CN104498443B - 鲍曼不动杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)噬菌体及其应用，属于微生物工程领域。分离出的噬菌体单体命名为SWH‑Ab‑1，对鲍曼不动杆菌具有广谱的杀菌能力。噬菌体SWH‑Ab‑1保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏日期是2014年10月23日，保藏编号为CCTCC M2014507。

Description

鲍曼不动杆菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及一种能够特异性裂解鲍曼不动杆菌菌株的噬菌体及其在杀菌和防菌中的应用，属于微生物工程领域。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)属非发酵、氧化酶阴性、触酶阳性的革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界的水、土壤和医院环境，是医院获得性感染的主要条件致病菌之一，可引起住院病人的呼吸道、泌尿道和伤口感染，也是引起烧伤感染的病原菌。该菌在医院环境中分布很广且可以长期存活，极易造成危重患者的感染，常从被感染患者的血、尿、脓液及呼吸道分泌物等标本中分离出，在非发酵菌中感染仅次于铜绿假单胞菌。相关数据显示：不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为33.6％、米诺环素为51.4％，对碳青霉烯类抗生素美罗培南和亚胺培南的耐药率分别为62.1％和63.6％。对其他检测的抗菌药物的耐药率均达到56.2％以上。碳青霉烯类被认为是抗菌效果良好的抗生素，但是有关耐青霉烯类细菌的报道逐年增加，由于医院经常使用碳青霉烯类抗生素所形成的选择性压力，同样会造成鲍曼不动杆菌耐药菌株的优势生长，给临床治疗带来很多困难。

噬菌体(bacteriophage，phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，噬菌体具有病毒特有的一些特性：个体微小，不具有完整细胞结构，只含有单一核酸。所有已知的噬菌体都是在细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。作为病毒的一种，噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在。噬菌体在其生活周期过程中呈现两种类型，即毒性噬菌体和温和噬菌体。毒性噬菌体能使宿主菌细胞迅速的裂解死亡，而温和噬菌体在感染宿主菌后一般不引起宿主菌的立即死亡，而是将自身的基因组整合到宿主菌的染色质中，这种状态又叫做溶原状态。用于治疗和控制细菌性感染的噬菌体主要是指毒性噬菌体。噬菌体具有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，并且对哺乳类动物细胞无任何影响。此外，噬菌体裂解细菌的效率非常高，噬菌体感染细菌后，通过异常特殊机制，噬菌体DNA进入细菌细胞，随后进行生物合成，产生大量子代噬菌体，子代噬菌体从细胞内释放到细胞外，宿主细胞随即死亡。

目前，噬菌体人体治疗的临床病例已积累达数千例，但过去几十年噬菌体治疗始终未能得到广泛应用，除了抗生素的发现与广泛使用以外，其根本原因在于噬菌体对宿主菌特异性要求太高，人们不可能找到那么多型特异的噬菌体来适应如此众多种类、型别不同的细菌感染。1980年后，随着抗生素耐药性问题日益加剧，科学家们又重新将目光投回到噬菌体治疗上，企盼从中获得有效的抗生素替代治疗方案来控制日益加剧的全球性耐药问题。噬菌体治疗的疾病包括化脓性伤口感染、胃肠炎、脓毒症、骨髓炎、皮炎、脓胸及肺炎等，可治疗的病原菌包括葡萄球菌、链球菌、克雷伯菌、埃希杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、志贺菌及沙门菌等。2006年美国食品和药品管理局首次批准将噬菌体用作食品添加剂，主要用于杀灭肉制品中的李氏杆菌。噬菌体治疗具有指数增值、特异性强、易实时更新、副作用小、无残留及周期短、成本低等独特优点，被广大学者所青睐。

发明内容

本发明的目的是开发对鲍曼不动杆菌具有强烈裂解作用的噬菌体分离物，该噬菌体分离物可以单独或混合使用，可以特异性地部分或完全灭活鲍曼不动杆菌，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体株来源。

本发明的目的是这样实现的：

一种鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1，保藏号为：CCTCC M2014507。

该噬菌体具有1个多面体立体头部，头部直径约为136nm，无囊膜，有一长尾，尾长约272nm，尾宽约27nm。

该噬菌体能够用于抑制鲍曼不动杆菌。将该噬菌体SWH-Ab-1作用于来源不同的50株临床鲍曼不动杆菌菌株，能裂解其中11株宿主菌，具有较宽的宿主谱。

本发明中的噬菌体SWH-Ab-1可以单独或混合使用，当MOI＝0.001时，鲍曼不动杆菌噬菌体感染宿主菌产生的子代噬菌体效价为10.2×10¹²pfu/mL。本发明中的噬菌体可作为杀菌剂应用于防治环境中，包括但不限于环境中的鲍曼不动杆菌的污染。

本发明的有益效果是：分离到的噬菌体SWH-Ab-1对鲍曼不动杆菌具有裂解活性，具有较宽的宿主谱，可以有效地杀灭和防治鲍曼不动杆菌，可以单独或混合使用，可作为杀菌剂应用于防治环境中，或者应用在制备防治细菌感染的生物药物方面。噬菌体毒副作用甚小，安全性高，具有很高的临床应用价值。

附图说明

图1为噬菌体SWH-Ab-1双层平板检测结果。

图2为噬菌体SWH-Ab-1电镜照片。

具体实施方式

LB液体培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

鲍曼不动杆菌宿主菌液由西南医院检验科临床微生物室提供。

实施例1鲍曼不动杆菌噬菌体的分离制备

(1)污水的采集及处理

污水采自第三军医大学第一附属医院污水站未处理的污水，经过4℃，10000r/min离心10min，用0.22μm滤膜过滤得到上清液。

(2)鲍曼不动杆菌噬菌体的特异性扩增

取步骤(1)得到的上清液100mL，加入50mL LB液体培养基混匀，加入鲍曼不动杆菌宿主菌液(OD_600nm为0.6)2mL，混匀后，置于37℃恒温摇床，160r/min振荡过夜培养，次日4℃，10000r/min离心10min，取上清液，此步为噬菌体扩增培养。

(3)斑点实验测定特异性噬菌体的有无

将步骤(2)得到的上清液用LB液体培养基进行10¹～10⁸连续梯度稀释，取稀释后的滤液各10μL，分别加入到装有0.2mL鲍曼不动杆菌宿主菌液(OD_600nm为0.6)的离心管中，涡旋混匀后，室温下静置15min，使噬菌体充分吸附宿主菌，再加入50℃融化的0.7％琼脂的半固体LB培养基5mL，振荡混匀，均匀倾倒于1.5％琼脂的固体LB平板上，做好平板标记。将做好标记的平板放入37℃培养箱中培养，在2h、3h、4h、5h时观察有无噬菌斑。以上操作均在无菌条件下进行。

(4)鲍曼不动杆菌噬菌体的分离及扩增

挑取步骤(3)中在双层平板中呈现的噬菌斑(如图1所示)，接种于2mL鲍曼不动杆菌宿主菌液(OD_600nm为0.6)中，37℃，160r/min培养6h以扩增噬菌体。培养6h后将菌液4℃，10000r/min离心10min，得到的上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即为噬菌体原液。

实施例2鲍曼不动杆菌噬菌体的纯化

将实施例1中得到的噬菌体原液用LB液体培养基稀释至10⁷倍，按照实施例1中步骤(3)的方法进行双层琼脂平板检测。用接种环挑取形状规则、边缘光滑的单个噬菌斑，接种于2mL鲍曼不动杆菌宿主菌液(OD_600nm为0.6)中，37℃160rpm/min振荡培养4-6h,溶液变得清亮，说明细菌裂解了，4℃，10000r/min离心10min。最后得到的上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。重复上述过程3～5次，即得到纯化的噬菌体，将其命名为SWH-Ab-1，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，保藏号：CCTCC M2014507，分类命名：Acinetobacter baumannii phage，保藏日期为2014年10月23日。

实施例3.噬菌体的效价测定与保存

将实施例2中纯化后的噬菌体样品用LB液体培养基稀释至10⁷倍，取10μL样品，加入到0.2mL鲍曼不动杆菌宿主菌液(OD_600nm为0.6)中，然后采用实施例1中步骤(3)的双层琼脂平板培养法培养噬菌体，取密度适当的平皿计算噬斑个数。做3个重复，噬菌体效价的计算取3个重复所得的平均值。噬菌体的效价(pfu/mL)＝密度适当的平板上的噬斑数×稀释度×100。结果测得：噬菌体的效价为8×10⁹pfu/mL。将最终得到的噬菌体加无菌甘油至终浓度30％后，-80℃保存备用。

实施例4.噬菌体的最佳感染复数

按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)分别为0.001、0.01、0.1、1和10的比例分别加入实施例2中纯化后的噬菌体液和鲍曼不动杆菌宿主菌液(OD_600nm为0.2，对应细菌浓度为0.2×5×10⁸cfu/mL＝1×10⁸cfu/mL)，在这5份样品溶液中分别加入LB液体培养基使5份样品体积相同，37℃培养至细菌裂解澄清，10000r/min离心10min，收集上清液，按照实施例3的方法测定噬菌体效价，设置两个重复，取两个重复的平均值，同时以不加噬菌体的鲍曼不动杆菌宿主菌和不加宿主菌的噬菌体作为对照，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。

如表1所示，当MOI＝0.001时，鲍曼不动杆菌噬菌体感染宿主菌产生的子代噬菌体效价为10.2×10¹²pfu/mL，在5个感染复数中，该产出率是最高的。因此，我们可以确定鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1感染其宿主菌鲍曼不动杆菌的最佳感染复数为0.001。

表1鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1最佳感染复数的测定

实施例5.噬菌体SWH-Ab-1的电镜观察

取噬菌体SWH-Ab-1纯化颗粒作电镜观察：取实施例2得到的纯化后的噬菌体SWH-Ab-1样本20μL滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察。

透射电镜结果显示：如图2所示，电镜下可见有1个多面体立体头部，头部直径约为136nm，无囊膜，有一长尾，尾长约272nm，尾宽约27nm。

实施例6.噬菌体在临床鲍曼不动杆菌菌株中的杀菌效果

将来自西南医院检验科临床微生物室的50株鲍曼不动杆菌菌株，用LB液体培养基进行扩增，37℃160rpm/min振荡培养4-6h后，用无菌棉签将培养液均匀涂布于LB平板上。将效价为8×10⁹pfu/mL的噬菌体3-5ul滴在细菌的涂布区域，37℃培养16～20h后，观察是否形成噬菌斑。统计结果如下表2所示，鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1能裂解11株宿主菌，具有较宽的宿主谱。

表2噬菌体SWH-Ab-1对50株鲍曼不动杆菌菌株的作用结果

+：有噬菌斑—：无噬菌斑

实施例7.鲍曼不动杆菌对噬菌体的敏感程度检测

挑取实施例6中能被鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1感染的11株鲍曼不动杆菌(实验组)的单斑，分别放至3mL LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养4-6h，使得所有菌株浓度相同，同时取2株未被噬菌体感染的鲍曼不动杆菌Aba25和Aba30作为对照组。

在100μL上述浓度相同的鲍曼不动杆菌实验组和对照组菌液中，分别加入100μL实施例2中纯化后的噬菌体液，放到摇床中继续振荡培养，每隔40min测浊度，测得40min、80min、120min、160min后4个时间段的浊度值如下表3所示，通过细菌浓度的变化，可以得知它们对噬菌体的敏感程度。在这11株被感染的鲍曼不动杆菌中，Aba08的敏感程度较高，Aba23、Aba24、Aba33、Aba97的敏感程度较弱。Aba25和Aba30对噬菌体不敏感，所以160min后浓度反而增加了一倍多。

表3鲍曼不动杆菌对噬菌体的敏感程度检测

Claims (4)

1.一种鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1，其特征在于：保藏号为：CCTCC M2014507。

2.根据权利要求1所述的鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1，其特征在于：该噬菌体具有1个多面体立体头部，头部直径约为136nm，无囊膜，有一长尾，尾长约272nm，尾宽约27nm。

3.根据权利要求1所述的鲍曼不动杆菌噬菌体SWH-Ab-1，其特征在于：该噬菌体能够用于抑制鲍曼不动杆菌。

4.权利要求1所述的噬菌体SWH-Ab-1在防治鲍曼不动杆菌污染方面的应用。