CN117431221A - 一种鲍曼不动杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 - Google Patents
一种鲍曼不动杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用。本发明从潍坊医学院附属医院污水处理站未经处理的废水中分离并鉴定了一种新的感染鲍曼不动杆菌的裂解性噬菌体Ab_WF01，并对该噬菌体进行了形态学、生物学特性和全基因组分析。此外，本发明使用大蜡螟模型和小鼠模型评估了噬菌体Ab_WF01对CRAB感染的体内治疗效果。结果表明噬菌体Ab_WF01是短尾噬菌体的一个新属，其作为一种新的潜在的治疗剂具有很好的应用前景，为临床应用噬菌体治疗CRAB感染提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌是世界范围内最具挑战性的医院获得性病原体之一，可引起广泛的感染，包括菌血症、肺炎、皮肤和软组织感染以及脑膜炎（Eze EC等，2018）。鲍曼不动杆菌作为ESKAPE（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）病原体之一，因其以无法预见的速度获得多药耐药性（Harding CM等，2018）而被认为是一种全球威胁。在过去的几十年里，碳青霉烯类药物是治疗多药耐药性鲍曼不动杆菌引起的感染的最有效的抗生素。迄今为止，鲍曼不动杆菌已对大多数临床常见的抗生素具有耐药性。多粘菌素B被认为是治疗由耐碳青霉烯类革兰氏阴性菌引起感染的最后的抗生素选择（Nang SC等，2021）。然而，在鲍曼不动杆菌中也检测到了抗多粘菌素B的基因，这就导致了临床上无药物可用，使CRAB（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii）感染很难治疗（Martins-Sorenson N等，2020）。因此，我们迫切需要开发新的抗生素以及其他替代疗法来面对CRAB感染带来的严重威胁（Vukotic G等，2012）。
噬菌体是感染特定细菌的天然杀手，也是生物圈中最丰富的生物实体。自发现以来一直被用于临床，但随着抗生素的引入，噬菌体疗法很快被抗生素的高效性所掩盖，逐渐淡出人们的视线（Brüssow H，2012）。由于全球范围内细菌对抗生素的耐药性不断增加，噬菌体作为一种有希望的抗耐药病原体的抗生素替代品已经引起了相当多的关注。近年来，噬菌体在治疗鲍曼不动杆菌引起的感染方面显示出巨大的治疗潜力（Huang G et al.，2013）。此外，研究人员对耐药鲍曼不动杆菌的裂解性噬菌体进行了研究，发现它有望成为医院临床实践中的一种替代疗法（Schooley RT等，2017）。
迄今为止，所报道的绝大多数噬菌体都具有尾部形态（有尾噬菌体）。根据其形态和基因组类型进行分类（Ackermann HW，2007），这些有尾噬菌体由五个科组成：肌尾噬菌体（长收缩尾）、长尾噬菌体（不收缩长尾）、短尾噬菌体（不收缩短尾），阿克曼噬菌体和代列尔噬菌体（Dion MB等，2020）。其中最后两个科是最近才创建的，与肌尾噬菌体有着相同的形态。
近年来，噬菌体耐药性细菌的出现也时有发生，这是噬菌体治疗的一个主要局限性（Oechslin，2018）。因此，分离新的噬菌体并从体外和体内实验中研究单个噬菌体的特性变得非常有意义（Cooper-CJ等，2016）。
发明内容
为了解决噬菌体耐药的技术问题，申请人从潍坊医学院附属医院周围的废水中分离并鉴定了一种新的感染鲍曼不动杆菌的裂解性噬菌体Ab_WF01，并对该噬菌体进行了形态学、生物学特性和全基因组分析，发现噬菌体Ab_WF01作为一种新的潜在的治疗剂具有很好的应用前景。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种鲍曼不动杆菌噬菌体，被命名为鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_ WF01（Acinetobacter phage Ab_ WF01），所述噬菌体分离自潍坊医学院附属医院周围的废水中，已于2023年12月11日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M20232519。
噬菌体Ab_WF01的电子显微照片显示，噬菌体六边形头部直径约为100nm和长度约为40nm短而不可切割尾部；与足病毒科的成员相似，在形态学上应为尾病毒目短尾噬菌体科。通过生物学特性和全基因组分析，噬菌体Ab_WF01是一种新型的短尾噬菌体科成员。
本发明提供了一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物，包含所述鲍曼不动杆菌噬菌体。
在一些实施方案中，所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物还包含其他噬菌体，形成噬菌体复配。
在一些实施方案中，所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物还包含药用辅料，例如SM缓冲液、PBS缓冲液。
本发明还提供了所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体或所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物用于抑制或杀伤鲍曼不动杆菌的应用。所述鲍曼不动杆菌包括人体的鲍曼不动杆菌和或非人体的鲍曼不动杆菌；非人体的鲍曼不动杆菌，例如可以是水体中的鲍曼不动杆菌，或者附着于其他物体的鲍曼不动杆菌。
本发明还提供了所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体或所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物用于制备治疗鲍曼不动杆菌感染的药物的应用。
本发明还提供了一种治疗鲍曼不动杆菌感染的药物，包含所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体或所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物。
在一些实施方案中，所述药物为体外治疗药物或体内治疗药物。
在一些实施方案中，所述鲍曼不动杆菌感染为CRAB（Carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii）感染。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1、从潍坊医学院附属医院周围的废水中分离并鉴定了一种新的感染鲍曼不动杆菌的裂解性噬菌体Ab_WF01，并对该噬菌体进行了形态学、生物学特性和全基因组分析，确定噬菌体Ab_WF01是一种新型的短尾噬菌体科成员。
2、本发明使用大蜡螟模型和小鼠模型评估了噬菌体Ab_WF01对CRAB感染的体内治疗效果，结果表明噬菌体Ab_WF01是短尾噬菌体的一个新属，其作为一种新的潜在的治疗剂具有很好的应用前景，为临床应用噬菌体治疗CRAB感染提供理论依据。
附图说明
图1为噬菌体Ab_WF01的分离及形态学。其中A为噬菌体Ab_WF01在双层琼脂板上的噬菌斑。B为透射电镜观察噬菌体Ab_WF01的形态；用2%磷钨酸对噬菌体进行阴性染色；比例尺表示200nm。C为利用斑点试验鉴定噬菌体Ab_WF01的宿主谱；CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌菌株，Kp：耐药肺炎克雷伯菌，MRSA，CRPA：耐碳青霉烯铜绿假单胞菌，CRE：耐药大肠杆菌。
图2为噬菌体Ab_WF01生物学特性。其中A为噬菌体Ab_WF01的最佳MOI为0.001；B为噬菌体Ab_WF01对CRAB的一步生长曲线；C为噬菌体Ab_WF01的热稳定性，噬菌体在不同温度下孵育30min；D为噬菌体Ab_WF01在不同pH值下的稳定性；E为噬菌体Ab_WF01对氯仿的敏感性，在37℃条件下，用不同体积的氯仿处理噬菌体30min，采用双层琼脂法测定噬菌体滴度；F为在MOI = 0.001时，噬菌体Ab_WF01感染CRAB后的裂解动力学，每隔一小时在OD600下测量培养物的光密度，持续12小时，结果以三次生物学重复的平均值±SD表示。
图3为噬菌体Ab_WF01基因组特征及比较分析。噬菌体Ab_WF01基因组图谱，利用CGView server构建并可视化Ab_WF01的环形基因组，最内圈展示GC skew，中间环表示GCcontent，最外两个圆圈表示噬菌体Ab_WF01的预测orf，箭头表示转录方向，不同的CDS代表不同的功能:形态发生蛋白，宿主裂解蛋白，DNA复制和代谢蛋白，假设蛋白和噬菌体蛋白。
图4为噬菌体Ab_WF01治疗后大蜡螟幼虫的存活曲线。在大蜡螟右腿倒数第二段注射10 μL CRAB或PBS(阴性对照)；30min后，每只幼虫分别用10 μL MOI为0.001的噬菌体Ab_WF01或SM缓冲液(噬菌体对照)处理；每8 h对幼虫存活率进行观察，共48 h。每组10只幼虫，重复试验3次；生存率用log-rank Mantel-Cox检验绘制；使用GraphPad Prism 8分析数据。
图5为噬菌体Ab_WF01治疗CRAB感染小鼠的安全性评价。小鼠腹腔注射1×107CFU/mL CRAB, PBS作为未感染对照。感染1 h后，分别腹腔注射噬菌体Ab_WF01 (MOI = 0.001，噬菌体对照)、SM缓冲液(载体对照)或IPM (5 mg/kg)。对照组在相同条件下给予SM缓冲液。治疗3天后对小鼠实施安乐死，取肺、肝、脾组织。图5中A为连续7 d，每天监测小鼠存活率。采用细胞因子ELISA法测定给药后3 d小鼠血清中(图5中B) TNF-α和(图5中C) IL-6细胞因子水平(n=3)。图5中D为小鼠器官中细菌载量，图5中E为小鼠器官中噬菌体滴度。治疗3 d后，取各组小鼠肺、肝、脾均质。肺、肝和脾的细菌CFU用10倍稀释的组织匀浆定量。采用双层琼脂法测定噬菌体Ab_WF01滴度。
图6为各组小鼠主要脏器的组织病理学特征。将被噬菌体处理的小鼠的肺、肝脏和脾脏取出，立即置于4%多聚甲醛中。组织切片用H&E染色，然后在200倍显微镜下观察；有少量粒细胞浸润；血管周围多发水肿伴少量淋巴细胞浸润；组织内可见多灶性出血；肝实质内肝细胞坏死；中央静脉、门静脉周围和肝实质内广泛的肝细胞变性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。
实施例1，噬菌体分离纯化：
污水样本采集自潍坊医学院附属医院污水处理站。将污水样品以5000g离心10分钟去除杂质，然后用0.22μm微孔滤膜（Biosharp Biotechnology）过滤去除细菌。将CRAB置于37℃培养箱至OD600=0.6（1×108CFU/mL）。将10 mL污水滤液与10 mL液体LB混合均匀，然后向混合物中添加200μL CRAB菌液。在37℃培养过夜后，将培养的溶液以5000g离心10分钟取上清，使用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到最初的噬菌体分离液。用斑点法检测有无噬菌斑存在，纯化噬菌体用双层琼脂法至少三次，直到显示出单一斑块形态。
实施例2，噬菌体生物学特性：
（1）噬菌体形态：
通过透射电子显微镜检测噬菌体的形态。将噬菌体Ab_WF01附着在涂有碳的铜格栅上，并用2%磷钨酸负染色5min。使用透射电子显微镜（Hitachi HT7700，Tokyo，Japan）在80kV下观察噬菌体形态。
如图1中A所示在双层板上观察到形成大小均匀2-3mm圆形透明斑块，并观察到斑块周围有光晕。噬菌体Ab_WF01的电子显微照片显示，噬菌体六边形头部直径约为100nm和长度约为40nm短而不可收缩尾部（图1中B）。根据这些形态学特征和国际病毒分类委员会（ICTV）的规定，噬菌体Ab_WF01与足病毒科的成员相似，在形态学上应为尾病毒目短尾噬菌体科。
（2）噬菌体宿主范围：
耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌菌株（CRAB）、耐药肺炎克雷伯菌（Kp）、MRSA、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（CRPA）和耐药大肠杆菌（CREC）由山东省潍坊医学院附属医院临床实验室提供。我们从住院患者的血液中分离出细菌分离株，然后将样品涂在哥伦比亚血液琼脂平板（CBAP；mlbio，中国上海）上，在37℃的培养箱中孵育过夜。将CBAP上的一个单菌落转移到5mL LB液体培养基中，然后在37 ℃下、220 rpm振荡培养。利用细菌通用引物F27和R1492扩增16S rRNA基因对菌株进行鉴定。使用来自NCBI数据库的基本局部比对搜索工具（BLAST）进行序列比对。将菌株储存在含有40%甘油的LB培养基中，并在-80℃下长期保存。
利用斑点试验通过对其他几种耐药临床分离株（包括金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌）的检测来确定噬菌体的宿主范围。步骤如下：将100μL指数期的临床分离株与融化的0.7%LB琼脂混合，然后迅速倒入LB琼脂板上。凝固后，将10μL稀释的噬菌体溶液（106 PFU/mL）涂布在每个细菌平板上，在37℃下培养过夜后，观察有无细菌裂解的清晰区域。斑点试验发现，噬菌体Ab_WF01对CRAB具有裂解作用（图1中C）。
（3）最佳感染复数：
为了确定噬菌体的最佳感染复数（MOI），在SM缓冲液中制备了一系列10倍稀释的噬菌体。利用双层琼脂法将100μL不同浓度的噬菌体分别与100μLCRAB混合，并在37℃下培养过夜后对噬菌斑进行计数，然后计算为每毫升斑块形成单位（PFU/mL）。
为了评估噬菌体Ab_WF01能够有效抑制宿主细胞生长的最低浓度，我们用不同MOI的Ab_WF01感染CRAB，并利用双层琼脂法测定噬菌体的滴度。图2中A结果所示，当MOI为0.001时，噬菌体滴度达到最高水平，约为2×108PFU/mL。因此，我们在以后的实验中选择了MOI=0.001作为标准剂量。
（4）一步生长曲线：
将MOI为0.001的噬菌体与CRAB混合，37℃孵育15分钟。将孵育后的样品12000rpm离心10分钟弃去上清液，用无菌LB洗涤沉淀两次，离心后的颗粒重悬于20mL LB中，然后置于37℃摇床、220rpm振荡。每隔10分钟收集样品直至120分钟用双层琼脂法测定噬菌体滴度。采用文献所述方法计算潜伏期和爆发力大小（Kropinski AM，2018）。
为了研究噬菌体感染的潜伏期和爆发力大小，通过一步生长曲线法测定了噬菌体Ab_WF01的感染动力学。一步生长曲线结果显示Ab_WF01潜伏期约为10分钟。根据潜伏期内释放的噬菌体与最初感染的细菌的比例计算，噬菌体的爆发力大小约为每个感染细胞151PFU（图2中B）。
（5）热稳定性和pH稳定性：
无菌条件下取6个1.5 mLEP管分别添加1mL噬菌体，并在25°C、37°C、50°C、60°C、70°C和80°C水浴锅孵育1小时。孵育结束后，将噬菌体样品置于冰上缓慢冷却。然后用双层琼脂法测定噬菌体的滴度。通过向盛有LB培养基的每个试管中加入浓硫酸和氢氧化钠将pH调节为0至14。然后向每个试管中加入500μl噬菌体，并在37℃下孵育1小时，将噬菌体样品中和至pH 为7，用0.22μm过滤器过滤除菌后双层琼脂法检测不同pH的噬菌体的滴度。
为了评估噬菌体Ab_WF01的稳定性，我们在不同的温度和pH值下处理噬菌体。如图2中C所示，噬菌体Ab_WF01在25℃时表现出最高的活力，并且噬菌体的稳定性随着温度的升高而降低。当在37℃下孵育时，噬菌体滴度下降到约35%，当温度达到70℃时完全失去活力。在pH稳定性测试试验中，噬菌体在pH为5-10的范围内显示出最佳活性。pH的进一步增加或降低导致噬菌体Ab_WF01的活性降低，在pH=11和pH=12时活性急剧下降，在pH为1、2、3、13和14时没有活性（图2中D）。
（6）氯仿敏感性：
噬菌体的蛋白质外壳中的脂质在将病毒基因组递送到宿主细胞中起关键作用（Peralta B等，2013）。为了测试噬菌体Ab_WF01病毒粒子是否含有脂质，用不同浓度的氯仿（0%、1%、2%或5%）在37℃下处理噬菌体30分钟。发现不同浓度的氯仿处理后，噬菌体Ab_WF01的活力没有显著变化（图2中E）。结果表明，噬菌体颗粒中不存在脂质，并且发现噬菌体耐受氯仿。
（7）宿主细胞裂解活性检测：
将宿主细菌（CRAB）在LB培养基中培养，并用MOI为0.001的噬菌体感染。在37℃摇床、220rpm振荡培养，每隔1小时取样1 mL，用OD600nm的分光光度法检测细菌浊度，持续12小时。试验重复三次。
使用浊度测定法每隔1小时测量噬菌体Ab_WF01对CRAB的裂解动力学。在对照中，未感染噬菌体的细菌培养物的吸光度迅速增加，培养9小时后达到1.5 OD600nm，然后进入平台期。但与对照组相比，当用噬菌体Ab_WF01感染时细菌生长受到显著抑制（图2中F），这表明噬菌体Ab_WF01对CRAB具有较高的抑菌效率。
实施例3，噬菌体全基因组测序与生物信息学分析：
根据制造商的说明书，使用TIANamp病毒DNA/RNA试剂盒（Tiangen，Beijing，China）从噬菌体中提取Ab_WF01的基因组DNA。在Sangon Biotech（上海）有限公司的Illumina测序平台上进行全基因组测序。SPAdes软件用于从头基因组组装（Bankevich etal.，2012）。开放阅读框架（ORF）通过使用RAST的快速注释进行注释（Aziz-RK等，2008）。使用tRNAscan SE对基因组序列中的tRNA进行预测（Chan-PP等，2019）。将噬菌体基因组中的毒力因子和抗生素抗性基因与VFDB数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）和CARD数据库(https://card.mcmaster.ca/)进行比对。噬菌体基因组的环形图谱由CGview服务器构建（Grant JR和Stothard P，2008）。对于全基因组分析，使用BLASTn比对基因组序列并将其与其他噬菌体的基因组序列进行比较，并使用Artemis比较工具（Carver TJ等，2005）比较Ab_WF01和vB_AbaP_46-62_Aci07的噬菌体基因组。
噬菌体Ab_WF01的全基因组序列大小为41317bp，GC含量为39.12%（图3）。在噬菌体Ab_WF01基因组中发现51个开放阅读框（ORF）。ORF的编码密度为93.93%，共覆盖38008bp。ORF的最大长度为3099bp，最小长度为114bp，这些ORF分别编码噬菌体DNA驱体组分和假定蛋白。在噬菌体Ab_WF01的基因组中没有检测到tRNA基因，这表明该噬菌体依赖于宿主的翻译机制。此外，噬菌体基因组中没有耐药或毒力基因，表明该噬菌体几乎没有介导抗生素抗性基因水平转移的能力。通过使用BLASTX对NCBI数据库进行搜索，约80.4%（51个ORF中的41个）的预测ORF被鉴定为已知的假定功能蛋白。此外，其他10个ORF与数据库中的蛋白质不匹配，它们被归类为假定蛋白质。Ab_WF01功能基因注释被预测为五组：参与DNA复制/修饰、代谢、裂解蛋白、DNA包装和噬菌体结构相关蛋白。
在NCBI数据库中，用BLAST对噬菌体Ab_WF01与其他噬菌体的相似性进行了比较分析，结果表明，鲍曼不动杆菌噬菌体vB_AbaP_46-62_Aci07（GenBank编号：NC_048076.1）与噬菌体Ab_WF_01的相似性最高，显示出93.10%的同一性和88%的查询覆盖率。为了确定噬菌体Ab_WF01和最高相似性的噬菌体vB_AbaP_46-62_Aci07在基因组上的同源区，我们使用Artemis（ACT）对两个噬菌体的全基因组序列进行了比对。在Ab_WF01和vB_AbaP_46-62_Aci07基因组之间的平均核苷酸同一性（ANI）是91.87%（由ANI计算，http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/）。
实施例4，大蜡螟幼虫感染模型：
大蜡螟是评估新型抗菌剂对鲍曼不动杆菌的活性和毒性的良好模型（Tao Y etal.，2021）。试验前，在黑暗环境下将大蜡螟幼虫在90mm培养皿中于37°C饥饿24小时。随机选择50只幼虫（体重200-250mg），在注射前75%酒精消毒。用10μL微升注射器在幼虫右侧最后一个前腹足注射10μL CRAB（1×108CFU/mL），10μL PBS作为对照，每组分为10只。为了检测噬菌体治疗的效果，注射CRAB 30分钟后，将10μL噬菌体以MOI= 0.001注射到幼虫最后一个右前体中，同时注射10μL SM缓冲液作为对照。在37°C的黑暗中培养，每8小时监测一次幼虫的存活率直至48小时。当幼虫对注射器针头的接触没有反应时，认为已经死亡。上述实验重复三次。
我们使用大蜡螟幼虫作为感染模型来初步评估噬菌体Ab_WF01对CRAB的治疗效果。如图4所示，CRAB感染组中的所有幼虫在32小时时全部死亡，而使用噬菌体治疗后降低了幼虫的死亡率。与未处理的对照组相比，噬菌体处理组的幼虫在48小时的存活率在统计学上有显著提高（p<0.01）。噬菌体对照组和缓冲液（PBS+SM）对照组的存活率没有显著差异，表明噬菌体Ab_WF01的安全有效性。而噬菌体对照组的存活率与缓冲液（PBS+SM）对照组相同，表明噬菌体Ab_WF01的研究是安全的具有可行性。
实施例5，小鼠感染模型中的噬菌体治疗：
SPF级6-8周C57BL/6j小鼠（随机雄性/雌性）购自济南朋悦实验动物有限公司。
（1）小鼠感染模型中的噬菌体治疗：
为了评估噬菌体在体内治疗的安全性和有效性，60只小鼠腹腔注射100μL CRAB（1×108CFU/mL），注射100μL PBS作为阳性对照，每组10只小鼠。感染2小时后，腹腔注射100μL噬菌体Ab_WF01（MOI =0.001）或亚胺培南（IPM；5 mg/mL）到感染组，并注射100μL SM缓冲液作为阴性对照。PBS对照组的小鼠仅给予噬菌体。实验中使用的所有小鼠均腹腔注射环磷酰胺（200mg/kg）以48小时间隔免疫连续7天，每天观察各组小鼠的死亡率。为了检测细胞因子，在第1天对小鼠实施安乐死后立即从小鼠的心脏取血。将血清上清液储存在−80°C下，用于细胞因子分析。通过ELISA试剂盒（Solarbio）检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的浓度。
（2）细菌清除和噬菌体计数：
为了测定CRAB感染后第3天小鼠肝脏、肺脏、脾脏中的细菌数，在对小鼠实施安乐死后立即收集各组的三种器官样本：肺、肝和脾。将每个器官用1mL PBS匀浆，然后在PBS中连续稀释。分别用平板计数法和双层琼脂法测定器官匀浆中细菌数和噬菌体的滴度。
（3）小鼠器官组织的组织学：
为了评估小鼠肝脏、肺脏和脾脏的病理组织学特征，在第3天处死小鼠，并立即收集各种器官（肺、肝和脾）。将这些样品在4%多聚甲醛中固定24小时，并在分级乙醇中脱水并包埋在石蜡中。将固定组织切3μm厚的组织切片后进行H&E染色。用光学显微镜观察小鼠器官的病理变化。
（4）统计分析：
所有数据均使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。通过非配对t检验确定两组之间差异的显著性，通过方差分析确定多组之间差异显著性。当p＜0.01时，这些值被认为是差异显著。
（5）噬菌体Ab_WF01在小鼠感染模型中的治疗效果：
为了进一步评估噬菌体Ab_WF01的治疗效果和安全性，我们通过腹腔内注射噬菌体来评估其对CRAB感染小鼠的存活率、组织学特征、器官（肺、肝或脾）中细菌数量和噬菌体滴度以及免疫原性。如图5中A所示，所有仅感染CRAB的小鼠在感染后4天内全部死亡。相比之下，用噬菌体处理的感染小鼠有60%存活下来。经治疗5天后，噬菌体治疗组的存活率为60%高于抗生素治疗组（30%）。此外，阴性对照组（仅给予PBS或Ab_WF01）中的所有小鼠在7天后仍然存活。与IPM治疗组相比，噬菌体治疗组的小鼠具有更好的治疗效果，这表明噬菌体治疗可以拯救CRAB感染的小鼠。
为了确定血清炎症细胞因子在噬菌体治疗中的作用，我们检测了噬菌体治疗后小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平（图5中B和图5中C）。发现仅细菌治疗组的血清TNF-α和IL-6水平显著高于噬菌体治疗组（p<0.01），这表明噬菌体治疗可以减少CRAB感染引起的促炎反应。尽管IPM处理也能降低TNF-α的浓度（p<0.05），但其降低水平低于噬菌体处理（p<0.01）。此外，将仅噬菌体处理组的TNF-α和IL-6水平与用SM缓冲液或单独噬菌体处理的小鼠进行比较，IPM处理的小鼠高于噬菌体处理组（p<0.05）。结果表明，噬菌体Ab_WF01对IPM具有良好的替代作用。
噬菌体Ab_WF01可以拯救CRAB感染小鼠的死亡，推断噬菌体可以降低细菌载量。为了证明这一假设，在治疗第3天后，检测了小鼠的肺、肝和脾中的细菌载量和噬菌体的滴度。如图5中D，在仅含细菌的治疗组中，小鼠肺、肝和脾的细菌数量显著高于其他治疗组（p<0.01）。与未处理组相比，IPM处理组小鼠的细菌数量较低，但高于噬菌体处理组小鼠。此外，噬菌体治疗组的载量与对照组之间没有显著差异。结果表明，噬菌体Ab_WF01具有比IPM更好的杀菌效果。我们又测定了小鼠肺、肝和脾中的噬菌体滴度，如图5中E所示，噬菌体治疗组小鼠肺、肝和脾的噬菌体滴度显著高于仅细菌治疗组和IPM治疗组（p<0.01），IPM组和仅细菌治疗组以及仅缓冲液组均未检测到噬菌体。这些结果与细菌载量一致，表明使用噬菌体Ab_WF01治疗后细菌数量减少。
如图6所示，将被噬菌体处理的小鼠的肺、肝脏和脾脏取出，立即置于4%多聚甲醛中。组织切片用H&E染色，然后在光学显微镜下观察（200X）。有少量粒细胞浸润；血管周围多发水肿伴少量淋巴细胞浸润；组织内可见多灶性出血；肝实质内肝细胞坏死；中央静脉、门静脉周围和肝实质内广泛的肝细胞变性。
最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1. 一种鲍曼不动杆菌噬菌体，其特征在于，被命名为鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_ WF01（Acinetobacter phage Ab_ WF01），所述噬菌体分离自潍坊医学院附属医院周围的废水中，已于2023年12月11日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M20232519。
2.一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌噬菌体。
3.如权利要求2所述的一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物，其特征在于，还包含其他噬菌体，形成噬菌体复配。
4.如权利要求2或3所述的一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物，其特征在于，还包含药用辅料。
5.权利要求1所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体，或权利要求2-4任一项所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物用于抑制或杀伤鲍曼不动杆菌的应用。
6.权利要求1所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体，或权利要求2-4任一项所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物用于制备治疗鲍曼不动杆菌感染的药物的应用。
7.一种治疗鲍曼不动杆菌感染的药物，其特征在于，包含权利要求1所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体，或权利要求2-4任一项所述一种鲍曼不动杆菌噬菌体组合物。
8.如权利要求7所述的一种治疗鲍曼不动杆菌感染的药物，其特征在于，所述药物为体外治疗药物或体内治疗药物。
9. 如权利要求7或8所述的一种治疗鲍曼不动杆菌感染的药物，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌感染为CRAB（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii）感染。
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