KR102168811B1 - 키조개로부터 분리한 항균 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키조개의 완전히 식별된 아미노산 서열로부터 분리되어 그람-양성균 및 그람-음성균에 대해서 강력한 항균 활성을 나타내는 항균 펩타이드를 제공한다.

Description

키조개로부터 분리한 항균 펩타이드 및 그의 용도{Antimicrobial peptide derived from pen shell, Atrina pectinata and uses thereof}

본 발명은 키조개로부터 분리한 항균 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 키조개로부터 분리한 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

해양 무척추 동물(marine invertebrates), 특히 홍합, 굴, 전복, 키조개(pen shell)와 같은 필터 공급 방법을 사용하는 저서 생물(benthic species)은 미생물이 풍부한 수질 환경에서 살며 병원성 미생물에 의한 감염에 지속적으로 노출된다. 따라서 효과적인 방어 시스템이 필요한데 일반적으로 해양 무척추 동물은 감염으로부터 효과적으로 보호하기 위해 체액성 및 세포성 면역으로 구성된 타고난 면역 체계(immune system)를 가지고 있다. 세포 면역(cellular immunity)은 식세포작용(phagocytosis), 캡슐화(encapsulation), 호흡 버스트(respiratory burst)를 통해 면역 세포(예: 혈구)에 의해 매개되는 반면, 체액성 면역(humoral immunity)은 렉틴(lectin), 응집소(agglutinins), 항균 단백질/펩타이드(AMPs) 및 리소좀성 효소를 포함하는 혈장의 여러 용해된 인자에 의해 매개된다. 이러한 타고난 방어 체계 중에서 펩타이드 및 작은 단백질을 포함한 항균 폴리펩타이드(AMPPs)가 선천성 면역에 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있다. AMPPs는 상이한 유전자에 의해 코딩되는 10 내지 50 개의 아미노산 잔기로 구성되고 양친매성(amphipathic properties)을 지닌 α-helix 또는 β-sheet 폴딩 구조를 형성하며 광범위한 항균 활성을 갖는데(A.A. Bahar. et al., Pharmaceuticals. 6: 1543-1575, 2013) 멤브레인 교란(perturbation) 또는 기공 형성(pore formation)을 유발함으로써 미생물의 사멸을 유도한다.

현재까지 키조개(Atrina pectinate)로부터 분리된 AMP는 KPS-1만이 단백질 수준에서 확인되었다(대한민국 공개특허 제2012-0134501호). 따라서 키조개의 면역 방어 기작이나 숙주가 병원균의 수준을 조절할 수 있는 방법에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 펩타이드의 분리 시 수율이 높지 않아 충분한 항균활성을 나타내지 않고 잠재적인 독성 등의 요인으로 균일한 효과를 기대하기 어렵다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 다양한 지표균주에 대해 우수한 항균 활성을 나타내는 키조개의 완전히 식별된 아미노산 서열로부터 분리한 항균 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고 항균활성을 나타내는 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 벡터인, 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨, 형질전환 숙주세포가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 사료 첨가제가 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 그람-양성균 및 그람-음성균에 대해서 강력한 항균 활성을 나타내는 키조개의 완전히 식별된 아미노산 서열로부터 분리한 항균 펩타이드의 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1a는 본 발명의 산성화 조 추출물의 항균 및 용혈 활성을 분석한 것으로 E. coli D31 및 B. subtilis KCTC1021에 대한 산성화 아가미 및 외투막 추출물의 항균 활성 및 트립신 처리를 관찰한 사진이다.
도 1b는 본 발명의 산성화 조 추출물의 항균 및 용혈 활성을 분석한 것으로 산성화 아가미 추출물에 의한 적혈구(혈액형, O)의 용혈을 분석한 그래프이다. Piscidin 1을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 산성화 아가미 추출물의 Acid-urea PAGE/버그-블랏 분석을 수행한 겔 사진 및 E. coli D31에 대한 산성화 추출물의 버그-블랏 분석 사진이다. 산성화 추출물의 Acidurea PAGE(왼쪽)를 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250로 염색하였다.
레인 1, 분자량 마커:
3 mg 인간 히스톤 H1(~ 21.0 kDa), 2.0 mg 리소자임(~ 11.0 kDa), 2.0 mg 아프로 티닌(~ 6.5 kDa) 및 1.0 mg 피시딘 1(~ 2.5 kDa);
레인 2, 산성화 아가미 추출물 20 mL; 및
레인 3, 산성화 외투막 추출물 20 mL.
도 3은 아세토니트릴 농도가 다른 0.1% TFA로 용출한 후 Sep-Pak C18 카트리지에서 추출한 추출물의 항균 활성을 분석한 사진이다. 가장 강력한 항균 활성은 60% 아세토니트릴 분획에서 검출되었다.
FT, 플로우 스루;
DW, 증류수;
10 A, 10% 아세토 니트릴 분획;
60 A, 60% 아세토 니트릴 분획;
100 A, 100% 아세토 니트릴 분획; 및
스케일 바 = 5mm.
도 4a는 본 발명의 산성화 아가미 추출물에서 항균 펩티드의 정제를 나타내는 그래프로 항균 활성을 갖는 Sep-Pak 분획(60% 아세토니트릴 용출액)을 CapCell-Pak C18 역상 HPLC 컬럼에 로딩하였다. 용출은 0.1% TFA 중 5 내지 65% ACN의 선형 구배로 60분 동안 1 mL/분의 유속으로 수행하였다. 용출액을 220 nm에서 모니터링하였고 활성 피크는 18% ACN에서 용출되었다(화살표).
도 4b는 본 발명의 산성화 아가미 추출물에서 항균 펩티드의 정제를 나타내는 그래프로 활성 분획을 모아 양이온 교환 컬럼(TSK-Gel SP-5PW)에 적용하였다. 용출은 완충액 A(10 mM PB, pH 6.0) 및 완충액 B(10 mM PB 중 1.0M NaCl, pH 6.0)의 선형 구배로 0.0 내지 1.0M NaCl에서 100분간 이어서 완충액 B로 20분 동안 유속 1 mL/min. 용출액을 220 nm에서 모니터링하였다. 0.82M NaCl에서 용출된 분획(화살표)은 B. subtilis KCTC1021에 대한 항균 활성을 나타냈다.
도 4c는 본 발명의 산성화 아가미 추출물에서 항균 펩티드의 정제를 나타내는 그래프로 B. subtilis KCTC1021에 대한 정제된 펩타이드의 최종 정제 및 항균 활성을 나타낸다. 상기 펩타이드는 0.1% TFA 중 5 내지 65% ACN의 선형 구배를 사용하여 1 mL/분의 유속에서 60분 동안 220 nm에서 모니터링하면서 CapCell-Pak C18 컬럼상에서 정제하였다.
도 5는 URDA를 이용한 B. subtilis KCTC1021, E. coli D31 및 C. albicans에 대한 정제된 펩타이드의 항균 활성을 분석한 사진이다.
도 6a는 본 발명의 정제된 폴리펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열의 결정을 나타내는 것으로 선형 모드의 Ultraflex Ⅲ MALDI time-of-flight (TOF)/TOF 질량 분석기를 사용하여 정제된 펩타이드의 분자량을 측정한 그래프이다. 상기 폴리펩타이드는 sinapinic 2,5-dihydroxybenzoic acid(DBA) 매트릭스 용액(0.1% TFA/50 % CH₃CN 중 10 mg/mL DBA)과 혼합된 0.1% TFA/50% CH₃CN(1:1, v/v)로 용해하였고, MALDI 플레이트 상에 직접 로딩하였다. 질량 스펙트럼에서 일가이온 종(5631.1)과 이가이온 종(2815.8)으로 나와 총 분자량 5631.1 Da으로 확인되었다.
도 6b는 본 발명의 정제된 폴리펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열의 결정을 나타내는 것으로 본 발명의 정제된 펩타이드의 부분 아미노산 서열(1 내지 50)을 펄스 액체 자동 시퀀서(pulse liquid automatic sequencer) 상의 자동 에드만 분해(automated Edman degradation)로 분석하였다.
도 7은 cgMolluscidin 및 hdMolluscidin을 갖는 아미노산 서열의 정렬을 나타낸 그림으로 보존된 아미노산은 검은색 박스로 표시된다.
도 8은 본 발명의 apMolluscidin의 cDNA 및 완전한 아미노산 서열을 나타내는 그림으로 전장 apMolluscidin cDNA는 82 bp의 5'-UTR, 547 bp의 3'-UTR 및 Met를 포함하는 60개의 아미노산을 코딩하는 183 bp의 코딩 서열을 포함하는 812 bp를 포함하였다. 에드만 분해(Edman degradation)에 의해 수득된 정제된 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산 서열을 실선으로 도시하였고 폴리(A) + 신호(AATAAA) 및 두 개의 ATTTA 모티프(motif)를 굵게 표시하였다.
도 9는 본 발명의 apMolluscidin mRNA의 조직 특이적 발현을 분석한 그래프로 mRNA는 아가미, 외투막, 입술수염, 알, 간췌장, 사이펀 및 생식선을 비롯한 조직에서 구성적으로 발현되었다. apMolluscidin의 모든 3회 반복 Ct 값은 18S rRNA Ct 값으로 표준화되었고 수직 막대는 평균 ㅁ SD(n = 3)를 나타낸다.
도 10a는 apMolluscidin의 2차 구조 및 Schiffer-Edmunson helical wheel projection 분석 결과를 나타낸 그림으로 구조 예측은 Expasy 도구 서버의 GOR을 사용하여 수행되었고 H, E, T 및 C는 알파 헬릭스(alpha helix), 시트(sheet), 턴(turn) 및 랜덤 콜리(random coli) 이차 구조를 각각 나타낸다.
도 10b는 Schifer-Edmunson helical wheel projection 분석을 수행한 그림으로 apMolluscidin의 2차 구조에서 소수성 및 친수성 영역을 예측하는데도 사용되었다. 친수성 잔기(hydrophilic residues)는 직사각형 또는 8 각형 상자에 표시되고 apMolluscidin의 플롯은 비정렬(non-ordered) 또는 비-양친 매성(non-amphipathic ) 형태를 보였다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "AMPs(antimicrobial peptides)"는 항미생물성 펩타이드로, 다음의 특성이 알려져 있다. 지구상에 있는 수많은 생물체는 그들이 처해진 환경으로부터 스스로를 보호할 수 있는 면역체계를 가지고 있어 병원성 미생물에 대하여 그들 스스로를 보호하기 위해 생산하는 항균활성을 가지는 일차방어수단의 다양한 생리활성물질로 선천면역반응에 중요한 역할을 하며, 천연의 항생제로써 포유류에서 곤충, 식물까지 지구상 거의 모든 생물체에 존재한다고 보고되어있다(Zasloff, Nature 415: 389-395, 2002). 항균 펩타이드는 1962년 개구리(Bombina variegate)의 표피 분비액에서 처음으로 발견되었으며(Kiss and Michl, Toxicon 1:33-39, 1962; Monatshefte fㆌr Chemie-Chemical Monthly, 101:182-189, 1970), 1971년 벌의 독소(bee venom) 등 여러 생물들로부터 다양한 항균 펩타이드가 동정되기 시작하여 그 후 특성 및 기능에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 지금까지 항균 펩타이드의 작용 기작 가설 중 가장 타당성 있게 제시되고 있는 것은 Shai-Matsuzaki-Huang(SMH) 모델로써, 체내에서 합성된 펩타이드는 소수성과 친수성의 부분으로 적당한 구조를 이루게 되고 양전하를 띤 친수성 부분이 음전하를 띤 박테리아의 세포막과 결합하게 된다(Matsuzaki, Biochimica et Biophysica Acta 1462:1-10. 1999; Shai,Biochimica et Biophysica Acta, 1462: 55-70, 1999; Huang, Biochemistry 39: 8347-8352, 2000; Yang et al., Biophysical Journal, 79: 2002-2009, 2000). 이 때 펩타이드와 세포막의 결합력은 일반적인 Ca²⁺, Mg²⁺ 등에 비해 약 2-3배 더 강한 것으로 알려져 있다. 그 후 세포막과 결합된 펩타이드의 소수성 부분이 세포막 인지질의 소수성 부분과 상호작용하며 구멍을 형성하게 되어 세포막의 투과도를 변화시키게 되고 결국 세포를 파괴시킨다(Christensen et al.,Proceeding of the National Academy of Sciences, 85:5072-5076. 1988).

본 문서에서 사용되는 용어 "키조개(Atrina pectinata)"는 단백질과 글리코겐이 풍부하고 지질과 수분함량이 낮아 쇠고기에 비하여 성인병을 유발할 가능성이 낮고, 베타인(betaine)류 특히, 베타-알라민베타인(β-alaminebetaine)이 풍부하게 포함되어 있는 것으로 알려져 있어, 성인병이나 대사질환의 예방효과가 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 필수 아미노산과 철분이 풍부하여 동맥경화와 빈혈 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 맛의 척도로 사용되고 있는 엑스분 질소 함량을 기준으로 보면, 소라, 백합, 바지락 및 굴보다 풍부하여, 풍미가 더 우수한 것으로 보고되어 있다. 특히, 폐각근(관자, 패주, 육주 또는 개아지살이라고 칭함)은 인기가 많아 조리식품의 소재로 국내는 물론 해외에서도 안정적인 소비수요를 갖고 있다.

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고 항균활성을 나타내는 펩타이드가 제공된다.

상기 펩타이드에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 내에서 선택되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

상기 항균 조성물에 있어서, 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대한 항균활성을 가질 수 있고 상기 그람 양성균은 B. cereus, B. subtilis, S. mutans, S. iniae, S. aureus, L. garvieae, S. vestibularis, E. faecalis, 또는 S. parauberis일 수 있으며 상기 그람 음성균은 E. coli, E. cloacae, P. aeruginosa, V. alginoalyticus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. harveyi, K. pneumoniae, E. tarda, P. mirabilis, P. stuartii 또는 S. typhimurium일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 벡터인, 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨, 형질전환 숙주세포가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항균 사료 첨가제가 제공된다.

본 발명의 항균 펩타이드의 유효량은 환자의 환부의 종류,적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01㎍/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

본 발명의 항균 펩타이드는, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15^th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

일반적으로 키조개(A. pectinate)는 Pinnidae 과에 속하는 여과 섭식(filter-feeding) 해양 쌍각 조개 연체동물로서, 남동 아프리카에서 말레이시아, 뉴질랜드, 일본 북쪽 및 뉴 사우스 웨일즈(New South Wales) 남쪽까지 인도-태평양 지역에 널리 분포한다. 또한 단백질과 글리코겐이 풍부하고 지질과 수분함량이 낮아 쇠고기에 비하여 성인병을 유발할 가능성이 작고, 베타인(betaine)류 특히, 베타-알리민베타인(β-alaminebetaine)이 풍부하게 포함되어 있는 것으로 알려져 있어, 오히려 성인병이나 대사질환의 예방효과가 있는 것으로 보고되어 있다.

키조개는 한국을 포함한 여러 아시아 국가에 풍부하게 분포하고 상업적으로 중요한 해산물이나 최근 몇 년 동안 남획, 연안 지역 개발로 인한 서식지 손실, 오염 및 일본의 대량 살상과 관련되어 있는 바이러스성 입자인 병원성 감염과 같은 다른 요인들로 인해 그 생산량은 최근 몇 년 동안 감소하였다(Y. Maeno et al., Dis. Aquat. Org. 71: 169-173, 2006). 상업 양식 시장에서 키조개의 중요성에도 불구하고, 몇몇 연구는 인구 생태학, 초기 생장 단계, 종자 생산, 어업 및 양식에 초점을 맞추고 있을 뿐(Fisheries information service, http://www.fips.go.kr), 병원체 감염 시 면역계에 대한 연구는 여전히 미미하다.

이에 본 발명자들은 양이온(cation) 교환 및 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 키조개(A. pectinata)의 산성화된 아가미 추출물로부터 5.6 kDa 항균 펩타이드(이하, 'AMP'로 약칭함)를 정제하였다. 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 분자량을 다른 공지의 AMP와 비교한 결과 cgMolluscidin 또는 hdMolluscidin과 높은 서열 상동성을 나타내어 본 발명의 항균 펩타이드를 apMolluscidin으로 명명하였다. 상기 apMolluscidin은 몇 개의 이염기 잔기 반복(dibasic residue repeats) 및 Lys-Lys 및 Lys-Gly와 같은 서열 반복을 포함하는 59 아미노산 잔기로 구성되어 있고 Bacillus subtilis(최소 유효 농도 [MEC], 2.1 μg/ mL)를 포함하는 그람 양성균 및 용혈 활성이 없는 E. coli D31(MEC, 0.5 μg/mL)을 포함한 그람 음성균에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었다. 또한 이차 구조 예측을 통해 두 개의 나선형 영역(two helical regions)을 형성하고 양친매성 구조(amphipathic structure)를 가질 수 있음을 확인하였다. 전장 apMolluscidin cDNA는 82 bp의 5'- 비번역 영역(UTR), 547 bp의 3'-UTR 및 60개 아미노산을 코딩하는 183 bp의 코딩 서열을 포함하는 812 염기 쌍(bp)을 포함하였다(Met 포함). 또한 qPCR 분석을 통해 apMolluscidin mRNA로부터 번역된 성숙한 펩타이드가 아가미 및 사이펀과 같은 위치에서 조직 특이적인 방식으로 발현된다는 것을 밝혀냈다. 상기 결과는 apMolluscidin이 전복의 선천적 면역 방어 시스템과 관련이 있고 박테리아 막(bacterial membrane)에 직접 작용하지 않을 수 있음을 확인하였으며 키조개의 완전히 식별된 아미노산 서열로부터 분리한 우수한 항균활성을 갖는 최초의 AMP임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 조직 추출

본 발명에서 사용된 껍질 길이 9.0 ~ 10.0 cm의 키조개는 2015년 5월 한국 서천군에서 입수하였고 상기 키조개를 연구실로 이송 후에 껍질을 물로 세척하였으며 조직 추출에 사용했다. 아가미(gill) 및 외투막(mantle) 조직을 모아 습식 얼음 상에서 멸균된 폴리프로필렌에 보관하였다. 그 후 아가미 또는 외투막 조직을 16 mL의 예열된 1% 초산(HAc)을 포함하는 50 mL 비커에 첨가하였다. 그 후 상기 조직을 즉시 5분간 끓이고 습식 얼음으로 식힌 다음 습식 얼음으로 2분간 균질화하였다(속도 # 4, Polytron PT1200C 균질기; Kinematica AG, Luzern, Switzerland). 그 후, 상기 샘플을 4℃에서 20분간 8000 rpm으로 원심분리하였고 상층액을 모은 후(총 13 mL), 사용할 때까지 ~ 70℃에 보관하였다.

실시예 2: 단백질 분해 소화

본 발명자들은 상기 실시예 1에 수득한 조 추출물의 단백질 분해 소화(proteolytic digestion) 분석을 수행하였다. 먼저 조 아가미 또는 외투막 추출물의 단백질 분해 소화에 대한 감수성은 250 μg/mL 결정성 트립신(Fisher Scientific, Fairlawn, NJ)과 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하여 결정하였다.

실시예 3: 초 고감도 방사형 확산 분석(URDA)

본 발명자들은 상기 조 추출물의 항균 활성 측정을 위해 초 고감도 방사형 확산 분석(URDA)을 사용하여 그람 양성균인 B. subtilis KCTC1021, 그람 음성균인 E. coli D31 및 효모인 Candida albicans KCTC7965에 대해서 프로테아제 처리 전후에 시험하였다. 구체적으로 상기 모든 균주는 trypticase soy broth(이하, 'TSB'로 약칭함) 또는 Sabouraud dextrose broth(이하, 'SDB'로 약칭함)에서 37℃의 조건으로 18시간 동안 성장시켰고 밤새 배양 후 박테리아 및 C. albicans 현탁액을 적절한 배지를 사용하여 C. albicans는 ∼10⁶ CFU/mL 및 박테리아는 ~ 10⁸ CFU/mL에 해당하는 McFarland 혼탁도 표준인 0.5(Vitek Colorimeter # 52-1210, HAC, Loveland, CO, USA)로 희석하였다. 이어서 5×10⁶ CFU/mL를 함유하는 박테리아 현탁액 또는 5×10⁴ CFU/mL을 함유하는 C. albicans 현탁액을 희석한 총 500 μL를 0.03% TSB 또는 0.03% SDB 및 1% 타입 I(저 EEO) 아가로스를 갖는 10 mM 인산 완충액(PB)(pH 6.6) 중 9.5 mL 언더레이 겔(underlay gel)에 첨가하였다. 그 후 아가미 추출물 또는 정제된 펩타이드를 5 ㎕의 산성화된 수용액(조 추출물 및 정제된 펩타이드에 대한 1% 및 0.01% HAc)에 용해시키고, 1 mm 두께의 언더레이 겔을 포함한 2.5 mm 직경의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 3시간 인큐베이션한 후, 박테리아 또는 효모 현탁액을 1% 아가로스 중 10 mM PB(pH 6.6)를 갖는 6% TSB 또는 6% SDB를 함유하는 10 mL 이중-강도 오버레이 겔로 중첩시켰다. 상기 플레이트를 추가로 18~24시간 동안 배양하였고 투명 존 직경(clearing zone diameter)을 측정하였다. 또한 양성 대조군으로 E.J. Noga 교수(North Carolina State University, Raleigh, NC, USA)가 제공한 하이브리드 줄무늬 농어(hybrid striped bass, Morone saxatilis×M. chrysops)유래 α-helical AMP인 피시딘 1을 사용하였다(E.J. Noga et al., Nature. 414: 268-269, 2001).

실시예 4: 용혈 활성 분석

본 발명자들은 인간 적혈구(RBC, 혈액형 O)를 사용하여 본 발명의 추출물 또는 정제 펩타이드의 용혈 활성을 분석하였다. 먼저 적혈구(RBCs)를 3000 x g에서 5분간 원심분리하여 구연산(citric acid) 처리한 혈액으로부터 채취한 후 150 mM NaCl이 함유된 10 mM PB(pH 7.4)로 3회 세척하였고 혈장과 연층(buffy coat)을 제거하였다. 그 후, 상기 펩타이드를 처리 또는 처리하지 않은 완충액에서 3% 헤마토크리트(hematocrit)의 현탁액을 37℃에서 60분간 배양하였고 용혈은 3000×g로 5분간 원심분리 한 후 542 nm에서 상층액의 흡광도로부터 수득한 헤모글로빈 함량으로 측정하였다. 0.1% Triton X-100을 첨가한 후 헤모글로빈(hemoglobin) 방출을 측정하여 100% 용혈 값을 결정하였고 상기 펩타이드의 용혈 백분율은 하기의 수식을 사용하여 계산하였고 용혈 분석을 3회 수행한 후 결과를 평균하였다:

용혈 % = ([펩타이드 용액의 Abs _542nm-완충액의 Abs _542nm)/(0.1% 트리톤 X100의 Abs _542nm-완충액의 Abs _542nm])× 100.

실시예 5: 전기영동 및 겔 오버레이 분석

본 발명자들은 본 발명의 조 추출물 조성 또는 염기성 단백질성 항생제(basic proteinaceous antibiotics)의 존재를 모니터링하기 위해 산성-우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔 오버레이 분석(bug-blot)을 수행하였다. 먼저, 겔(100 mm 폭 × 75 mm 길이 × 1.0 mm 두께)은 12% 아크릴아미드 37.5/1 (w/w) 아크릴아미드/비스 용액(bis solution), 4.8 M 우레아, 5% HAc, 0.48%(v/v) N, N, N, N-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 및 0.22% (w/v) 과항산암모늄(APS)으로 제조하였다. 그 후 상기 겔을 실온에서 밤새 중합하였고 Mini PROTEAN Ⅱ Electrophoresis Cell(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)를 사용하여 역 극성(하부 챔버 음극)으로 100V에서 60분 동안 5% HAc로 겔을 사전 작동(pre-running)시킴으로써 APS 및 TEMED를 제거 하였으며 스태킹 겔(stacking gel)은 사용하지 않았다. 샘플(20 μL)은 시료 용액(추적 염료(tracking dye)로 메틸 그린을 함유하는 5% HAc 중 3.0 M 요소 20 μL)과 혼합(1:1)한 다음 명백한 분자량 및 순도를 평가하기 위해 중복 겔(duplicate gels)에 로딩하였고 실온에서 60분 동안 100V에서 5% HAc로 전기영동하여 항균활성을 비교하였다. 전기영동 후, 하나의 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염료로 염색하고 항균 밴드를 비교하기 위해 MeOH:HAc:H₂O(4:1:5)로 옮겼다. 다른 겔을 100 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에서 2회 세척하였다(각각 12 및 10분 동안). 그런 다음 상기 겔을 RDA 절차에 대해 상술한 바와 같이 준비한 E. coli D31 박테리아 플레이트에 놓고 37℃에서 3시간 동안 배양하여 상기 펩타이드가 아가로스로 확산되도록 하였다(D. Hultmart et al., Eur. J. Biochem. 127: 207-217, 1982). 그 후 박테리아 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였고(18 ~ 20 시간) 항균 활성을 포함하는 기본 단백질성 밴드에 의해 박테리아 성장이 억제된 투명 영역(clear zones)을 관찰하였다.

실시예 6: 항균 폴리펩타이드 정제

본 발명자들은 항균 폴리펩타이드 정제를 위해 1% HAc에 현탁된 조 추출물(20 mL)을 0.1% TFA(v/v)를 포함하는 아세토니트릴 20 mL에서 미리 평형시킨 Sep-Pak Vac C18 카트리지(10 g, 125A, 100 μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA)에 적용하였다. 현탁액을 로딩한 후, 상기 카트리지를 0.1% TFA(v/v)를 함유하는 H₂O 20 mL로 세척한 후, 0.1% TFA(v/v)를 함유하는 10%, 60% 및 100% 아세토니트릴 20 mL의 순차적 첨가로 용출하였다. 각각의 용출액을 모으고, 진공(스피드 진공 농축기)하에서 증발시켰고, Bacillus subtilis KCTC1021에 대한 항균 활성을 URDA를 이용하여 분석하였다. 항균활성을 갖는 Sep-Pak 분획물(60% 아세토니트릴 용출액)을 증발시킨 후, 0.01% HAc 1.0 mL에 현탁시켰으며, CapCell-Pak C18 역상 컬럼(5 ㎛, 300 Å, 4.6x250 mm) 상에 로딩하였다. 그 후 60% 아세토니트릴 용출액을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 중 5 내지 65% 아세토니트릴(CH₃CN)의 선형 구배(linear gradient)로 60분 동안 1 mL/분의 유속으로 용출시켰고 상기 용출액을 220 nm에서 모니터링하였다. 또한 분획을 수거하여 진공하에 건조시켰고, 0.01% HAc에 용해시켰으며 URDA를 사용하여 B. subtilis KCTC1021에 대한 항균 활성을 시험하였다. 그 후 활성 피크(activity peaks)를 모아서 10 mM PB(pH 6.0)로 평형화시킨 TSK-Gel SP-5PW HPLC 컬럼(7.5×75mm, Tosoh, Tokyo, Japan)에 로딩하였다. 분리는 완충액 A(10 mM PB, pH 6.0) 및 완충액 B(10 mM PB 중 1.0M NaCl, pH 6.0)의 선형 구배를 사용하여 1 mL/분의 유속으로 100분 동안 1.0M NaCl로 부터 측정하였고 220 nm로 모니터링하였다. 활성 피크(activity peak)는 CapCell-Pak C18 역상 컬럼(5 μm, 300A, 4.6 x 250 mm)을 사용하여 균질성으로 최종적으로 정제하였고 샘플을 0.1% TFA 중의 5 내지 45 % CH₃CN의 선형 구배로 40분 동안 1 mL/분의 유속으로 용출시킨 후, 상기 용출액을 220 nm에서 모니터링하였다. 상기 정제된 펩타이드를 수작업으로 수거한 후, 진공하에 건조시키고, 0.01% HAc에 용해시킨 다음, URDA를 사용하여 B. subtilis KCTC 1021, E. coli D31 및 C. albicans에 대한 항균 활성을 측정하였다.

실시예 7: 분자량 분석 및 아미노산 시퀀싱

본 발명자들은 상기 정제된 펩타이드의 분자량을 선형 모드(Bruker, Hamburg, Germany)의 Ultraflex Ⅲ MALDI time-of-flight(TOF)/TOF 질량 분석기를 사용하여 결정하였다. 상기 폴리펩타이드는 sinapinic 2,5-dihydroxybenzoic acid (DBA) 매트릭스 용액(0.1% TFA/50% CH₃CN 중 10 mg/mL DBA, 1:1, v/v)과 혼합된 0.1% TFA/ 50% CH₃CN(1:1, v/v)로 세척하였고, MALDI 플레이트 상에 직접 적재하였다. 상기 정제된 펩타이드의 아미노산 서열(1 내지 50)을 펄스 액체 자동 시퀀서 (Model 473A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)에서 자동 Edman 분해를 사용하여 분석하였다.

실시예 8: 정제된 폴리펩티드의 cDNA 클로닝

본 발명의 정제된 펩티드 전구체의 전장 서열을 클로닝하기 위해 제조사의 지침에 따라 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 아가미로 부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA는 Advantage RT-for-PCR kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 합성하였고 Edman 분해(NH_2-AAAKGKGKKGAAKGAGDSPAKKATKAKKPASKGVKKAGKG-OH: 서열번호 1)에 의해 수득한 정제된 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 부분적인 N-말단 아미노산 서열에 기반하였으며 퇴행 올리고 뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 5 내지 10)는 분리한 AMPs의 40 아미노산 말단에 기반하여 디자인하였다. 아가미 및 게놈 DNA의 첫 stranded cDNA는 degenerating PCR을 위한 주형으로 하기와 같은 조건에서 사용되었다: 94℃에서 5분간 이어서 94℃에서 30초간 30 사이클, 42℃ 내지 58℃로 30초간, 72℃에서 1분간, 72℃에서 10분간 최종 신장. 그 후, 생성물을 pGEM-T Easy Vector(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝하였고 ABI 3130 Automatic DNA Sequencer(Applied Biosystems)를 사용하여 서열을 결정하였다. 또한 키조개의 apMolluscidin cDNA의 5' 및 3' 말단을 증폭하기 위해 제조사의 지침에 따라 SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)를 사용하여 cDNA 말단(RACE)의 5'- 및 3'- 랜덤 증폭을 각각 합성하였다. 5'- 및 3'-RACE에 대한 유전자 특이적 프라이머는 상기에서 결정된 정제된 폴리펩티드의 부분 서열(서열번호 11 및 12)에서 디자인하였다. 상기 증폭된 단편을 pGEM-T Easy Vector(Promega)에 서브 클로닝하고 ABI 3130 Automatic DNA Sequencer(Applied Biosystems)상에서 시퀀싱하였다. 아울러 상기 정제된 폴리펩타이드의 전장 서열을 완성하기 위해, GENETYX version 8.0(SDC Software Development, Tokyo, Japan)을 사용하여 폴리펩타이드의 5'- 말단, 3'- 말단 및 N- 말단의 부분 서열을 조합하고 정렬하였다. 상기 디자인한 프라이머를 비롯해 본 발명에서 사용한 모든 프라이머의 핵산 서열 정보를 하기 표 1에 요약하였다.

프라이머의 핵산 서열 정보

프라이머	핵산서열(5'--> 3')	서열번호
apMolluscidin-1-deg F	GCI GCI AAR GGI AAR GG	5
apMolluscidin-1-R	CCY TTI CCI GCY TTY TTI ACI CCY TT	6
apMolluscidin-2-deg F	ATG GCW AAR GGM AA	7
apMolluscidin-2-deg R	CCY TTK CCY GCY TTY TTI AC	8
apMolluscidin-1-5' RACE	TGT AGC TTT CTT AGC TGG GCT GTC	9
apMolluscidin-1-3' RACE	GAC AGC CCA GCT AAG AAA GCT ACA	10
apMolluscidin-1-ORF-F	ATG GCA GCT AAA GGA AAA	11
apMolluscidin-1-ORF-R	GAT GCA TCA AGT CCC TGG AT	12

실시예 9: 조직에서 mRNA 발현의 정량적 PCR 분석

본 발명자들은 키조개 조직의 mRNA 분포를 평가하기 위해 아가미(gills), 외투막(mantle), 입술수염(labial palps), 알(egg), 간췌장(hepatopancreas), 사이펀(siphon) 및 생식소(gonad)를 포함한 여러 조직을 정상적이고 건강한 키조개에서 수집하였다. 전통적인 RT-PCR을 사용하여 차이를 명확하게 탐지할 수 없었기 때문에 다양한 발현 수준을 구별하기 위해 adapted quantitative PCR(qPCR) 기술을 적용하였다. qPCR은 FastStart DNA Master SYBR Green I(Roche Diagnostics)이 포함된 LightCycler 시스템(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)을 사용하여 수행하였고 프라이머(서열번호 8 및 9)를 사용하여 증폭하였으며 겔 전기영동, 시퀀싱 및 해리 곡선(dissociation curves)을 사용하여 PCR 특이성을 확인하였다. PCR 조건은 95℃에서 초기 10분간의 Taq 활성화 단계를 수행한 후 Lightcycler PCR의 40 사이클을 95℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 10초 동안 형광 판독 조건으로 수행하였다. PCR 직후, 형광 방출 강도를 측정하면서 점차 온도를 증가시켜(0.1℃ /s) 용융 곡선(melting curve) 분석을 수행하였다. apMolluscidin의 모든 3배 Ct 값은 18S rRNA Ct 값으로 정규화하였고, Livak 방법을 사용하여 apMolluscidin의 상대적인 발현을 분석하였다. 조직 분포 분석에서 입술수염(labial palps)의 mRNA 발현을 기초로 설정하였고, 조직 내 apMolluscidin의 상대적 발현은 입술수염에서 상대적으로 계산하였다.

실시예 10: 서열 분석

본 발명의 정제된 폴리펩타이드의 상동성 검색은 게놈 넷(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)에서 BLASTP 2.2.10 및 TBLASTN 2.2.10을 사용하여 수행하였고 ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/ peptide-mass.html)를 사용하여 이론적 등전점(pI)과 분자량을 추정했다. 서열 정렬은 종래 ClustalX(J.D. Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25. 4876-4882. 1997)와 함께 수행되었고 2차 구조는 GOR 방법을 사용하여 예측하였으며(http://www.expasy.org/tools/) Schiffer-Edmundson 플롯은 EMBOSS (www.bioinfo.hku.hk/EMBOSS, Pepwheel 프로그램)를 사용하여 생성하였다.

실험예 1: 추출물의 항균 및 용혈 작용

본 발명의 산성화 조 추출물(acidified crude extract)의 초기 스크리닝 동안, 아가미 및 외투막 추출물의 항균 활성을 관찰한 결과 그람 양성균(B. subtilis KCTC1021) 및 그람 음성균(E. coli D31) 박테리아 모두에 대하여 강한 항균 활성을 나타냈으며 산성화 아가미 추출물의 항균 활성은 산성화 외투막 추출물의 효능 보다 높게 나타났다. 또한, B. subtilis KCTC1021에 대한 항균 활성은 E. coil D31에 대한 항균 활성보다 컸다. 그러나 C. albicans에 대한 항균 활성을 나타내지 않았다. 또한 상기 추출물을 37℃에서 60분 동안 트립신으로 처리한 결과 B. subtilis KCTC1021 및 E. coli D31 모두 항균 활성이 유의하게 감소하였으므로, 상기 추출물에는 단백질성 항생제가 포함되어 있음을 시사한다(도 1a). 또한 인간 RBC를 사용하여 산성화 추출물의 용혈 활성을 측정한 결과 산성화된 추출물은 RBC 용혈을 유도하지 않았지만, Piscidin 1은 강한 용혈을 유발하였다(도 1b). 상기 결과는 산성화 추출물이 세포 독성이 거의 없거나 적음을 시사한다.

AU-PAGE 및 버그 블롯팅(bug blotting)은 산성화 아가미 추출물이 강한 항균 활성을 나타내는 명확하고 넓은 구역을 생성한다는 것을 나타내었다. 활성과 관련된 밴드는 히스톤 H1 밴드(~ 21 kDa)에서 aprotinin 밴드(~ 6.5 kDa)까지 분포했다(도 2). 그러나, 산성화 투과막 추출물은 aprotinin 밴드 (~ 6.5 kDa)와 관련이 있는 더 약한 구역 및 작은 활성 밴드를 생성했다. 상기 결과는 산성화 아가미 추출물이 산성화 외투막 추출물에 비해 다양하고, 고도의 염기성, 강력한 AMP를 함유하고 있음을 시사한다. 따라서 본 발명자들은 이후의 항균 활성 측정에 사용하기 위해 B. subtilis KCTC1021을 선택하였다.

실험예 2: 폴리펩타이드 정제

본 발명자들은 본 발명의 AMP를 정제하기 위해, 산성화 아가미 추출물을 Sep-Pak C18 카트리지에 먼저 주입하고 활성 물질을 상이한 아세토니트릴 농도를 함유하는 0.1 % TFA로 용출시켰다. 그 결과, B. subtilis KCTC1021 및 E. coli D31에 대한 강력한 항균 활성이 60% 아세토니트릴 분획물에서 검출되었다(도 3). 또한 Sep-Pak 추출물로부터 수득한 60% 아세토니트릴 분획을 RP-HPLC 처리한 결과 항균 활성을 여러 피크에 나타내었고 강력한 항균 활성을 갖는 피크가 18% CH₃CN에서 용출되었다(도 4a). 그 후 활성 분획을 양이온 교환 컬럼(TSKgel SP-5PW)을 사용하여 HPLC에 적용하였다(도 4b). 항균 활성은 0.82 M의 NaCl 농도에서 용출되었고 마지막으로, 활성 피크를 추가 특성화에 사용된 역상 C18 분석 컬럼을 이용하여 동질(homogeneity)로 정제하였고 상기 정제된 피크는 B. subtilis KCTC1021에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었다(도 4C).

실험예 3: 펩타이드의 항균 활성

본 발명자들은 본 발명의 정제된 펩타이드의 항균 활성을 B. subtilis KCTC1021, E. coli D31 및 C. albicans KCTC6975에 대해 시험한 결과, B. subtilis KCTC1021(MEC; 2.1 μg/mL) 및 E. coli D31(MEC; 0.5 μg/mL)에 대하여 강한 항균 활성을 나타내었으나 C. albicans에 대해서는 항균 활성을 나타내지 않았다(MEC;> 1000 ㎍ / ㎖)(도 5).

실험예 4: 폴리펩타이드 동정

본 발명의 정제된 폴리펩타이드에 대한 Ultraflex Ⅲ MALDI TOF/TOF 질량 분석(MS) 결과 5631.1 Da의 분자량을 갖는 것으로 나타났고(도 6a) Edman 분해에 의해 정제된 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열(잔기 1 내지 50)을 수득하였다(도 6b). 생성된 아미노산 서열은 고 비율의 염기성 잔기(19 Lys) 및 3 개의 주요 소수성 잔기(14 Ala, 2 Pro 및 10 Gly)를 함유하는 50 아미노산 잔기로 구성되었고 폴리펩타이드는 고도의 염기성으로 나타났다(pI, 10.93). 상기 펩타이드는 태평양 굴과 전복의 아가미로부터 각각 확인된 cgMolluscidin 및 hdMolluscidin과 높은 서열 상동성을 나타내어 apMolluscidin이라 명명했다(도 7). 확인된 아미노산 서열은 리신-리신(K-K) 및 7개 리신-글리신(K-G) 반복을 포함하여 6개의 이염기성 잔기 반복(dibasic residues repeats)을 포함한다. 또한 cgMolluscidin 또는 hdMolluscidin과 같이 반복 서열 사이에 Ala, Pro 또는 Gly와 같은 작은/소수성 아미노산이 위치한다(J.K. Seo et al., Fish Shellfish Immunol. 35 (2). 480-488. 2013, J.K. Seo, et al., Haliotis discus, Fish Shellfish Immunol. 52 289-297. 2016). 상기 확인된 아미노산 서열(4702.6Da)의 계산된 질량은 MALDI-(TOF)/ TOF-MS로부터 수득한 질량(5631.1Da)과 일치하지 않았다. 상기 결과는 확인된 아미노산 서열이 단지 apMolluscidin의 부분 아미노산 서열임을 시사한다.

실험예 5: apMolluscidin의 cDNA 클로닝

본 발명자들은 apMolluscidin의 cDNA 클로닝을 위해 서열 분석을 통해 40 N-말단 아미노산 잔기를 코딩하는 것으로 결정되는 아가미의 cDNA로부터 120 bp PCR 생성물을 수득하였다. 그 후 apMolluscidin의 5'- 및 3'-말단을 SMART RACE 방법을 사용하여 증폭시켰다. 상기 cDNA 단편의 서열은 아기미 cDNA 및 프라이머 ORF-F 및 ORF-R을 이용한 RT-PCR 시퀀싱에 의해 정렬되고 확인되었다. 전장 apMolluscidin cDNA(GenBank Accession No.MH571848)는 82 bp의 5'-비번역 영역(UTR) 및 547 bp의 3'-UTR을 포함하여 812 bp를 포함하였다. 완전한 apMolluscidin cDNA는 60 아미노산을 인코딩하는 183 bp의 코딩 서열을 포함한다(도 8). 예상 분자량(Met 제외)은 5629.8 Da 였고 MALDI-TOF 결과(5631.1 Da)와 일치하였다(도 6). 3'-UTR은 RNA 불안정성을 중재하는 추정 폴리(A)+신호(AATAAA) 및 2 개의 ATTTA 모티프를 포함한다. 상기 추론된 펩타이드 서열은 60개의 아미노산(Met를 포함)으로 구성되었고 3개의 주요 잔기(24 Lys, 15 Ala 및 12 Gly)의 높은 비율을 포함한다; 계산된 pI는 11.04였다. 또한, 상기 추론된 아미노산 서열은 8개의 Lys-Lys 반복을 포함하고, Ala와 Gly와 같은 작은/소수성 아미노산이 반복 사이에 위치했다. N 말단 Met를 제외한 추론된 아미노산 서열의 계산된 질량은 MALDI-(TOF)/TOF-MS(5631.1 Da)로부터 수득한 질량과 일치하는 5629.8 Da로 나타났다. 상기 결과는 apMolluscidin이 번역 후 변형(post-translational modification)을 겪지 않으며 수득된 아미노산 서열이 정확하게 확인되었음을 시사한다. 또한 apMolluscidin의 추정 정체성(putative identity)을 결정하기 위해 NCBI 데이터베이스를 사용하여 BLAST 유사 검색을 수행한 결과 apMolluscidin의 cDNA 또는 추론된 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스의 서열과 일치하지 않았다. 그러나 apMolluscidin과 온라인으로 업데이트 된 Antimicrobial Peptide Database(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)의 모든 서열을 비교한 결과 cgMolluscidin과 hdMolluscidin의 유사성은 58.46%와 56.45%로 나타났다.

실험예 6: apMolluscidin mRNA 발현 양상

본 발명자들은 apMolluscidin 전사체의 발현을 SYBR Green qPCR을 사용하여 검사하였고 해리 곡선(dissociation curves)을 분석하였다. 그 결과, 해리 곡선은 apMolluscidin 및 18S rRNA 모두에 대해 단일 피크(single peak)를 가졌으며, 이는 증폭이 표적 특이적(target-specific)이라는 것을 의미한다. qPCR에 의해 결정된 바와 같이, apMolluscidin 전사체는 정상적인 생리 조건 하에서 상이한 발현 수준으로 검사된 모든 조직에서 편재적(ubiquitously)으로 발현되었다. apMolluscidin 전사체의 발현은 가장 낮은 mRNA 수준(입술수염)을 나타내는 조직과 비교하여 각각 88.7배 및 34배 발현된 사이펀 조직에 이어 아가미에서 현저하게 높았다. apMolluscidin 전사체는 외투막, 생식소 및 간췌장에서 적당히 발현되었지만, 알 및 입술수염(labial palps)에서는 거의 발현되지 않았다(도 9).

실험예 7: apMolluscidin의 2차 구조 예측

본 발명자들은 apMolluscidin의 2차 구조를 예측하기 위해 ExPASy 도구 서버(도 10a)에서 GOR을 사용하여 구조 예측을 수행하였다. 그 결과, 예측 프로그램은 apMolluscidin이 시트(sheet), 턴(turn) 및 랜덤 코일(random coils)을 포함하는 두 개의 α-나선 구조 또는 짧은 혼합 구조를 형성할 가능성이 있음을 시사한다. 또한 Schmfer-Edmunson helical wheel projection은 apMolluscidin의 2차 구조에서 소수성 및 친수성 영역을 예측하는 데 사용되었다(도 10b). apMolluscidin은 염기성 잔기를 포함하는 소수성 및 친수성 잔기가 반대편에 위치하는 양친매성 구조(amphipathic structure)를 채택하지 않을 수 도 있다. 일반적으로 플로로시딘(pleurocidin) 이나 피시딘(piscidins)과 같은 AMP는 항균 활성 및 양친매성 특성에 결정적인 소수성 및 하전 잔기가 각면에 위치하는 α-helical 구조를 가지고 있다. 따라서 apMolluscidin의 비-양친매성 구조는 항균 효과가 다른 AMP와는 다른 기전에 의해 유도될 수 있음을 시사한다.

결론적으로, 본 발명의 키조개의 완전히 식별된 아미노산 서열로부터 분리한 항균 펩타이드는 그람-양성 및 그람-음성균의 다양한 표지균주에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었으므로 다양한 병원성 균주 및 유해균주의 제어를 위한 항생제 대체 소재로 활용가능하다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Antimicrobial peptide derived from pen shell, Atrina pectinata and uses thereof <130> PD18-5705 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin amino acid <400> 1 Ala Ala Ala Lys Gly Lys Gly Lys Lys Gly Ala Ala Lys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Asp Ser Pro Ala Lys Lys Ala Thr Lys Ala Lys Lys Pro Ala Ser Lys 20 25 30 Gly Val Lys Lys Ala Gly Lys Gly 35 40 <210> 2 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin nucleic acid <400> 2 gcagcagcta aaggaaaagg caagaaggga gcagcaaaag gggccggtga cagcccagct 60 aagaaagcta caaaggcaaa aaagccagca agcaagggag taaagaaagc gggaaaggga 120 120 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pMolluscidin amino acid full sequence <400> 3 Met Ala Ala Ala Lys Gly Lys Gly Lys Lys Gly Ala Ala Lys Gly Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Pro Ala Lys Lys Ala Thr Lys Ala Lys Lys Pro Ala Ser 20 25 30 Lys Gly Val Lys Lys Ala Gly Lys Gly Lys Lys Gly Ala Ala Lys Lys 35 40 45 Gly Ala Lys Gly Lys Gly Lys Lys Ala Thr Lys Lys 50 55 60 <210> 4 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin nucleic acid full sequence <400> 4 atggcagcag ctaaaggaaa aggcaagaag ggagcagcaa aaggggccgg tgacagccca 60 gctaagaaag ctacaaaggc aaaaaagcca gcaagcaagg gagtaaagaa agcgggaaag 120 ggaaagaagg gagcagctaa gaaaggcgct aagggcaaag gaaagaaagc cacaaaaaag 180 taa 183 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-1-deg F <400> 5 gcgcaargga argg 14 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-1-R <400> 6 ccyttccgcy ttyttacccy tt 22 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-2-deg F <400> 7 atggcwaarg gmaa 14 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-2-deg R <400> 8 ccyttkccyg cyttyttac 19 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-1-5' RACE <400> 9 tgtagctttc ttagctgggc tgtc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-1-3' RACE <400> 10 gacagcccag ctaagaaagc taca 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-1-ORF-F <400> 11 atggcagcta aaggaaaa 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apMolluscidin-1-ORF-R <400> 12 gatgcatcaa gtccctggat 20

Claims (11)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고 항균활성을 나타내는 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 내에서 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 펩타이드.
3. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   그람 음성균 또는 그람 양성균에 대한 항균활성을 갖는, 항균 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 그람 양성균은 B. cereus, B. subtilis, S. mutans, S. iniae, S. aureus, L. garvieae, S. vestibularis, E. faecalis, 또는 S. parauberis인, 항균 조성물.
6. 제4항에 있어서,
   상기 그람 음성균은 E. coli, E. cloacae, P. aeruginosa, V. alginoalyticus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. harveyi, K. pneumoniae, E. tarda, P. mirabilis, P. stuartii 또는 S. typhimurium인, 항균 조성물.
7. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제7항의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터.
9. 제8항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 벡터인, 재조합 벡터.
10. 제8항 또는 제9항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨, 형질전환 숙주세포.
11. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 사료 첨가제.

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