CN112430262B

CN112430262B - 一类抗真菌肽及其应用

Info

Publication number: CN112430262B
Application number: CN202011354265.3A
Authority: CN
Inventors: 招秀伯; 唐婧; 李月平; 王静芳; 尤蓉蓉; 吕松伟
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN112430262A

Abstract

本发明公开了一类抗真菌肽及其应用，属于肽类抗生素，抗真菌肽具有如下氨基酸序列：At3：KLLKKVVKLFKKLLK；At5：KIIKKIIKIIKKIIK；At10：IKKIIKIIKKIIKKI。该类抗菌肽由亲水和亲油类氨基酸组成，结构稳定，在水中呈无规卷曲，在磷脂模拟膜环境中呈α‑螺旋。该类抗菌肽具有显著抑制多种病原真菌生长与繁殖的作用，包括白色念珠菌(ATCC 10231)，临床白色念珠菌，临床热带念珠菌，临床葡萄牙念珠菌。本发明提供了一类新型的抗真菌肽，能够有效代替传统抗生素，且不易产生耐药性，具有很好的应用前景。

Description

一类抗真菌肽及其应用

技术领域

本发明优化设计了一类具有广谱抗菌性的新型抗菌肽，本发明属于医药技术领域。

背景技术

抗生素的发现，解决了很长时间内的微生物感染的问题，但是，随着抗生素的滥用，微生物对抗生素的耐药性不断加强，周期不断缩短，导致近年来耐药菌的泛滥，甚至是超级细菌的产生，对人类的生命安全有很大的影响。微生物的耐药性不断产生和速度的不断加快，使得传统的抗生素对微生物的效果一再下降，亟需新的抗生素替代传统抗生素投入市场。

抗菌肽是一类具有广谱抗菌效果的小分子活性肽，一般由10-60个氨基酸组成，广泛存在于自然界中，是动物免疫系统的组成部分，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫，调节免疫系统和促进伤口愈合等作用。抗菌肽分为阳离子型抗菌肽和阴离子型抗菌肽，主要以阳离子型为主。从结构上来说，抗菌肽主要有有α-螺旋形、β-折叠型以及环状结构。抗菌肽主要通过非受体介导的膜损伤来杀灭微生物，对微生物膜的物理破坏可以大大减少耐药菌的产生，有望成为具有优势的新型抗生素，因而成为当下的研究热点。

抗菌肽因微生物膜的破坏而难以产生耐药性，有潜力成为抗生素的替代品，但是目前能够商用或者进入临床的抗菌肽却很少，除了制备成本高，低效，低稳定性，高细胞毒性等也是抗菌肽在实际应用中的障碍。因此通过合理的设计和修饰，开发出高效、低毒、自组装等特点的新型抗菌肽已经成为研究热点。

截取天然抗菌肽的活性成分，改变氨基酸残基，调节正电荷数量和分布，设计自组装抗菌肽，及超短抗菌肽的设计等都是目前合成抗菌肽的有效手段。

本发明通以天然抗菌肽KLLPSVVGLFKKKKQ的结构为基础，采用氨基酸替换，增加正电荷数量的方式设计了一系类具有正电荷性和两亲性的多肽，并提高其α-螺旋性以提高其抗菌效果。通过抗菌实验筛选，获得3条效果优秀的抗真菌肽(命名为At3，At5，At10)。实验证明，上述3条抗菌肽对多种致病菌都具有抗菌效果，所述致病菌包括白色念珠菌、临床白色念珠菌、临床热带念珠菌、临床葡萄牙念珠菌。该抗真菌肽用于制备抗真菌药物具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一类高效安全的新型广谱抗菌肽。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术手段：

本发明以抗菌肽Ponericin-W1后半部分KLLPSVVGLFKKKKQ序列为模板，将亲水部分换为K，亲油部分换为V，L，I，F中的一种或多种，增加正电荷数量等方法设计出了新的抗菌肽。

经筛选，获得3条效果优秀的抗真菌肽，所述的抗菌肽形成以I、L、K为主的α-螺旋形结构，具体的氨基酸序列为At3:N端-KLLKKVVKLFKKLLK-C端；At5:N端-KIIKKIIKIIKKIIK-C端；At10:N端-IKKIIKIIKKIIKKI-C端。

进一步，C-端采用酰胺化修饰，N-端采用乙酰化修饰。

编码所述的广谱型抗菌肽序列也在本发明的保护范围内。

实验证明，上述抗菌肽对真菌具有抗菌效果，能用于制备抗真菌药物。

进一步，真菌有白色念珠菌、临床白色念珠菌、临床热带念珠菌、临床葡萄牙念珠菌等。

因此本发明的抗菌肽能抑制或杀灭白色念珠菌、临床白色念珠菌、临床热带念珠菌、临床葡萄牙念珠菌，能用于治疗或预防由上述真菌导致的感染及其相关疾病的药物中的用途。

相较于现有技术，本发明的优点是：

本发明提供了一种新型的具有广谱抗菌效果的抗菌肽，该抗菌肽具有显著的抑制多种致病菌生长的作用，所述的致病菌包括白色念珠菌、临床白色念珠菌、临床热带念珠菌、临床葡萄牙念珠菌，能够替代传统抗生素，具有广谱抗菌活性，且不易产生耐药性，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为多肽At3、At5、At10形成α-螺旋后的氨基酸分布图；

图2为多肽At3、At5、At10的液相色谱图；

图3为多肽At3、At5、At10的质谱图；

图4为多肽At3、At5、At10在H₂O、25mM SDS、0.25mg/mL DPPC、0.25mg/mL DPPG中的圆二色谱图；

图5为多肽At3、At5、At10对白色念珠菌，临床白色念珠菌、临床热带念珠菌、临床葡萄牙念珠菌的抗菌活性；

图6为多肽At3、At5、At10对白色念珠菌(ATCC 10231)的MBC图；

图7为多肽At10的细胞毒性；

图8为多肽At10的溶血活性；

图9为多肽At10对白色念珠菌(ATCC 10231)的耐药图；

图10为不同浓度多肽At10对白色念珠菌(ATCC 10231)处理后的扫描电镜图；

图11为不同浓度多肽At10对白色念珠菌(ATCC 10231)处理后的Live/Dead染色图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施中的附图，对本发明中的技术方案进行清晰、完整地描述。本发明中描述的实施例仅是本发明中的部分实施例。基于本发明中的实施例，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1多肽的At10的抗菌活性研究

1材料与方法

1.1材料：

1.1.1菌株

白色念珠菌ATCC 10231购自美国模式培养物集存库，临床白色念珠菌、临床热带念珠菌、临床葡萄牙念珠菌由常州第二人民医院馈赠。

1.1.2药品与试剂

葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)购自国药集团，胰蛋白胨、酵母提取物购自安琪，琼脂粉、2.5％戊二醛溶液、多聚赖氨酸溶液、PI染料、DAPI染料购自索莱宝，麦芽提取物、YM固体培养基购自青岛海博公司，DPPC、DPPG购自阿拉丁公司，SYTO-9染料购自美国Sigma公司。

1.1.3仪器

分析天平购自美国Sartorious公司、冷冻离心机购自美国Eppendorf公司、多功能酶标仪购自美国ThermoScientific公司、细菌培养摇床购自ShakerIncubator公司，细菌培养箱购自Bluepard公司、倒置荧光显微镜购自Nikon公司。

1.2方法：

1.2.1多肽的合成

设计多肽，以抗菌肽Ponericin-W1后半部分KLLPSVVGLFKKKKQ序列为模板，将亲水部分换为K，亲油部分换为V，L，I，F中的一种或多种，增加正电荷数量等方法设计出了新的抗菌肽，由上海生工采用标准的Fmoc固相合成方案合成的。合成的多肽纯度≥96％，并对多肽进行液相色谱以及质谱鉴定。设计得到的氨基酸序列为：

1.2.2二级结构检测

将多肽At10溶于H₂O、25mM SDS、0.25mg/mL DPPC以及0.25mg/mL DPPG溶液中，配制成一定浓度的多肽溶液进行圆二色谱测量。在室温下进行CD广谱测定，圆二色谱石英样品池的光程为0.1cm，扫描测定波长范围为190-260nm，每个样品扫描3次平均值。

At3和At5的检测方法与At10相同。

1.2.3菌种复苏

将各菌株分别划线接种于YM固体培养基上，倒置37℃培养并传代两次。

1.2.4最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

MIC和MBC的测定参照CLSI的标准方法进行。挑取单菌落接种于液体培养基中，37℃培养24h。用液体培养基调整菌数为5×10³CFU/mL，在96孔板上分别加入100μL不同浓度(0.8μM-50μM)的多肽At10，每孔加入100μL稀释好的菌液，设置至少三组重复，氟康挫(FLC)作为阳性对照，不加药的孔作为阴性对照。将96孔板置于37℃摇床中孵育24h，转速为160rpm，观察孔内液体的浑浊情况，以能够完全抑制细菌生长的最低肽浓度作为MIC值。MBC的方法参照MIC的实验方法，用0.9％生理盐水调整菌浓度为5×10³CFU/mL，在96孔板上分别加入100μL不同浓度的多肽At10，每孔加入100μL稀释好的菌液，设置至少三组重复，氟康挫(FLC)作为阳性对照，不加药的孔作为阴性对照。将96孔板置于37℃摇床中孵育2h，转速为160rpm。从96孔板中每孔取40μL样液于YM固体培养基中涂布生长，24h后观察生长情况。

At3和At5的检测方法与At10相同。

1.2.5细胞毒性实验

采用对数生长期的Hff1细胞(人皮肤成纤维细胞)，用含10％胎牛血清的培养基调节细胞浓度为1×10⁴cell/孔，接种到96孔板中。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育24h后，加入不同浓度的多肽At10，每种多肽浓度设6个复孔，给药24h。采用MTT法测定570nm波长下的吸光度。

At3和At5的检测方法与At10相同。

1.2.6溶血活性实验

采取志愿者的新鲜血液，加入抗凝肝素。将血液转移到离心管中，以3000rpm的速度离心3min，弃去上层血清，下层沉淀为红细胞，为防止红细胞混合后自发产生溶血，红细胞沉淀需用等量的PBS溶液反复漂洗离心至少3次，将其中残余的血清全部除去。漂洗后的红细胞用PBS溶液稀释至8％(v/v)后分装到无菌的96孔板中，每孔100μL。PBS配制一系列2倍稀释梯度的多肽溶液，加入已分装好红细胞的培养板中，每孔100μL。用100μLPBS代替多肽溶液的反应孔作为阴性对照组，以100μL 0.1％Triton X-100溶液替代多肽溶液的反应孔作为完全溶血的阳性对照组，37℃孵育1h。反应结束后，将96孔板以3000rpm离心3min后，每孔取上清100μL至新的96孔板中，通过酶标仪检测540nm处的吸光度。溶血率(％)＝(Abs_肽-Abs_PBS)/(Abs_{0.1％Triton X-100}-Abs_肽)×100％

1.2.7耐药性实验

方法同1.2.3MIC实验，除第一代菌液是未处理的白色念珠菌(ATCC 10231)，其余每一代菌液经1×MIC肽浓度处理。

1.2.8 SEM实验

用对数生长期的白色念珠菌制备含0.9％生理盐水的菌溶液(浓度为1×10⁶CFU/mL)，并以1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC的抗菌肽作为实验组，使用无肽的菌溶液作为对照组。将100μL菌溶液添加到100μL肽中，摇床37℃孵育2h，然后取出。以8000r/min的速度离心3分钟以收集菌沉淀，PBS缓冲液洗涤3次。将洗净的菌溶液滴到准备好的5mm×5mm玻璃板上，干燥后，将含有菌沉淀物的玻璃板浸泡在2.5％戊二醛溶液里1h(事先将玻璃板在聚赖氨酸溶液中浸泡10min)，PBS再洗涤3次。然后依次用30％，50％，75％，85％，95％和100％乙醇脱水5min，然后干燥以备后用。离子溅射仪喷涂金，并使用扫描电子显微镜进行测试。

1.2.9 Live/Dead染色实验

用与1.2.8相同的方法制备菌溶液。肽处理的溶液用PBS洗涤3次，然后用SYTO-9/PI双染染料染色30min(SYTO-9＝1/5PI)。用PBS将未结合的染料洗去，最后加入DAPI染料染色溶液30min(DAPI＝1/2PI)，用PBS洗涤三次。将其置于激光共聚焦显微镜下观察死亡情况。在实验中，SYTO-9和PI的激发波长为488nm，而SYTO-9的发射波长为495-530nm，PI为590-645nm，DAPI的发射波长为454nm，激发波长为364nm。

2.结果

2.1多肽的性质

多肽At10的分子量为1861.56Da，纯度为96.99％，电荷数为+7。

多肽At3的分子量为1867.43Da，纯度为97.45％，电荷数为+7。

多肽At5的分子量为1861.47Da，纯度为99.47％，电荷数为+7。

2.2多肽的二级结构

我们已知，α-螺旋构象的圆二色谱图在192nm处有一个正峰，在208nm和222nm处有两个负峰；β-折叠构象的圆二色谱图在195nm处有一个正峰，在217-218nm处有一个负峰；无规卷曲构象的圆二色谱图在197nm附近有一个负峰，在217nm处有一个小而宽的正峰。At10的圆二色谱结果显示，At10在H₂O和DPPC中呈现无规卷曲，在SDS和DPPG中呈现α-螺旋。结果如图4所示。

At3在H2O和DPPC中呈现无规卷曲，在SDS和DPPG中呈现α-螺旋；

At5在H₂O和DPPC中呈现无规卷曲，在SDS和DPPG中呈现α-螺旋。

2.3 MIC和MBC的测定

MIC的测定结果如图5所示，多肽At10、At3、At5对白色念珠菌(ATCC 10231)有很好的抑制作用，对临床菌的抑制作用也非常显著。其中At10对白色念珠菌的最小抑菌浓度为3.2μM。At3对白色念珠菌的最小抑菌浓度为3.2μM；At5对白色念珠菌的最小抑菌浓度为3.2μM。

MBC的测定结果如图6所示，多肽At10、At3、At5对白色念珠菌(ATCC 10231)有很好的杀灭作用。其中At10对白色念珠菌的最小杀菌浓度MBC值为6.3μM。At3对白色念珠菌的最小杀菌浓度MBC值为50μM；At5对白色念珠菌的最小杀菌浓度MBC值为6.3μM。

2.4多肽At10对细胞Hff1的毒性实验

图7为多肽At10对细胞Hff1的毒性实验，如图所示，多肽At10在MIC浓度下表现出低毒性。

2.5多肽At10的溶血活性实验

图8为多肽At10的溶血活性，如图所示，多肽At10表现为低溶血活性。

2.6多肽At10处理白色念珠菌(ATCC 10231)的耐药性实验

图9为多肽At10处理白色念珠菌(ATCC 10231)的耐药性实验图，白色念珠菌(ATCC10231)经20代处理与诱导后，仍不易产生耐药性。

2.7多肽At10处理白色念珠菌(ATCC 10231)后的SEM实验

图10为多肽At10处理白色念珠菌(ATCC 10231)后的SEM图，分别用1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC浓度的多肽At10处理菌液2h，可以看出白色念珠菌(ATCC 10231)有不同程度的受损情况。

2.8多肽At10处理白色念珠菌(ATCC 10231)后的Live/Dead染色实验

图11为多肽At10处理白色念珠菌(ATCC 10231)后的Live/Dead染色图，分别用1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC浓度的多肽At10处理菌液2h，经PBS清洗至少3次，以去除残余的多肽At10，用适当浓度的SYTO-9/PI双染染料处理样液30min后，PBS清洗至少3次，用适当浓度的DAPI染料处理30min后，PBS清洗至少3次，PBS悬浮样液，倒置荧光拍照。如图10所示，随着多肽At10浓度的增加，白色念珠菌(ATCC 10231)的死亡数量呈现梯度上升。

序列表

<110> 常州大学

<120> 一类抗真菌肽及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Lys Leu Leu Lys Lys Val Val Lys Leu Phe Lys Lys Leu Leu Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Ile Lys Lys Ile Ile Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys Lys Ile

1 5 10 15

Claims

1.一类抗真菌肽的应用，其特征在于：抗真菌肽用于制备抗真菌药物中的应用；其中真菌为临床上的白色念珠菌，热带念珠菌，葡萄牙念珠菌中的一种或多种；

所述抗真菌肽具有如下氨基酸序列中的一种：At3：KLLKKVVKLFKKLLK；At5：KIIKKIIKIIKKIIK；At10：IKKIIKIIKKIIKKI。