CN102344911A - 鲍氏不动杆菌的噬菌体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种经分离的鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的噬菌体，其具有选自序列SEQ ID NO.1、2、3、4或与序列SEQ ID NO.1、2、3、4的同源性为80％以上的序列的一个或多个序列的基因组序列。该噬菌体特异性感染鲍氏不动杆菌，可应用于减少鲍氏不动杆菌的数量。

Description

鲍氏不动杆菌的噬菌体

技术领域

本发明涉及一种新型的噬菌体，尤其涉及一种鲍氏不动杆菌的噬菌体。

背景技术

院内感染(nosocomial infection)是医院最棘手的难题，据统计，医院的院内感染率一般约为3％～5％。院内感染的细菌通常为条件致病菌(opportunistic pathogen)，亦即，对于免疫力正常的宿主而言，这类细菌为无害的，有些细菌甚至是人体表面的正常菌群(normal flora)；但在宿主免疫力下降时，这类细菌就容易引起感染，造成疾病。

造成院内感染的细菌可能生存于听诊器、病历、止血带、手套、针头、呼吸器、潮湿瓶、家具、地板、通风口、监视器等设备；或存在于水、土壤及食物(水果、蔬菜中)和下水道污物中；或存在于人体，如皮肤、腋下、结膜、口腔、上呼吸道、鼻咽及肠胃道等处。

院内感染的发生，以加护病房为例，由于病患多为重症患者，人体免疫力较差，且常需要接受侵入性治疗，例如插管、血管装置等，大幅提高院内感染的可能，据统计，加护病房的感染率约为千分之20至30左右。

目前，最常见的院内感染细菌包括绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等。

一般细菌感染的治疗方法为使用抗生素。然而，由于抗生素的滥用，细菌会被筛选而演化出更多的抗药性，目前院内感染已出现越来越多对抗生素具有抗药性的细菌。要治疗感染此种细菌的病患，则必须使用昂贵的新型抗生素，且若细菌的抗药性继续发展，将会致使无有效抗生素可供应用。

鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii，在本说明书中有时简称AB菌)属于格兰氏阴性细菌。一般可在约10％的人的皮肤、呼吸道、肠胃道等处发现鲍氏不动杆菌的存在。鲍氏不动杆菌喜于潮湿温暖的环境生长，因此，可于医院的推车、医疗器具、水槽、病床、床垫、呼吸器装置，甚至于空气中生存。临床上，目前已分离出具有多重抗药性的AB菌，其对健达霉素(gentamicin)、安霉素(amikacin)、达比霉素(piperacillin/tazobactam)、特泯菌(ticarcillin/clavulanate)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、头孢匹罗(cefpirome)、胺曲南(aztreonam)、亚安培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、环丙沙星(ciprofloxacin)及左氧氟沙星(levofloxacin)具抗药性。由于鲍氏不动杆菌容易形成多重抗药性，且可在物体表面存活一段时间，因此成为院内感染的预防及治疗上的难题。

噬菌体(phage、bacteriophage)为病毒的一种，特征在于噬菌体的宿主为细菌，必须在细菌体内才能够生长与复制。噬菌体可分为溶裂型(lytic)和溶原型(lysogenic)，溶裂型噬菌体会感染宿主细菌，在宿主内复制完成后，噬菌体会将细菌溶裂而释出，细菌则破裂死亡。溶原型噬菌体是较温和的噬菌体，可以进行溶裂型或溶原型的生活史，在溶原型的路径中，会与宿主共存。

已有利用噬菌体进行治疗细菌性疾病的前案，例如可见美国专利案第5,688,501号、第5,997,862号等、第6,248,324号、第6,485,902号，分别揭露利用包括噬菌体的医药组合物治疗细菌性疾病、由A型链球菌(Streptococcus A)、造成皮肤感染的细菌、大肠杆菌O157菌株等所引起的疾病；美国专利案第6,121,036号揭露包括一种以上的噬菌体的医药组合物；美国专利案第6,699,701号揭露利用沙门氏杆菌(Salmonella enteritidis)特异性噬菌体进行食品包装的方法，其将该噬菌体涂布至包装材料上，再以包装材料包覆食品(如蔬果)。

上述前案均未揭露鲍氏不动杆菌的噬菌体，亦未揭露以鲍氏不动杆菌的噬菌体减少鲍氏不动杆菌数量而降低院内感染的应用。

发明内容

为克服上述及其它问题，本发明提供一种经分离的鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)噬菌体，其具有选自SEQ ID NO.1、2、3、4的序列或与SEQ ID NO.1、2、3、4的序列同源性为80％以上的序列的一个或多个序列的基因组序列；SEQ ID NO.1、2、3、4的序列如说明书所附的序列表所示。

本领域已知RNA聚合酶基因序列为病毒遗传物质的高度保守区(highly conserved region)，通过比对物种间的RNA聚合酶基因序列同源性，可判断物种亲源性。本发明SEQ ID NO.1至2的序列为脱氧核糖核酸(DNA)序列，其编码该AB菌噬菌体的RNA聚合酶(RNApolymerase)。本发明中，SEQ ID NO.1至2的序列与基因数据库比对，并未获得相同或相似的病毒序列。

本发明的鲍氏不动杆菌噬菌体保藏于德国菌种保存中心，保藏编号为DSM 23599(保藏日2010年5月6日)、DSM 23600(保藏日2010年5月6日)。在一个具体实施方式中，本发明的AB菌噬菌体亦可为上述保藏编号的噬菌体的变异株，其中，该变异株与保藏编号DSM23599、DSM 23600的噬菌体之中任一个具有80％以上的序列同源性。

本发明的AB菌噬菌体特异性感染鲍氏不动杆菌，为溶裂型噬菌体，亦即，本发明的噬菌体可感染宿主细菌AB菌，在细菌细胞内复制及增殖完成后，能够溶裂鲍氏不动杆菌的细胞壁而释出增殖的噬菌体，鲍氏不动杆菌则破裂死亡。藉此，本发明的噬菌体可减少AB菌的数量，而可应用于环境消毒，特别是AB菌的院内感染。

在一个具体实施方式中，本发明的AB菌噬菌体具有迅速吸附鲍氏不动杆菌的能力，潜伏期短，溶裂鲍氏不动杆菌而释出的增殖噬菌体的释放量(burst size)大。

本发明的噬菌体系以双股DNA做为遗传物质，DNA全长约35至40Kb，病毒颗粒外型如第1图所示，具有头部及尾部，头部呈现20面体构造，尾部则具有丝状结构用于附着于宿主细胞表面，病毒颗粒尺寸为头部约60nm，尾部约9至11nm。

在一个具体实施方式中，本发明的AB菌噬菌体具有酸耐受性及碱耐受性，于pH 4以上至pH 12以下的环境条件中保有噬菌体的生物活性。本说明书所述的噬菌体的生物活性意指该噬菌体于环境中仍保有对宿主鲍氏不动杆菌的感染力，能够感染宿主、于宿主细胞内增殖、及/或将宿主细胞溶裂的能力。

在一个具体实施方式中，本发明的AB菌噬菌体在表面活性剂中保有噬菌体的生物活性。

在一个具体实施方式中，该表面活性剂选自阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂或非离子性表面活性剂。

在优选的实施例中，该阴离子性表面活性剂为，举例但非限制，月桂酯硫酸铵、月桂醇聚醚磺基琥珀酸酯二钠、辛基磺酰基琥珀酸酯二钠、软性十二烷基苯磺酸、十二烷基磷酸酯(MAP)、次级烷基磷酸盐(SAS)、椰油酰羟基乙基磺酸钠(SCID)、月桂醇聚醚硫酸酯钠(SLES)、月桂酰肌胺酸钠、月桂酰醚硫酸钠(SLS)、甲基椰油酰基牛磺酸钠等。

在优选的实施例中，该阳离子性表面活性剂为，举例但非限制，十六烷基(Cetyl)三甲基氯化铵、二椰油基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、双酯季铵盐、烷基芐基二甲基氯化铵、牛油烷基二甲基氯化铵(DTDMAC)、咪唑啉季铵盐等。

在优选的实施例中，该两性离子性表面活性剂为，举例但非限制，椰油基咪唑啉甜菜碱(cocoyl lmidazolinium betaine)、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基二甲基甜菜碱、椰油酰两性基二丙酸二钠、月桂酰胺丙基二甲基甜菜碱、烷基两性基丙酸钠(sodiumalkylamphopropionate)、牛脂基二羟乙基甜菜碱等。

在优选的实施例中，该非离子性表面活性剂为，举例但非限制，烷基聚葡萄糖苷(APG)、椰子酰胺(cocoamide DEA)、月桂基胺氧化物、月桂基醚羧酸酯、Triton X(如TX-100、TX-405等)、PEG-150二硬脂酸酯、Tween(如Tween-40、Tween-80等)、Span(如Span-20、Span-80等)等。

在优选的实施例中，该表面活性剂为非离子性表面活性剂。

在优选的实施例中，该表面活性剂为市售产品，特别是清洁剂产品。

由于本发明的噬菌体特异性感染AB菌，其可应用于杀菌的用途或是用于制备治疗由不动杆菌所导致的疾病的药物的用途。在一个具体实施方式中，本发明的AB菌噬菌体适用于照护场所、医疗机构或与医疗相关的研究机构的杀菌用途，将有效量的该噬菌体施用于该照护场所、医疗机构或与医疗相关的研究机构(例如，居家看护、医院或疗养院)，以减少该照护场所、医疗机构或与医疗相关的研究机构中鲍氏不动杆菌的数量。

例如可将本发明的AB菌噬菌体施用于该居家看护、医院或疗养院的环境中，例如，举例但非限制，加护病房、手术室、恢复室、诊疗室、会客室等；或于该医院或疗养院的设备，例如，举例但非限制，插管、血管装置、听诊器、病历、止血带、手套、呼吸器、潮湿瓶、家具、地板、通风口、监视器等的表面。

在优选的实施例中，视施用的标的物而可选择以直接喷洒、间接喷洒、浸泡或直接涂抹于人体皮肤表面的方式施用。

保藏信息

本发明的鲍氏不动杆菌噬菌体保藏于德国菌种保存中心(DSMZ)，M68316的保藏编号为DSM 23587(保藏日2010年5月7日)，ψAB1的保藏编号为DSM 23599(保藏日2010年5月6日)，ψAB2的保藏编号为DSM 23600(保藏日2010年5月6日)。

附图说明

图1为在扫瞄式电子显微镜下观察鲍氏不动杆菌噬菌体所得的图；

图2A为鲍氏不动杆菌噬菌体的DNA电泳图，其中，M为分子量标准品，1至9分别为经HincII、HindIII、SnaBI、SspI、EcoRV、BglII、MluI、XbaI及EcoRI作用的DNA样本；

图2B为鲍氏不动杆菌噬菌体的DNA的限制酶图谱；

图3为鲍氏不动杆菌噬菌体的蛋白质电泳图，其中，M为分子量标准品；

图4为鲍氏不动杆菌噬菌体对于宿主细菌的吸附率；

图5为鲍氏不动杆菌噬菌体的一步生长曲线；

图6为鲍氏不动杆菌噬菌体在表面活性剂中的存活率；

图7A为鲍氏不动杆菌噬菌体在不同温度的存活率；

图7B为鲍氏不动杆菌噬菌体在不同温度及解冻条件的存活率；

图8为鲍氏不动杆菌噬菌体在不同酸碱度的存活率；以及

图9为鲍氏不动杆菌噬菌体在化学物质中的存活率。

具体实施方式

以下为通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域普通技术人员可由本说明书所揭示的内容了解本发明的其它优点与功效。

实施例1(鲍氏不动杆菌噬菌体的分离)

自花莲慈济医院收集的导管洗液、排水系统的废水、未经处理的污水等共87个样本，将样本分别于4℃以5,000×g离心10分钟，将上清液以0.45μm孔径的膜过滤，接着进行溶菌斑测试。

将10μl的样本滤液滴至AB菌的细菌层(bacterial lawns)(制备方法详述于实施例2)，样本滤液中若含有噬菌体，会于细菌层上产生清除区(clear zone)，将其挑出并浸于LB培养基，进行过滤以去除细菌，即可得到高浓度的噬菌体。再将噬菌体稀释后，平涂于LB培养基上形成溶菌斑。进行至少两次的单一溶菌斑分离步骤以得噬菌体纯株。

自样本所分离的鲍氏不动杆菌噬菌体经鉴定后共得到4株AB菌噬菌体，分别命名为ψAB1(保藏编号DSM 23599)、ψAB2(保藏编号DSM 23600)、ψAB3(ψAB2的变异株)、ψAB4(ψAB2的变异株)，其中，ψAB3及ψAB4为ψAB2的变异株，分别与ψAB2具有80％以上的序列同源性。上述4株噬菌体均可感染AB菌，且各自对AB菌的不同菌株(strain)的感染力略有差异。

实施例2(宿主特异性测试)

为测试本发明鲍氏不动杆菌噬菌体的宿主特异性，选用如表1所示的菌种，其中，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii，本说明书中有时简称AB菌)来源：35株系自花莲慈济医院收集，2株来自ATCC(American Type Culture Collection)。

将细菌培养于LB培养基(Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)，37℃，并以混浊度监测细菌生长，于600nm(OD₆₀₀)测定吸光值，OD为1时表示细菌浓度为3×10⁸细胞/毫升。并在1.8％的LB琼脂培养基上覆盖一层含有宿主细菌(例如表1中的菌株)的0.7％的LB琼脂培养基，由此制备宿主细菌层(bacterial lawns)。

将10μl实施例1中所分离出的噬菌体的培养液(噬菌体浓度为10¹⁰PFU/ml)滴至细菌层，将培养基平盘于无菌层流操作台中干燥10分钟，于37℃培养18至20小时，并观察溶菌斑产生与否。

表1

MDRAB：多重抗药性的AB菌，对健达霉素(gentamicin)，安霉素(amikacin)，达比霉素(piperacillin/tazobactam)，特泯菌(ticarcillin/clavulanate)，头孢他啶(ceftazidime)，头孢吡肟(cefepime)，头孢匹罗(cefpirome)，胺曲南(aztreonam)，亚安培南(imipenem)，美罗培南(meropenem)，环丙沙星(ciprofloxacin)，及左氧氟沙星(levofloxacin)具有抗药性。

Amp：安比西林(ampicillin)；Imi：亚安培南(imipenem)；Mer：美罗培南(meropenem)；r：抗药性；s：敏感性。

结果显示，实施例1所分离的AB菌噬菌体于醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、10株E.coli菌株、6株肺炎杆菌(K.pneumoniae)菌株、及3株绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的细菌层上均未产生溶菌斑，且均仅于AB菌的细菌层上产生溶菌斑，证实本发明的噬菌体对于AB菌均具有宿主特异性。实施例1所分离的AB菌噬菌体可在表1所列的AB菌的细菌层上均能产生溶菌斑，证实本发明的噬菌体对于临床分离的多重抗药性AB菌菌株亦具备感染力，其中，ψAB2不仅对ATCC的两个标准菌株具有感染力，对于临床分离的多重抗药性AB菌菌株也具有感染力。

实施例3(以穿透式电子显微镜观察AB菌噬菌体的形态)

将分离所得的ψAB2(浓度为10¹²PFU/ml)滴于经聚乙烯醇缩甲醛涂布的网格(200目的铜网格)上，以2％醋酸铀酰(uranyl acetate)进行负染色，再置于穿透式电子显微镜(购自Hitachi Company，Japan；型号H-7500，操作条件：80kV)下观察，结果如第1图所示。

ψAB2的病毒颗粒系具有头部及尾部，头部呈现20面体构造，尺寸约为60nm；尾部则具有丝状结构，用于附着于宿主细胞表面，尺寸约为9至11nm。

实施例4(PFGE电泳分析)

将200ml的处于对数生长期早期的AB菌培养液以MOI(Multiplicity Of Infection)约为1.0的ψAB2进行感染，以通气培养至AB菌被完全裂解。将培养液离心，取上清液以0.45μm孔径的膜过滤，接着将滤液以Beckman Avanti J-251离心机以18,000rpm离心2小时，沉淀物为噬菌体颗粒，再以1.0ml的TE缓冲溶液(含有1.0mM的EDTA的10mM的Tris-HCl，pH7.0)重新溶解该沉淀物，于BeckmanLE-80K离心机及SW41Ti转盘中，以25,000rpm于4℃超离心2小时将噬菌体带(band)纯化。将纯化所得的噬菌体带透析去除TE缓冲溶液，并贮存于4℃备用。

以20％的聚乙二醇6000浓缩该噬菌体颗粒，以酚/氯仿萃取并以乙醇沉淀以得噬菌体DNA，以限制酶ApaI、BamHI、BanII、BglII、EcoRI、EcoRV、HincII、HindIII、KpnI、MluI、PstI、PvuII、SacI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、及XbaI分别处理后，于0.8％及1.0％的胶体及TAE缓冲溶液中进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)。

结果如第2A图所示，ψAB2的噬菌体DNA仅能被BglII、EcoRI、EcoRV、HincII、HindIII、MluI、SnaBI、SphI、SspI及XbaI作用，分子量标准品(M)为1-kb plus DNA Ladder(购自Invitrogen，CA)。通过限制酶作用片段检测，该噬菌体DNA全长约为35至40kb。该噬菌体DNA的限制酶图谱如第2B图所示，其标示出BglII、EcoRI、EcoRV、MluI及XbaI酶切位点。

实施例5(SDS-PAGE电泳分析)

将纯化的噬菌体颗粒与样本缓冲溶液(含有5％的2-巯基乙醇、2％的十二基硫酸钠、10％的甘油、及0.01％的溴酚蓝的62.5mM的Tris-HCl，pH 6.8)混合，并于沸水浴中加热3分钟，并进行12.5％的SDS-PAGE电泳。

举例来说，第3图显示ψAB2的蛋白质电泳图，该噬菌体具有至少10个不同的蛋白质带，分子量位于21至140kDa，其中，以33kDa的蛋白质的含量最高，极有可能为噬菌体的主要壳蛋白(coat protein)。

实施例6(序列分析)

噬菌体基因组的Sau3A1-部分片段(Ca.15kb)植入(clone)至pUC18，且以得自6株插入株的DNA进行测序。以NCBI package进行序列分析。

经DNA测序及比对结果，获得如序列表所示的SEQ ID NO.1至4的序列。其中，SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2的序列为RNA聚合酶(RNA polymerase)基因序列，可编码该AB菌噬菌体的RNA聚合酶。而SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4的序列系可编码该AB菌噬菌体的头部-尾部的连接部(head-tail connector)。

将SEQ ID NO.1至4的序列与NCBI基因数据库比对，并未获得相同或相似的病毒序列。

举例来说，本发明提出专利申请时，SEQ ID NO.1的DNA序列于NCBI基因数据库比对的结果显示其与phiAB1-LKA1的同源性为39.4％、与phiKMV的同源性为41.3％、与phiPT5的同源性为41.3％、与phiPT2的同源性为41.5％、与phiLKD16的同源性为41.5％的同源性。整体而言，SEQ ID NO.1与基因数据库的DNA序列比对，同源性最高仅约40％相同。

另外，SEQ ID NO.1编码所得的氨基酸序列与phiAB1-LKA1的同源性为30.6％、与phiKMV的同源性为29.4％、与phiPT5的同源性为29.4％、与phiPT2为的同源性29.3％、与phiLKD16的同源性为29.2％。整体而言，以SEQ ID NO.1编码所得的氨基酸序列与基因数据库的蛋白质比对，同源性最高仅约30％相同。

本领域已知RNA聚合酶基因序列为病毒遗传物质的高度保守区，通过比对物种间的RNA聚合酶基因序列同源性，可判断物种亲源性。因此，可由上述比对结果得知，本发明的AB菌噬菌体与现存噬菌体的RNA聚合酶基因序列相似性极低，确实为新型的噬菌体。另外，本案发明人将SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2的序列注册于NCBI基因数据库，取得注册码分别为bankit1192576FJ809932及bankit1192679FJ809933(于本案申请日尚未公开)。

实施例7(杀菌效率)

将AB菌培养至浓度为0.6U的OD₆₀₀值时，将MOI为0.0005的AB菌噬菌体添加至宿主细菌培养液中，于室温下培养。于培养第0、1、2、3、4、5、10、20、30分钟的时间点取样100μl，并以0.9mL的冷LB稀释，以12,000×g离心5分钟，取上清液，测定未吸附至宿主细菌的噬菌体的量。ψAB2对A baumannii ATCC 17978试验的结果如第4图所示。

观察添加噬菌体的宿主细菌培养液，发现培养液于100分钟内自混浊转为澄清，显示噬菌体将宿主细菌完全溶裂掉，证实本发明的杀菌组合物确实可达到杀菌效果。

由第4图可知，约75％的噬菌体颗粒于2分钟内吸附至宿主细菌，约95％的噬菌体颗粒于4分钟内吸附至宿主细菌，于10分钟时达到100％的吸附。

另外，以一步生长曲线(one-step growth curve)测定噬菌体复制曲线，将OD₆₀₀为0.8U的AB菌培养液离心后收集沉淀物，再以0.8ml的LB培养基重新溶散，使浓度为10⁹CFU/ml。将MOI为0.0001的AB菌噬菌体添加至宿主细菌培养液中，置于4℃下30分钟，以使噬菌体吸附至宿主细菌。将混合物以12,000×g离心10分钟，再将包含受感染细菌的沉淀物以20ml的LB培养基重新溶散，于37℃下培养，每隔5分钟取样，并将样本立刻稀释及定量。ψAB2对鲍氏不动杆菌(Abaumannii)ATCC 17978试验的结果如第5图所示。

潜伏期的定义为自吸附(不包含预处理的10分钟)至第一次爆发(burst，噬菌体溶裂细菌而释出)开始，如第5图所示潜伏期为15分钟。以最终噬菌体颗粒量与受感染细菌初始量的比例，计算得到平均释放量约为200PFU/细胞。

以上述相同方法测试本发明ψAB1至ψAB4的感染力，结果显示本发明的噬菌体ψAB1至ψAB4均具有感染快速、潜伏期短、释放量大、杀菌效果迅速等优点。

实施例8(相容性)

以表面活性剂TWEEN 20、TWEEN 80以及Triton X-100(购自Sigma-Aldrich Biotechnology，USA)测试自实施例1分离出的AB菌噬菌体的相容性。已知表面活性剂的常用浓度多为0.1～1wt％的间，因此，将1wt％的上述表面活性剂分别与浓度为5x10⁷PFU/ml的AB菌噬菌体混合，置于室温培养，每隔24小时采样测定噬菌体浓度，如下式计算噬菌体存活率(survival fraction)：

噬菌体存活率＝取样的噬菌体浓度/噬菌体原始浓度

以测定表面活性剂的影响。经测定，包含0.1～1wt％的表面活性剂，均不会对ψAB1至ψAB4的AB菌噬菌体的活性造成影响。其中，ψAB2的结果如第6图所示。于第6图中，AB菌噬菌体于Triton X-100中最稳定，TWEEN 20次之；而在TWEEN 80中虽然AB菌噬菌体的存活率变化较大，但仍然可维持足够感染宿主细菌的活性。且随着时间进展，噬菌体浓度下降的趋势则趋于缓和，再逐渐升高。以变异系数(coefficient of variation)评估，三种表面活性剂的CV值均低于20％，因此，证实噬菌体于此三种表面活性剂中均非常稳定，可维持噬菌体的生物活性。

因此，至少一种ψAB1至ψAB4的AB菌噬菌体纯株可与载剂(例如水、表面活性剂(诸如Triton X-100、TWEEN 20或TWEEN 80等))形成杀菌组合物，用于环境或是仪器消毒。优选地，于组合物中，该AB菌噬菌体的起始含量为1x10⁷至1x10⁹PFU/ml的AB菌噬菌体，该表面活性剂的含量为0.1至2wt％。

实施例9(在不同环境条件下测试由实施例1所分离出的噬菌体的生物活性)

(1)温度

将噬菌体以无菌水稀释至10⁸PFU/ml后，置于不同的温度条件下，分别为4℃、25℃、37℃、42℃、-20℃以及-80℃。在4℃、25℃及37℃的实验中，于培养24小时内每3小时采样测定噬菌体浓度，而后每星期持续追踪至12周，结果如第7A图所示。在-20℃及-80℃的实验则各分为两组，第一组是重复冷冻解冻，追踪时间为12周，第二组只解冻一次，追踪时间为5周，结果如第7B图所示。

(2)酸碱度

将噬菌体以酸性(pH值为4)及碱性(pH值为11)水溶液稀释到噬菌体浓度为10⁸PFU/ml后，在pH值为4.7、7、11的实验中24小时内每3小时测定浓度，而后每周固定追踪一次，连续追踪12周，结果如第8图所示。

(3)化学物质

将噬菌体加入氯仿溶液(0.5％及2％)稀释浓度到10⁸PFU/ml后，在24小时内每3小时测定浓度，而后在0.5％的氯仿溶液的实验中，每周固定追踪一次，连续追踪3周；2％的氯仿溶液的实验则是追踪6周，结果如第9图所示。

(4)干燥处理

将10¹⁰PFU/ml的噬菌体分为A、B两组，A组以蛋白胨(peptone)，B组以无菌水分别将噬菌体浓度稀释10倍之后再以真空离心干燥系统(speed vac)干燥处理，干燥后的A、B两组再分别重新溶解于0.5ml的蛋白胨及0.5ml的无菌水，观察噬菌体在干燥前后的浓度变化，结果如表2所示。

表2

由上述测试结果发现，本发明的噬菌体在低温(-20℃、-80℃、4℃)条件下至少可存活8周以上，且存活率达5％以上。在环境温度(25℃以及37℃)条件下，噬菌体可存活11周以上，且存活率达14.9％以上。而在高温环境(42℃)下追踪2周，噬菌体存活率仍达到14.8％。本发明的噬菌体在碱性(pH＝11)环境下约11周后，噬菌体的存活率可维持约30％；而在酸性(pH＝4)环境下，至第11周仍可测得存活的噬菌体。另外，本发明的噬菌体在0.5％及2％的氯仿溶液中可存活3周以上，且存活率达30％。真空干燥及重新溶解后所测得的存活率高达20％以上。

综上述，对于环境的温度、干湿度、酸碱值及化学物质，噬菌体均具有耐受性，可维持一定的存活率，证实本发明噬菌体的优点，有利于后续应用。

上述实施例仅例示性说明本发明的噬菌体与制备方法，而非用于限制本发明。任何本领域普通技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围如权利要求书所述。

Claims (9)

1.一种经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其具有一个或多个选自SEQ ID NO.1、2、3、4的序列或与SEQ ID NO.1、2、3、4的序列同源性为80％以上的序列的基因组序列。

2.根据权利要求1所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其特异性感染鲍氏不动杆菌。

3.根据权利要求1所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其为溶裂型噬菌体。

4.根据权利要求1所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其于pH 4至12的条件下保有噬菌体的生物活性。

5.根据权利要求1所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其中，该噬菌体为至少一种选自保藏编号为DSM 23599、DSM 23600或其变异株的噬菌体。

6.根据权利要求5所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其中，该噬菌体选自保藏编号为DSM 23599、DSM 23600的噬菌体，且与其变异株具有80％以上的序列同源性。

7.根据权利要求1所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其在表面活性剂中保有噬菌体的生物活性。

8.根据权利要求7所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其中，该表面活性剂为至少一种选自阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂或非离子性表面活性剂的表面活性剂。

9.根据权利要求8所述的经分离的鲍氏不动杆菌的噬菌体，其中，该表面活性剂为非离子性表面活性剂。

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