CN112159798B - 一株针对高毒力肺炎克雷伯氏菌的新噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株针对高毒力肺炎克雷伯氏菌的新噬菌体及其应用，属于微生物领域。所述噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2020420。本发明的噬菌体具有优良的裂解(杀灭)肺炎克雷伯氏菌的能力，并同时具有优良的降低肺炎克雷伯氏菌毒力的能力。

Description

一株针对高毒力肺炎克雷伯氏菌的新噬菌体及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一株新分离的针对高毒力肺炎克雷伯杆菌具有杀灭活性的噬菌体及其减弱肺炎克雷伯氏菌毒力的应用。
背景技术
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia，KP)是一种致病性较强的革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科克雷伯属，是院内感染的常见菌。近几年来，高毒力的肺炎克雷伯杆菌(hypervirulent Klebsilla pneumoniae，hvKP)先后在世界各地都有报道。
与普通的肺炎克雷伯杆菌(“classic”Klebsilla pneumoniae，cKP)相比， hvKP不但能感染免疫力低下的患者，还能感染无基础疾病的人群；能导致严重的呼吸道感染，肺炎，肝脓肿，脓毒血症等。该菌通常呈高黏性状态，在琼脂平板上生长产生的黏液丝可以牵拉5mm以上。由于黏液的产生和耐药型高毒力肺炎克雷伯氏菌的增多，导致治疗难度加大，给人类的生命安全带来了极大的威胁，因此急需一种方法解决此问题。
噬菌体(bacteriophage，phage)是细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的天敌。自20世纪20年代初以来，噬菌体治疗已被应用于临床实践。由于抗生素的滥用，病原菌出现了严重的耐药性，出现了多重耐药甚至全耐药的菌株；而噬菌体作为天然的杀菌物质，在杀菌治疗和预防方面都有着极大的潜力。与抗生素相比，噬菌体的治疗对目标菌具有高度特异性和有效性。产生的多糖解聚酶还能针对性的降解细菌产生的多糖化合物，从而对生物膜起到有效地清除作用。
目前已有多种肺炎克雷伯氏菌噬菌体被分离得到，为肺炎克雷伯氏菌感染的预防和治疗提供了多种选择，目前报道的肺炎克雷伯氏菌噬菌体多针对 cKP，且肺炎克雷伯氏菌对噬菌体容易产生抗性，导致噬菌体无法长期维持有效。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一株噬菌体，命名为Klebsiella pneumonia phage vB_KpnP_cmc20193，所述噬菌体保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为：2020年8月14 日，保藏号为CCTCC NO：M 2020420。
本发明还提供了前述噬菌体在用于杀灭肺炎克雷伯氏菌中的用途。
进一步的，所述肺炎克雷伯氏菌的荚膜型为K2。
优选地，所述肺炎克雷伯氏菌为高毒力肺炎克雷伯氏菌。
本发明还提供了前述噬菌体在用于降低肺炎克雷伯氏菌毒力的中的用途。
进一步的，所述肺炎克雷伯氏菌的荚膜型为K2。
优选地，所述肺炎克雷伯氏菌为高毒力肺炎克雷伯氏菌。
本发明还提供了一种针对肺炎克雷伯氏菌的抗菌药物，所述药物以前述的噬菌体为活性成分。
进一步的，所述肺炎克雷伯氏菌的荚膜型为K2；
优选地，所述肺炎克雷伯氏菌为高毒力肺炎克雷伯氏菌。
优选地，所述药物是裂解肺炎克雷伯氏菌或降低肺炎克雷伯氏菌毒力的药物。
本发明还提供了前述噬菌体在用于制备针对肺炎克雷伯氏菌的抗菌药物中的用途。
进一步的，所述肺炎克雷伯氏菌的荚膜型为K2。
优选地，所述肺炎克雷伯氏菌为高毒力肺炎克雷伯氏菌。
进一步的，所述药物是裂解肺炎克雷伯氏菌或降低肺炎克雷伯氏菌毒力的药物。
本发明的有益效果包括：
1)本发明的噬菌体对肺炎克雷伯氏菌具有强大的感染和杀灭作用，其感染高毒力肺炎克雷伯氏菌的爆发期为30min，爆发量高达245PFU/Cell。
2)目前未见关于噬菌体处理后弱化肺炎克雷伯氏菌毒力的报道，而本发明的噬菌体对肺炎克雷伯氏菌具有弱化毒力的作用，当高毒力肺炎克雷伯氏菌对本发明的噬菌体产生抗性后，其细胞毒力随之大幅度降低，达到几乎对细胞无害的程度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193噬菌斑图片。
图2是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193扫描电镜图。
图3是pH对本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193活性影响结果图。
图4是温度对本申请肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193活性影响结果图。
图5是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193吸附曲线(上部分)及一步生长曲线图(下部分)。
图6是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193大蜡螟治疗效果结果图。
图7是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193降低宿主菌毒力效果结果图。
具体实施方式
实施例涉及的菌株试剂及培养基：
除了实施例6外，其余实施例所用宿主菌均为高毒力肺炎克雷伯氏菌临床株hvKpLS8。
LB(Luria broth)液体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加 ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
0.7％LB半固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉70g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
1.5％LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
SM缓冲液(1L)：称取6.055gTris-HCI(pH为7.5)定容至100ml，加入5.800g NaCl，2.000g MgSO4后，加入ddH2O定容至1L。
1mol/L无菌CaCl2溶液(1L)：称取111g CaCl2固体，倒入烧杯加水溶解，将溶解液倒入1L容量瓶并用ddH2O定容至1L，121℃高压灭菌20min，冷却备用。
实施例1噬菌体的分离及制备
将宿主菌划线接种于1.5％LB琼脂培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于5mLLB液体培养基中，37℃振荡培养5-6h后作为宿主菌培养物备用。
采集四川省成都市双流区某污水处理厂污水，将污水10000rpm离心20min，将上清液与宿主菌液共同培养过夜；然后取培养物以10000rpm离心 30min，取上清，用0.22μm滤膜过滤，形成噬菌体原液。
吸取噬菌体原液，将其与宿主菌混合，双层板法倒板，37℃恒温过夜培养。第二天选取长有噬菌斑的平板，选取直径较大且孤立的噬菌斑，梯度稀释后与相应宿主菌菌液混合，双层平板法倒板。重复此步骤至少三次，得到大小比较均一的噬菌斑。
用双层平板法检测的噬菌体，结果如图1所示，分离出的噬菌体在平板上形成中间透亮，周围有较大晕环的噬菌斑。
分离得到的噬菌体命名为Klebsiella pneumonia phage vB_KpnP_cmc20193(简称vB_KpnP_cmc20193)，保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为：2020 年8月14日，保藏号为：CCTCC NO：M2020420。
实施例2噬菌体的扩增和纯化
取实施例1备用的噬菌体0.01mL和实施例1备用的宿主菌培养物0.1ml于试管中作用10min，加入10ml LB液体培养基，37℃培养6h，4℃、12000rpm离心20min，取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液即为噬菌体裂解液。
在噬菌体裂解液中加入DNaseI、RNase A至终浓度各为1μg/ml，温育 30min，加入终浓度为1mol/L的NaCl冰浴1h，4℃、12000rpm离心10min，取上清加入终浓度为10％的PEG8000，4℃过夜，然后4℃、12000rpm离心10min，弃上清，倒置5min，加入SM缓冲液重悬，加入等体积的氯仿温和震荡30s，4℃、 5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，得到纯化的噬菌体悬液。
采用双层平板检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.01mL与宿主菌液0.1mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养8h左右，对每个平板进行噬菌斑计数。选取噬菌斑在100-200左右的平板，根据稀释倍数计算得到噬菌体初始浓度即得到噬菌体效价。噬菌体效价为1.3×1012PFU/ml。
实施例3噬菌体vB_KpnP_cmc20193电镜观察
取噬菌体vB_KpnP_cmc20193做电镜观察，具体操作步骤为：加10μl样本滴在铜网上，待其沉淀15min，用滤纸吸去多余液体，用2％的磷钨酸(PTA) 染色1-2min，干燥后使用透射电镜(FEI Tecnai G2 F20)观察：观察结果如图 2所示，头部呈正二十面体。
根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类-国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_KpnP_cmc20193属于肌尾噬菌体(Myoviridae)。
实施例4噬菌体vB_KpnP_cmc20193的酸碱和温度耐受性实验
1.酸碱度耐受性
取12份0.1ml实施例1分离得到的噬菌体分别放入pH为1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12的SM缓冲液(0.9ml)中，37℃作用1h，然后用双层法(同实施例2)测定反应后噬菌体的效价。
检测结果如图3所示：肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnP_cmc20193在pH 值为4-10的环境中效价变化较小，活性基本不变。当环境pH＞11或pH＜3时，噬菌体的活性随酸、碱性的增强而下降。pH＝12或pH＝2时，噬菌体效价为0，全部失活，因此可知该噬菌体的最适pH为4～10。
2.温度耐受性
将五只含有1ml实施例1中的噬菌体原液，分别在37℃、40℃、50℃、60℃、 70℃条件下作用1h，然后测定噬菌体效价。
检测结果如图4所示：该噬菌体在70℃环境下失去活性。
本实施例的结果说明，噬菌体vB_KpnP_cmc20193具有较宽的酸碱和温度耐受范围。
实施例5噬菌体vB_KpnP_cmc20193的吸附能力和一步生长曲线测定
1.吸附能力
将宿主菌株培养至对数生长期，在37℃条件下混合适当比例(MOI＝0.1) 的噬菌体vB_KpnP_cmc20193。分别培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10分钟后，取100μl，立即13000g离心30s。取上清液10μl，双层平板法确定效价。
结果如图5所示，此噬菌体在十分钟内可以达到90％以上的吸附效果，证明vB_KpnP_cmc20193对肺炎克雷伯氏菌的吸附效率较高。
2.一步生长曲线
将宿主菌与过量的实施例1中的噬菌体混合(MOI＞10)，37℃温浴10min 后12000rpm离心1min，弃上清，LB液体培养基洗涤沉淀1次。用10ml预热的 LB液体培养基重悬沉淀，迅速置于37℃摇床中振荡培养，从0min开始，每隔 10min取100μl培养物，4℃、10000rpm离心2min去除细菌，取上清稀释至适当浓度(适当浓度即在平板上形成30-300个噬菌斑的浓度)，双层法测定噬菌体效价，共监测80min。以取样时间为横坐标，噬菌体的效价的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线得出噬菌体的暴发期、爆发量。一步生长曲线结果如图5所示，其感染宿主菌暴发期为30min，爆发量为245PFU/Cell。
本实施例的结果表明，噬菌体vB_KpnP_cmc20193感染高毒力肺炎克雷伯氏菌能力强。
实施例6噬菌体vB_KpnP_cmc20193宿主谱分析
收集了来自上海、浙江丽水和四川成都的20株高毒力肺炎克雷伯氏菌，用实例1的噬菌体进行宿主谱分析，具体操作如下：分别取20株高毒力肺炎克雷伯氏菌过夜培养物0.1ml,0.1ml，加入45℃左右的0.7％LB半固体培养基5ml，均匀铺在预先制备好的固体1.5％LB固体培养基上，然后将每个平板平均分成四个区域，其中三个区域取5μl效价调整为1010PFU/ml上述备用的噬菌体滴加在表面，另一个区域滴加即生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”。
结果如表1所示：肺炎克雷伯噬菌体vB_KpnP_cmc20193能裂解K2荚膜型的高毒力肺炎克雷伯氏菌，不能裂解K1、K57、K64和K84型肺炎克雷伯氏菌，表明vB_KpnP_cmc20193对K2型肺炎克雷伯氏菌具有特异性的裂解能力。
表1.噬菌体vB_KpnP_cmc20193的宿主谱
Figure BDA0002734214460000061
Figure BDA0002734214460000071
实施例7噬菌体vB_KpnP_cmc20193对肺炎克雷伯氏菌感染的治疗实验
取80只重为500mg大蜡螟幼虫，随机分成4组，每组20只。第一组大蜡螟幼虫右后足注射宿主菌1×105CFU/只；第二组在注射宿主菌培养物1× 105CFU/只半小时后，再注射1×106PFU/只的实例1中纯化的噬菌体；第三组仅注射噬菌体1×105PFU/只；第四组注射等量的PBS。连续观察3天大蜡螟幼虫的死亡情况。
结果如图6所示，治疗组(第二组，即hvKpLS8+vB_KpnP_cmc20193) 的存活率相比模型组(第一组，即hvKpLS8)明显提升，说明肺炎克雷伯噬菌体vB_KpnM_cmc2019能够较好地控制高毒力肺炎克雷伯氏菌的感染，降低死亡率。第三组(仅注射噬菌体)和第四组(仅注射PBS)的死亡率相当，说明vB_KpnP_cmc20193没有明显毒副作用。
本实施例的结果表明：噬菌体vB_KpnP_cmc20193可用于治疗肺炎克雷伯氏菌感染，且无明显毒副作用。
实施例8噬菌体vB_KpnP_cmc20193抗性菌的毒力鉴定实验
将0.1ml宿主菌与10μl效价为108PFU/ml的噬菌体混合后在双层LB琼脂平板上培养24h。选取产生噬菌体抗性的单克隆菌落在5ml的液体LB培养基中扩大培养。
取60只重为500mg的大蜡螟幼虫，随机分成3组，每组20只。第一组注射野生型宿主菌1×105CFU/只，第二组注射噬菌体抗性的菌1×105CFU/只，第三组注射等量的PBS。连续观察3天大蜡螟幼虫的死亡情况。
结果如图7所示，同样菌量注射后，被具有噬菌体抗性的肺炎克雷伯氏菌感染的大蜡螟幼虫的死亡率与注射PBS的幼虫无显著差别，几乎不表现出毒力。
本实施例的结果表明：肺炎克雷伯氏菌在产生对噬菌体 vB_KpnP_cmc20193的体抗性后，其毒力显著下降。
综上，本发明的噬菌体vB_KpnP_cmc20193不仅具有优良的裂解(杀灭) 肺炎克雷伯氏菌的能力，还具有优良的降低肺炎克雷伯氏菌毒力的能力。因此，本发明的噬菌体在制备针对肺炎克雷伯氏菌的抗菌药物(包括环境、器械消毒用的消毒剂，以及体内、体表抗感染药物)中具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一株噬菌体，其特征在于：所述噬菌体为肺炎克雷伯氏菌噬菌体（Klebsiellapneumonia phage）vB_KpnP_cmc20193,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2020420。
2.权利要求1所述噬菌体在用于杀灭肺炎克雷伯氏菌中的用途；所述肺炎克雷伯氏菌为K2荚膜型的高毒力肺炎克雷伯氏菌。
3.权利要求1所述噬菌体在用于降低肺炎克雷伯氏菌毒力中的用途；所述肺炎克雷伯氏菌为K2荚膜型的高毒力肺炎克雷伯氏菌。
4.一种针对肺炎克雷伯氏菌的抗菌药物，其特征在于：所述药物以权利要求1所述的噬菌体为活性成分；所述肺炎克雷伯氏菌为K2荚膜型的高毒力肺炎克雷伯氏菌。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于：
所述药物是裂解肺炎克雷伯氏菌或降低肺炎克雷伯氏菌毒力的药物。
6.权利要求1所述噬菌体在用于制备针对肺炎克雷伯氏菌的抗菌药物中的用途；所述肺炎克雷伯氏菌为K2荚膜型的高毒力肺炎克雷伯氏菌。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物是裂解肺炎克雷伯氏菌或降低肺炎克雷伯氏菌毒力的药物。
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