，从 而增强小鼠体内局部的抗菌固有免疫应答，促进小鼠抵抗S.aureus和MRSA的 感染。

本发明的第一个目的是提供一种金环蛇抗菌肽在制备固有免疫激活药物中 的应用。

进一步地，所述的金环蛇抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的固有免疫激活药物为激活机体的吞噬细胞固有免疫应答 的药物。

进一步地，所述的金环蛇抗菌肽促进中性粒细胞、单核/巨噬细胞向细菌感 染局部的富集。

进一步地，所述的金环蛇抗菌肽促进细菌感染局部或注射部位上调表达单 核细胞和中性粒细胞的趋化因子。

进一步地，所述的趋化因子为CCL2、CXCL1或CXCL2。

进一步地，所述的金环蛇抗菌肽对炎性细胞因子产生水平没有显著影响。

进一步地，所述的炎性细胞因子为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β)或白介素-6(IL-6)。

进一步地，所述的细菌是金黄色葡萄球菌S.aureus、耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌MRSA、大肠杆菌和鲍曼氏不动杆菌中的一种或一种以上组合。

进一步地，所述的金环蛇抗菌肽激活MAPK和NF-κB信号通路。

进一步地，所述的固有免疫激活药物的剂型为注射剂、外用软膏或硬膏剂。

进一步地，体内使用时，所述的金环蛇抗菌肽浓度范围为1-10mg/kg；体 外使用时，所述的金环蛇抗菌肽浓度范围为1-20μg/mL。

本发明的有益效果是：

金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF可适当激活机体的吞噬细胞固有免疫应答， 但并不显著和过度刺激巨噬细胞产生大量促炎细胞因子，显著降低了患者产生 炎症性免疫损伤的可能性。在临床应用潜力方面，cathelicidin-BF无溶血活性和 细胞毒性且分子量小，结构简单，易于化学合成和蛋白表达。cathelicidin-BF兼 具直接杀菌功能和增强抗菌固有免疫应答功能，这些优点使其有望成为新一代 临床肽类抗生素/免疫调节制剂研发的优良候选分子。

附图说明

图1为预先腹腔注射抗菌肽cathelicidin-BF小鼠S.aureus和MRSA感染结 果；其中A为S.aureus感染结果，B为MRSA感染结果；

图2为小鼠腹腔预先注射抗菌肽cathelicidin-BF后腹水内固有免疫细胞亚 群变化；其中，A流式细胞术检测小鼠腹水中CD11b⁺髓系细胞、CD11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞、CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞和CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^high单核细胞的示意 图；B各细胞亚群计数；

图3为小鼠腹腔注射cathelicidin-BF后腹水趋化因子及细胞因子表；

图4为cathelicidin-BF体外促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌趋化因子及细胞因 子表达的剂量依赖性；

图5为抗菌肽cathelicidin-BF激活腹腔巨噬细胞内MAPK和NF-κB信号通 路的WB检测；其中A为MAPK通路激活的WB检测，B为NF-κB通路激活 的WB检测。

具体实施方式

本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不祈祷 限制性作用。本领域技术人员可由本说明书所解释的内容清楚的了解本发明的 特点与功效，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或运用。实 施例中未说明具体条件的实验，通常按照常规条件如厂商说明书、实验指南或 教科书内容的条件。

实施例1：

预注射cathelicidin-BF可有效增强小鼠抵抗S.aureus感染：

实验动物SPF级C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～20g，雌性，购 于上海斯莱克动物有限公司[SCXK(沪)2012-0002]。小鼠随机标记分笼饲养于苏 州大学SPF动物房。金黄色葡萄球菌S.aureus(ATCC25923)和临床分离的耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)为本实验室保 存。Cathelicidin-BF多肽、人源cathelicidin抗菌肽LL-37(上海吉尔生化公司 合成)。实验动物与分组将C57BL/6小鼠随机分成两组，每组5只，对照组 为溶剂(PBS)注射组；实验组为cathelicidin-BF注射组(10mg/kg)。分别在 细菌感染前24h(-24h)、8h(-8h)和4h(-4h)给C57BL/6小鼠腹腔注射cathelicidin-BF(10mg/kg)，对照组给予等体积PBS，在第0h(0h)分别腹 腔注射S.aureus和耐药株MRSA(2.5×10⁸CFU/只)，注射后用碘酒消毒，18h 后处死小鼠。用注射器吸取2mL预冷PBS冲洗腹腔收集腹水，测细菌菌落形 成单位(colony forming unit,CFU)。

结果如图1所示，与对照组相比，预注射cathelicidin-BF的小鼠腹腔灌洗 液中S.aureus的细菌载量显著降低。-24h、-8h和-4h注射cathelicidin-BF相 较于对照分别抑制了99.76％、99.84％和99.97％的细菌增殖(图1A)，提示 cathelicidin-BF可显著抑制S.aureus感染。不仅如此，-24h、-8h和-4h腹腔注 射cathelicidin-BF相较于对照分别抑制了99.72％、99.29％和98.34％的MRSA 增殖(图1B)。结果表明，预先给予cathelicidin-BF注射可有效预防小鼠抵抗 S.aureus甚至MRSA的感染。

实施例2：

腹腔注射cathelicidin-BF可促进中性粒细胞、单核/巨噬细胞趋化迁移至腹 腔局部：

细菌感染局部早期浸润的中性粒细胞和单核/巨噬细胞是重要的吞噬杀菌 细胞，对清除病原菌起着至关重要的作用。为明确cathelicidin-BF是否可增强 吞噬细胞的腹腔浸润从而促进清除S.aureus，给小鼠腹腔注射cathelicidin-BF 后4h和8h收集腹水内细胞进行流式分析。取腹腔细胞(1×10⁶)重悬于EP 管中，PBS洗一遍，PBS 100μL重悬后，加入细胞表面标记抗体(anti-mCD45、 anti-mCD11B、anti-mLy6G、anti-mLy6C、anti-mF4/80)，4℃避光冰上孵育30 min后，1 500r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤2遍，加入300μL PBS重 悬后，置于BD FACSCantoⅡ流式细胞仪检测。

结果如图2所示，与对照组相比，注射cathelicidin-BF后，腹水中的淋巴 细胞(CD45⁺)总数显著增加[7.3×10⁵(对照组)vs 1.0×10⁶(4h)vs 1.1×10⁶(8h)，P＜0.05]；其中，CD45⁺CD11b⁺髓系细胞亚群的增高最为显著(图2B)。注 射cathelicidin-BF(10mg/kg)4h和8h后，髓系细胞中的中性粒细胞分别增加 了43和56倍，F4/80⁺Ly6C^high巨噬细胞分别增加了13和4倍，Ly6C^high单核分 别增加了44和133倍，对Ly6C^low巨噬细胞和Ly6C^low单核细胞没有显著影响 (图2B)。提示cathelicidin-BF可有效促进对中性粒细胞、单核/巨噬细胞向腹腔局部的招募。

实施例3：

腹腔注射cathelicidin-BF可诱导小鼠腹水上调表达单核/巨噬细胞和中性 粒细胞趋化因子：

为了明确cathelicidin-BF可招募中性粒、单核/巨噬细胞到腹腔局部，检测 了cathelicidin-BF注射对趋化因子的影响。首先给小鼠腹腔注射cathelicidin-BF (10mg/kg)，4h后取腹水，通过ELISA检测趋化因子及细胞因子水平。

结果发现：与对照组相比，注射cathelicidin-BF小鼠腹水中的趋化因子 (CCL2，CXCL1，CXCL2)的产生水平显著增加，分别为对照组小鼠的8.4 倍、7.8倍和4.6倍，但cathelicidin-BF处理组小鼠腹水中炎性细胞因子水平 (TNF-α，IL-1β，IL-6)并无明显的变化(图3)。提示腹腔注射cathelicidin-BF 可诱导腹腔局部产生高水平趋化因子。

实施例4：

Cathelicidin-BF体外可诱导巨噬细胞分泌单核/巨噬细胞与中性粒细胞趋 化因子：

为进一步确证cathelicidin-BF可诱导趋化因子的产生，取小鼠腹腔巨噬细 胞，体外加入cathelicidin-BF(5、10和20μg/mL)，检测上清趋化因子水平。

结果发现，与PBS相比，cathelicidin-BF能够剂量依赖性促进巨噬细胞分 泌趋化因子，5、10和20μg/mL的抗菌肽处理4h后，巨噬细胞培养上清中CCL2 水平分别是对照组的6.6倍、7.4倍和14.2倍；中性粒细胞趋化因子CXCL1水 平分别是对照组的9.5倍、15.4倍和27.6倍；CXCL2水平分别是对照组的10.2 倍、13.1倍和18.9倍；但对炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)产生水平没 有显著影响(图4)。

实施例5：

Cathelicidin-BF可激活腹腔巨噬细胞的MAPK和NF-κB信号通路：

为了探究cathelicidin-BF诱导趋化因子产生所激活的固有免疫相关细胞信 号通路，以cathelicidin-BF(10μg/mL)处理小鼠腹腔巨噬细胞，以LPS和LL-37 作为阳性对照，PBS为阴性对照。

结果显示：cathelicidin-BF能够激活MAPK信号通路，包括诱导ERK、p38 和JNK的磷酸化；相较于人源cathelicidin抗菌肽LL-37，cathelicidin-BF对 ERK、p38和JNK的激活更为明显(图5左图)。此外，cathelicidin-BF能同 时激活NF-κB信号通路，可诱导NF-κBp65磷酸化；相较于LL-37， cathelicidin-BF对NF-κB p65的激活更为明显，而对IκBα无明显影响(图5右 图)。结果提示，cathelicidin-BF可显著激活腹腔巨噬细胞的MAPK和NF-κB信号通路。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的 保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或 变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种固有免疫激活肽的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> (人工序列)

<400> 1

Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Glu

1 5 10 15

Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe

20 25 30

Claims (10)

1.一种金环蛇抗菌肽在制备固有免疫激活药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的金环蛇抗菌肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的固有免疫激活药物为激活机体的吞噬细胞固有免疫应答的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的金环蛇抗菌肽促进中性粒细胞、单核/巨噬细胞向细菌感染局部的富集。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的金环蛇抗菌肽促进细菌感染局部和/或注射部位上调表达单核细胞和中性粒细胞的趋化因子。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的趋化因子为CCL2、CXCL1或CXCL2。

7.根据权利要求4或5任一项所述的应用，其特征在于，所述的细菌是金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼氏不动杆菌中的一种或一种以上组合。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的金环蛇抗菌肽激活MAPKs和NF-κB信号通路。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的固有免疫激活药物的剂型为注射剂、外用软膏或硬膏剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，体内使用时，所述的金环蛇抗菌肽浓度范围为1-10mg/kg；体外使用时，所述的金环蛇抗菌肽浓度范围为1-20μg/mL。