CN108842006A - 一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法及其应用，该方法不依赖血清样本的核酸提取，通过qPCR检测噬菌体侵染病原菌后产生子代噬菌体的核酸拷贝数的变化，实现病原菌鲍曼不动杆菌的快速鉴定。该方法使用的特异性引物和探针，是通过分析噬菌体和鲍曼不动杆菌的序列并找出噬菌体的特异序列，针对该特异序列设计的，所述引物包括正向引物和反向引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。该引物和探针应用于本发明的快速鉴定方法，噬菌体检测方法的特异性强。本发明的血清中鲍曼不动杆菌的鉴定方法以噬菌体核酸序列为靶标，能在4h内实现对鲍曼不动杆菌低至102CFU/mL的检测，检测方法简单易操作，检测灵敏度高。

Description

一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法及其应用
技术领域
本发明属于病原菌检测领域，具体涉及一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法及其应用，该方法通过qPCR检测侵染病原菌后的噬菌体的核酸拷贝数的变化，从而实现病原菌鲍曼不动杆菌的快速鉴定。
背景技术
败血症是由微生物造成血液感染的炎症反应，可以造成10％-80％的致死率(Kaukonen K M,Bailey M,Suzuki S,Pilcher D,Bellomo R.Mortality related tosevere sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia andNew Zealand,2000-2012.JAMA；2014；311:1308-1316。Zelenin S,Hansson J,Ardabili S,Ramachandraiah H,Brismar H,Russom A.Microfluidic-based isolation of bacteriafrom whole blood for sepsis diagnostics.Biotechnol Lett 2015；37:825-830)。快速鉴定病原菌对于败血症病人的治疗以及挽救生命十分重要，且鲍曼不动杆菌即为引发败血症的一种常见的病原菌。传统的病原菌鉴定方法是血培养，需要48-120h且敏感度低(Opintan J A,Newman M J.Prevalence of antimicrobial resistant pathogens fromblood cultures:results from a laboratory based nationwide surveillance inGhana.Antimicrob Resist Infect Control 2017；6:64)。针对病原菌特殊性基因进行PCR扩增鉴定的检测方法快速且灵敏高，但是这种方法无法区分死细菌还是活细菌，且待测靶标只可以针对特异性基因(Opota O,Jaton K,Greub G.Microbial diagnosis ofbloodstream infection:towards molecular diagnosis directly from blood.ClinMicrobiol Infect 2015；21:323-331)。
噬菌体是一种能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，通过感染、增殖、成熟并释放子代等一系列的过程侵染病原体，达到裂解、杀灭宿主菌的作用。噬菌体一旦侵入宿主，可以在短期内爆发产生大量子代噬菌体。传统的基于噬菌体筛查病原菌方法通常是通过双层琼脂平板形成子代噬菌体，需要48-72h的孵育时间。目前基于噬菌体裂解宿主这一特性的快速检测方法中大多数方法仅仅局限于诸如牛奶等培养基(Dow P,Kotz K,Gruszka S,Holder J,Fiering J.Acoustic separation in plasticmicrofluidics for rapid detection of bacteria in blood using engineeredbacteriophage.Lab Chip 2018；18:923-932)。
发明内容
针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法及其应用，不依赖血清样本的核酸提取，能在4h内实现对鲍曼不动杆菌低至102CFU/mL的检测，检测灵敏度高、特异性强。
本发明的第一个目的在于提出一种适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的在于提出一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)取LB培养基稀释的噬菌体试剂与血清等体积混合，37℃下200rpm孵育共培养；
(2)分别在0h和3h时取步骤(1)中的共培养液进行qPCR检测噬菌体核酸拷贝数；所述适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)结果分析：比较两个时间点噬菌体核酸拷贝数的变化，噬菌体核酸拷贝数变化引起的Ct值变化大于0.5时说明血液中存在鲍曼不动杆菌感染。
进一步地，所述噬菌体试剂中噬菌体的浓度为102～104PFU/mL。
更进一步地，所述噬菌体试剂中噬菌体的浓度为103PFU/mL。
进一步地，所述qPCR检测体系为：0.5μL Taq DNA聚合酶，1.6μL dNTPs(2.5mM foreach)，2μL 10×buffer(200mM Tris-HCl pH 8.3，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4及5％NP40)，0.4μL引物和探针(各20μM)，5.9μL milliQ水，2μL噬菌体和血清的混合样本作为模板。
进一步地，所述qPCR程序为：95℃预变性3min；95℃5s，60℃1min，循环反应40个。
本发明的第三个目的在于提出一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定试剂盒，包括适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物和探针；所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR MIX反应液和去离子水。
更进一步地，所述PCR MIX反应液包括：Taq DNA聚合酶，dNTPs(2.5mM for each)，10×buffer(200mM Tris-HCl pH 8.3，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4及5％NP40)，引物和探针各20μM。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明的血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法使用的特异性引物和探针，是通过分析噬菌体和鲍曼不动杆菌的序列并找出噬菌体的特异序列，针对该特异序列设计的，该序列应用于本发明的快速鉴定方法，噬菌体检测的特异性强。
(2)本发明的血清中鲍曼不动杆菌的鉴定方法以噬菌体核酸序列为靶标，通过qPCR检测噬菌体侵染宿主菌产生子代噬菌体的变化实现血清样本中鲍曼不动杆菌的直接快速检测，该方法不依赖血清样本的核酸提取，能在4h内实现对鲍曼不动杆菌低至102CFU/mL的检测，检测方法简单易操作，检测灵敏度高。
附图说明
图1为实施例1的血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法的原理示意图。
图2为实施例1的血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法的扩增曲线示意图。
图3为本发明设计的引物和探针特异性试验结果示意图；其中图3A为扩增结果的琼脂胶图，图3B为噬菌体p53扩增时以其浓度为横坐标、Ct值为纵坐标的标准曲线。
图4为噬菌体p53爆发时间确定试验的结果示意图。
图5-9为实施例4中某一噬菌体浓度下，在各个时间点检测不同浓度的鲍曼不动杆菌，以确定最佳噬菌体用量的结果示意图。
图10为实施例5的检测模拟临床血清样本中的鲍曼不动杆菌时，最佳的噬菌体浓度下(103PFU/mL)，样本中不同时间点噬菌体核酸拷贝数结果示意图。
图11为实施例5的检测模拟临床血清样本中的鲍曼不动杆菌时，最佳的噬菌体浓度下(103PFU/mL)，以鲍曼不动杆菌添加浓度为横坐标、以ΔCt为纵坐标的标准曲线。
具体实施方式
下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。
实施例1：血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法的建立
1、适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物和探针的设计
一般情况下如果PCR方法用来检测样本中的噬菌体，需要除去样本中宿主菌的DNA，以避免宿主菌对噬菌体检测的干扰。本实施例首先通过二代测序技术对于分离得到的噬菌体p53进行全基因组测序分析，然后将噬菌体p53的序列与NCBI数据库获得的鲍曼不动杆菌(NZ_CP009257.1)的序列进行比对分析找出噬菌体的特异序列，从而针对该特异序列进行引物和探针的设计。
SEQ ID NO.1正向引物序列：5'-cggatgtggcaatattac-3'；
SEQ ID NO.2反向引物序列：5'-ttcccatttgcgattttg-3'；
SEQ ID NO.3探针：5'-FAM-attcgatgtggcacacctgc-BHQ1-3'
2、本发明的血清中鲍曼不动杆菌的鉴定方法以噬菌体核酸序列为靶标，通过qPCR检测噬菌体侵染宿主菌产生子代噬菌体的变化实现血清样本中鲍曼不动杆菌的直接快速检测，具体操作过程如图1所示。
(1)取LB培养基稀释至浓度为103PFU/mL的噬菌体100μL与100μL血清混合，37℃下200rpm孵育共培养；
(2)分别在0h和3h时取步骤(1)中的共培养液进行qPCR检测噬菌体核酸拷贝数。
SEQ ID NO.1正向引物序列：5'-cggatgtggcaatattac-3'；
SEQ ID NO.2反向引物序列：5'-ttcccatttgcgattttg-3'；
SEQ ID NO.3探针：5'-FAM-attcgatgtggcacacctgc-BHQ1-3'
PCR反应体系为：
0.5μL Taq DNA聚合酶，1.6μL dNTP(2.5mM for each)，5.9μL milliQ水，2μL 10×buffer(200mM Tris-HCl pH 8.3，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4及5％NP40)，0.4μL的引物和探针(各20μM)以及2μL噬菌体和血清的混合样本作为模板。
qPCR程序为：
95℃预变性3min；95℃5s，60℃1min，循环反应40个。
(3)结果分析：
图2为实验过程中0h和3h时噬菌体的扩增曲线，根据三次平行实验产生的标准偏差error bar，比较两个时间点噬菌体核酸拷贝数的变化，噬菌体核酸拷贝数变化引起的Ct值变化大于3倍的error bar，即ΔCt值大于0.5时说明血液中存在鲍曼不动杆菌感染。
实施例2：噬菌体p53检测的特异性试验
本实施选取8个鲍曼不动杆菌的临床菌株(AB3362、AB5671、AB3437、AB3304、AB3782、AB3457、AB2140、LB8)和4个非鲍曼菌株(E.coli、S.aureus、P.aeruginosa、S.pyogene)用来测试引物和探针的特异性。
分别以上述12种菌株的DNA和噬菌体p53DNA为模板DNA，分别以SEQ ID NO.1序列为上游引物和以SEQ ID NO.1序列为下游引物、采用与实施例1相同的PCR反应体系和PCR程序进行PCR扩增，以SEQ ID NO.3序列为探针，扩增结果的琼脂胶图如图3A所示，可以看出扩增条带只有p53有目的条带，其它菌株均没有条带，说明了引物和探针对噬菌体p53的特异性。
利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、探针SEQ ID NO.3对不同浓度的噬菌体p53DNA进行PCR扩增检测，噬菌体p53浓度梯度从101PFU/mL到108PFU/mL，图3B中良好的线性关系(R2＝0.996)也说明了该引物和探针用来检测噬菌体p53是可行的。进一步地从曲线的斜率计算得到扩增效率为106.6％，在90-110％范围内，也表明了不经过DNA提取，只经过PCR步骤的95预变性3分钟，噬菌体就能很好地释放出DNA，用于噬菌体的检测。从图3B的曲线还可以看出，PCR检测噬菌体p53的极限浓度为102PFU/mL。
实施例3：噬菌体p53的爆发时间确定试验
噬菌体p53在宿主菌中的爆发时间用PCR结果进行确定的，目的是确定噬菌体用于宿主菌鲍曼不动杆菌检测时监测的时间间隔。
为了消除浓度因素对噬菌体爆发时间的影响，本实施例采用两个噬菌体浓度来测定噬菌体p53的爆发时间：分别为104PFU/mL和106PFU/mL。
分别以浓度为104PFU/mL和106PFU/mL的噬菌体p53与宿主菌鲍曼不动杆菌等体积混合，分别以SEQ ID NO.1序列为上游引物和以SEQ ID NO.1序列为下游引物、采用与实施例1相同的PCR反应体系和PCR程序进行PCR扩增，以SEQ ID NO.3序列探针。不同时间点混合样本的Ct值对不同的培养时间作图(最开始1小时每5min取样一次，1-2小时期间15min取样一次，2-3小时期间30min取样一次)。如图4所示，噬菌体侵染宿主菌后，细菌裂解释放出子代噬菌体，对于两个浓度的噬菌体p53，可以看出爆发时间约为40min，因此对于后期的监测时间间隔我们采用40min。
实施例4：灵敏度试验
确定适用于检测宿主鲍曼不动杆菌的最佳噬菌体浓度能提高对血清样本中宿主菌的检测灵敏度和检测范围，因此为提高血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法的灵敏度和检测浓度范围，噬菌体p53的使用浓度从102PFU/mL到106PFU/mL进行了优化。每个噬菌体p53的浓度下，宿主菌鲍曼不动杆菌的检测浓度设置在100CFU/mL-106CFU/mL之间，这些浓度囊括了所有败血症的血清样本中可能的细菌浓度。噬菌体p53与LB8的混合样本在37℃培养，以40min为采样间隔，对各个时间点混合样本中噬菌体p53进行qPCR测定，Ct值对时间作图，如图5-9所示。结果表明低浓度如102PFU/mL的噬菌体(图9所示)浓度使得Ct值的变化非常缓慢，低浓度的宿主菌鲍曼不动杆菌也难以检测到。当噬菌体p53的浓度为103PFU/mL(图8所示)时，灵敏度最高，能检测到102CFU/mL的鲍曼不动杆菌。
实施例5：检测模拟临床血清样本中的鲍曼不动杆菌
1、检测过程
取噬菌体p53用LB培养基稀释，将100μL待测血清样本与100μL浓度为103PFU/mL的噬菌体混合，37℃200rpm孵育3h，分别对0h和3h时刻的子代噬菌体进行PCR，检测噬菌体核酸拷贝数的变化。
如果ΔCt值大于0.5，说明此血清样本为鲍曼不动杆菌感染样本；如果ΔCt值小于0.5，此待测血清样本不是鲍曼不动杆菌感染样本。这里我们采用模拟血清样本，在血清中分别添加不同浓度的15株临床鲍曼不动杆菌的血清样本(5μL菌液与95μL血清混合)。
2、实验结果
表1 22份含鲍曼不动杆菌的模拟血清样本的检测结果
+++，++and+mean very clear，clear and faint of tohteh eplrsa:q1u0es6，respectively.---means no lysis plaque
3、结论
图10为最佳的噬菌体浓度下(103PFU/mL)，样本中不同时间点噬菌体核酸拷贝数结果示意图；图11为最佳的噬菌体浓度下(103PFU/mL)，以鲍曼不动杆菌添加浓度为横坐标、以ΔCt为纵坐标的标准曲线。结果表明基于检测噬菌体爆发的方法来检测鲍曼不动杆菌具有极高的特异性与较好的敏感性，可以在4h内实现血清样本中病原菌的快速检测，并且能检测到低至102CFU/mL的鲍曼不动杆菌。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggatgtggc aatattac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcccatttg cgattttg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attcgatgtg gcacacctgc 20

Claims (9)

1.一种适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物和探针，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取LB培养基稀释的噬菌体试剂与血清等体积混合，37℃下200rpm孵育共培养；
(2)分别在0h和3h时取步骤(1)中的共培养液进行qPCR检测噬菌体核酸拷贝数；所述适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)结果分析：比较两个时间点噬菌体核酸拷贝数的变化，噬菌体核酸拷贝数变化引起的Ct值变化大于0.5时说明血液中存在鲍曼不动杆菌感染。
3.根据权利要求2所述的一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，其特征在于，所述噬菌体试剂中噬菌体的浓度为102～104PFU/mL。
4.根据权利要求3所述的一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，其特征在于，所述噬菌体试剂中噬菌体的浓度为103PFU/mL。
5.根据权利要求2所述的一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，其特征在于，所述qPCR检测体系为：0.5μL Taq DNA聚合酶，1.6μL dNTPs(2.5mM for each)，2μL 10×buffer(200mM Tris-HCl pH 8.3，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4及5％NP40)，0.4μL引物和探针(各20μM)，5.9μL milliQ水，2μL噬菌体和血清的混合样本作为模板。
6.根据权利要求2所述的一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，其特征在于，所述qPCR程序为：95℃预变性3min；95℃5s，60℃1min，循环反应40个。
7.一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括适用于qPCR检测噬菌体核酸拷贝数的特异性引物和探针；所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求7所述的一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR MIX反应液和去离子水。
9.根据权利要求8所述的一种血清中鲍曼不动杆菌的快速鉴定试剂盒，其特征在于，所述PCR MIX反应液包括：Taq DNA聚合酶，dNTPs(2.5mM for each)，10×buffer(200mMTris-HCl pH 8.3，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4及5％NP40)，引物和探针各20μM。
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