CN111944771B - 茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用。本发明人首次发现，茶多酚或其组分对粪肠球菌噬菌体有显著的钝化作用，且对粪肠球菌宿主菌无显著影响。其中，GA和EGCG复合在一起，对粪肠球菌噬菌体具有协同钝化作用。本发明可广泛应用于食品工程、医药领域，对改善肠道健康具有显著的效果。

Description

茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用

技术领域

本发明属于化学领域，特别涉及茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用。

背景技术

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是乳酸菌的一类，属于链球菌科肠球菌属，是球状的革兰氏阳性菌，具有兼性厌氧，过氧化氢阴性等特点，是人和动物肠道内主要优势菌群之一。在健康的人和动物体内，粪肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，可形成一定的肠道保护屏障。粪肠球菌产生的细菌素等抑菌物质，能抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，调节肠道菌群平衡，改善肠道微环境；粪肠球菌能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降，增强机体免疫力，促进肠道上皮细胞生长与修复，维持机体的健康水平。从而，粪肠球菌作为一种益生菌，在医学和食品工程领域得到广泛应用。

近年来，肠道噬菌体、菌群与健康的关系开始受到学术界广泛关注。噬菌体作为肠道菌群重塑的重要影响因子，影响着肠道菌群的生态平衡。在外界环境扰动，如肠道疾病或饮食干涉等情况下，肠道菌群结构会发生较大变化，同时肠道噬菌体滴度也会发生变化。而粪肠球菌作为肠道菌群里的益生菌，也会被粪肠球菌噬菌体裂解死亡，导致肠道菌群失调，影响机体的健康。

因此，如何钝化健康肠道中的粪肠球菌噬菌体，从而降低粪肠球菌噬菌体对粪肠球菌的影响，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用，这是基于经本发明人研究发现，茶多酚或其组分对粪肠球菌噬菌体有显著的钝化作用，从而提出的发明创造。其中，茶多酚(TP)的组分为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和没食子酸(GA)中的一种或两种。

一种粪肠球菌噬菌体钝化剂，为茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸中的一种或至少两种；优选为表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸复合得到；更优选为表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸按质量比1：4～4：1复合得到；最优选为表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸按质量比4：1复合得到。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明人首次发现，茶多酚或其组分对粪肠球菌噬菌体有显著的钝化作用，而对大肠杆菌噬菌体钝化作用较弱，同时，对粪肠球菌宿主菌无显著影响；

(2)本发明发明人还发现，GA和EGCG复配得到的粪肠球菌噬菌体钝化剂，其粪肠球菌噬菌体具有很好的协同作用，同时，对粪肠球菌宿主菌无显著影响；

(3)本发明可广泛应用于食品工程、医药领域，对改善肠道健康具有显著的效果。

附图说明

图1是茶多酚对粪肠球菌噬菌体滴度的影响结果图；图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

图2是EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响结果图；图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

图3是GA对粪肠球菌噬菌体滴度的影响结果图；图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

图4是TP、GA、EGCG及不同比例的GA:EGCG对粪肠球菌的影响结果图；图中，ns表示差异不显著，*表示差异显著。

图5是不同比例的GA:EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响结果图；图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

图6是茶多酚对大肠杆菌噬菌体滴度的影响结果图；图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

图7是GA对大肠杆菌噬菌体滴度的影响结果图；图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

图8是EGCG对大肠杆菌噬菌体滴度的影响结果图，图中，标相同字母表示差异不显著，标不同字母表示差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所用的材料如下：

茶多酚TP(纯度为98％，江西绿康天然产物有限公司)；没食子酸GA(纯度≥98.5％，上海集宁实业有限公司)；表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG(纯度为95％，江西绿康天然产物有限公司)。

PBS缓冲液配制方法：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄溶于800mL的去离子水中并定容至1L，分装灭菌备用。

实施例1不同浓度的茶多酚对粪肠球菌的影响

(1)粪肠球菌的准备：

(A)粪肠球菌的活化：将100μl粪肠球菌ATCC 19433甘油保存菌接种入50mL TSB液体培养基(胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基)中，于37℃、220rpm的条件下震荡培养12～15h，得到粪肠球菌培养液A；接着，用接种环挑一环粪肠球菌培养液A在固体TSA培养基(胰胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基)上进行划线分离，37℃倒置培养18-24h；再挑取单个菌落接入TSB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下震荡培养5h。

(B)对数生长期的粪肠球菌的获得：将100μl活化的粪肠球菌接种于50mL TSB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下震荡培养5h，得到达到对数期初期的粪肠球菌(菌浓度达到10⁹-10¹⁰CFU/mL)。

(2)不同浓度的茶多酚溶液的制备：

3mg/mL：称取0.15g茶多酚，加20mL一级水溶解,定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为3mg/mL的茶多酚溶液；

2.7mg/mL：称取0.135g茶多酚，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为2.7mg/mL的茶多酚溶液；

2.4mg/mL：称取0.12g茶多酚，加20mL一级水溶解，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为2.4mg/mL的茶多酚溶液；

1.8mg/mL：称取0.09g茶多酚，加20mL一级水溶解，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为1.8mg/mL的茶多酚溶液；

1.2mg/mL：吸取25mL浓度为2.4mg/mL的茶多酚溶液，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为1.2mg/mL的茶多酚；

0.6mg/mL：吸取25mL浓度为1.2mg/mL的茶多酚溶液，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为0.6mg/mL的茶多酚溶液；

0.3mg/mL：吸取25mL浓度为0.6mg/mL的茶多酚溶液，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为0.3mg/mL的茶多酚溶液；

0.03mg/mL：吸取5mL浓度为0.3mg/mL的茶多酚溶液，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为0.03mg/mL的茶多酚溶液；

0.015mg/mL：吸取25mL浓度为0.03mg/mL的茶多酚溶液，定容至50mL容量瓶中，制备得到浓度为0.0015mg/mL的茶多酚溶液；

不同浓度的茶多酚溶液分别通过0.22μm滤膜进行过滤除菌，滤液置于10mL离心管中，于4℃保存备用。

注：说明书附图中显示的浓度均为茶多酚作用的终浓度，下同。

(3)茶多酚对粪肠球菌的影响

吸取浓度为3mg/mL茶多酚溶液1mL，与1.5mL步骤(1)(B)制备得到的粪肠球菌菌液以及500μL一级水中混合均匀，其中的对照组为1.5mL步骤(1)(B)制备得到的粪肠球菌菌液以及1.5mL一级水中混合均匀；于37℃、220rpm的条件下培养12h。将培养得到的菌液用无菌的PBS缓冲液连续10倍倍比稀释，吸取稀释度10^-7与10^-8各0.1mL粪肠球菌菌液加到提前倒好的TSA(琼脂1.5％)固体平板，用涂布棒进行涂布(每个稀释度3个平行)，培养18h后计算菌落总数。菌落总数的计算如下：

选取含有30～300个菌落数的平板计算。

菌落数(CFU/mL)＝菌落数×稀释倍数×10。

(4)不同浓度的茶多酚对粪肠球菌噬菌体滴度的影响

分别吸取不同浓度的茶多酚溶液1mL，与1.5mL步骤(1)(B)制备得到的粪肠球菌菌液混合均匀，再加入500μL粪肠球菌噬菌体(Enterococcus faecalis phage)FX417悬液(其中，粪肠球菌噬菌体的保藏编号为CCTCC NO：M2019585，于2019年7月26日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心)，其中的对照组为1.5mL步骤(1)(B)制备得到的粪肠球菌菌液、500μL粪肠球菌噬菌体悬液和1mL一级水混合得到；于37℃、220rpm的条件下培养12h。将得到的培养液分别于10000rpm离心5min，吸取上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到粪肠球菌噬菌体悬液。用无菌的PBS缓冲液对粪肠球菌噬菌体悬液进行连续10倍倍比稀释(10^-1～10^-7)，分别吸取0.2mL步骤(1)(B)制备得到的粪肠球菌菌液和0.2mL不同稀释度的粪肠球菌噬菌体悬液加入10mL无菌离心管中，待其相互吸附10min后，加入5mL融化后冷却至50℃左右的TSA半固体(0.7％琼脂)培养基，温和振荡混匀后立即倒入TSA固体(1.5％琼脂)培养基中，铺双层平板，待其凝固后，于37℃，倒置培养6h，计数噬菌斑，计算噬菌体滴度(每个稀释度3个平行)。噬菌体滴度的计算如下：

选取含有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体的滴度。

噬菌体的滴度(PFU/mL)＝噬菌斑数×稀释倍数×5。

(5)实验结果

(A)终浓度为1.0mg/mL的茶多酚对粪肠球菌的影响：结果表明，茶多酚对粪肠球菌的生长没有影响。

(B)不同浓度的茶多酚对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：结果如图1所示。从图1可知，与对照组(对照组为6.96lgPFU/mL)相比，0.005mg/mL(pH5.71)、0.01g/mL(pH5.59)、0.1mg/mL(pH4.51)的茶多酚溶液对粪肠球菌噬菌体滴度的钝化作用无显著性差异；0.2mg/mL(pH4.25)、0.4mg/mL(pH4.06)、0.6mg/mL(pH3.87)、0.8mg/mL(pH3.86)、0.9mg/mL(pH3.83)和1.0mg/mL(pH3.82)的茶多酚溶液对粪肠球菌噬菌体滴度均有显著钝化作用，分别降低了1.74lgPFU/mL、3.13lgPFU/mL、3.02lgPFU/mL、4.35lgPFU/mL、4.41lgPFU/mL和4.98lgPFU/mL。其中，0.9mg/mL和0.8mg/mL，0.6mg/mL和0.4mg/mL茶多酚溶液对粪肠球菌噬菌体滴度的影响无显著性差异。

可见，一定浓度的茶多酚对粪肠球菌噬菌体具有钝化作用。

实施例2不同浓度的EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响

(1)粪肠球菌的准备：同实施例1步骤(1)。

(2)不同浓度的EGCG溶液的制备：操作步骤同实施例1步骤(2)，仅仅是将TP换为EGCG。

(3)EGCG对粪肠球菌的影响：操作步骤同实施例1步骤(3)，仅仅是将TP换为EGCG。

(4)不同浓度的EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：操作步骤同实施例1步骤(4)，仅仅是将TP换为EGCG。

(5)实验结果：

(A)终浓度为1.0mg/mLEGCG对粪肠球菌的影响：结果表明，EGCG对粪肠球菌的生长没有影响。

(B)不同浓度的EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：结果如图2所示。从图2可知，与对照组(6.03lgPFU/mL)相比，浓度为0.4mg/mL(pH5.02)、0.6mg/mL(pH5.0)、0.8mg/mL(pH4.96)、1.0mg/mL(pH5.11)的EGCG溶液对粪肠球菌噬菌体滴度的钝化作用有显著性差异，分别降低了0.44lgPFU/mL、0.60lgPFU/mL、1.70lgPFU/mL和2.48lgPFU/mL；其中，0.4mg/mL(pH5.02)和0.6mg/mL(pH5.0)的EGCG溶液对粪肠球菌噬菌体滴度的钝化作用无显著性差异。

实施例3不同浓度的GA对粪肠球菌噬菌体滴度的影响

(1)粪肠球菌的准备：同实施例1步骤(1)。

(2)不同浓度的GA溶液的制备：操作步骤同实施例1步骤(2)，仅仅是将TP换为GA。

(3)GA对粪肠球菌的影响：操作步骤同实施例1步骤(3)，仅仅是将TP换为GA。

(4)不同浓度的GA对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：操作步骤同实施例1步骤(4)，仅仅是将TP换为GA。

(5)实验结果：

(A)终浓度为1.0mg/mL的GA对粪肠球菌的影响：结果表明，EGCG对粪肠球菌的生长没有影响。

(B)不同浓度的GA对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：结果如图3所示。从图3可知，与对照组(9.41lgPFU/mL)相比，0.1mg/mL(pH3.67)和0.2mg/mL(pH3.47)的GA溶液对粪肠球菌噬菌体的钝化作用无显著性差异；0.4mg/mL(pH3.31)、0.6mg/mL(pH3.23)、0.8mg/mL(pH3.16)和1.0mg/mL(pH3.09)的GA溶液对粪肠球菌噬菌体滴度均有显著钝化作用，分别降低了0.42lgPFU/mL、1.51lgPFU/mL、2.27lgPFU/mL和4.22lgPFU/mL。

实施例4GA:EGCG不同比例对粪肠球菌噬菌体滴度的影响

(1)粪肠球菌的准备：同实施例1步骤(1)。

(2)不同比例的GA:EGCG溶液的制备：依据终浓度为0.8mg/mL计算，GA:EGCG溶液中溶质(GA+EGCG)的浓度应为2.4mg/mL，GA:EGCG的质量比例为1:4、1:2、1:1、2:1和4:1，GA+EGCG质量总和为0.6g，按质量比例分别称取相应量的GA和EGCG，混合，用一级水溶解，定容至250mL容量瓶中，0.22μm滤膜过滤除菌，即得相应比例的GA:EGCG溶液。

(3)不同浓度的GA:EGCG对粪肠球菌的影响：操作步骤同实施例1步骤(3)，仅仅是将TP换为GA:EGCG，同时，设置单一成分对照组，TP组、EGCG组以及GA组，单一成分对照组的工作液的浓度为2.4mg/mL。

(4)不同浓度的GA:EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：操作步骤同实施例1步骤(4)，仅仅是将TP换为GA:EGCG。

(5)实验结果：

(A)终浓度为0.8mg/mL的不同比例的GA:EGCG对粪肠球菌的影响：结果如4所示。由图4可知，与对照组(9.52lgCFU/mL)相比，GA:EGCG比例为1:2(pH3.34)、1:4(pH3.39)、2:1(pH3.16)、4:1(pH3.14)和GA(pH3.16)、EGCG(pH4.96)、TP(pH3.86)的溶液对粪肠球菌的菌落数的影响均无显著性差异。

(B)不同比例的GA:EGCG对粪肠球菌噬菌体滴度的影响：结果如图5所示，从图5可知，与对照组(7.57lgPFU/mL)相比，GA:EGCG比例为1:1(pH3.26)、1:2(pH3.34)、1:4(pH3.39)、2:1(pH3.16)和4:1(pH3.14)的溶液对粪肠球菌噬菌体滴度的钝化作用有显著性差异，分别降低了3.11lgPFU/mL、3.08lgPFU/mL、2.99lgPFU/mL、2.91lgPFU/mL和3.72lgPFU/mL；其中，GA:EGCG比例为1:1(pH3.26)和1:2(pH3.34)对粪肠球菌噬菌体滴度的钝化作用无显著性差异。终浓度为0.8mg/mLGA、EGCG和TP溶液对粪肠球菌噬菌体的钝化作用与对照组相比分别降低了2.27lgPFU/mL、1.70lgPFU/mL和4.02lgPFU/mL。

综上所述，GA和EGCG的比例为4：1时对粪肠球菌噬菌体的钝化作用与茶多酚的较为接近，二者具有协同作用。

实施例5灵敏度实验

(1)茶多酚对大肠杆菌噬菌体滴度的影响

(A)大肠杆菌的准备：

将100μl大肠杆菌(猪源)(已在华南农业大学硕士学位论文“一株可裂解大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体基因组学分析及其裂解酶活性鉴定”中公开)甘油保存菌接种入50mLLB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下震荡培养12～15h，得到大肠杆菌培养液A；接着，用接种环挑一环大肠杆菌培养液A在LB固体培养基上进行划线分离，37℃倒置培养18-24h；再挑取单个菌落接入LB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下震荡培养4h，得到活化的大肠杆菌菌液。

将100μl活化的大肠杆菌接种于50mL LB液体培养基中，于37℃、220rpm的条件下震荡培养4h，得到达到对数期初期的大肠杆菌(菌浓度达到10⁹-10¹⁰CFU/mL)。

(B)不同浓度的TP溶液的制备：操作步骤同实施例1步骤(2)。

(C)不同浓度的TP对大肠杆菌的影响：操作步骤同实施例1步骤(3)，仅仅是将粪肠球菌换为大肠杆菌，培养基由TSA换为LB。

(D)不同浓度的TP对大肠杆菌噬菌体滴度的影响：操作步骤同实施例1步骤(4)，仅仅是将粪肠球菌噬菌体换为大肠杆菌噬菌体(EGCD1，已在华南农业大学硕士学位论文“一株可裂解大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体基因组学分析及其裂解酶活性鉴定”中公开)，培养基由TSA换为LB。

(E)实验结果：结果如图6所示。由图6可知，与对照组(7.35lgPFU/mL)相比，浓度分别为0.8mg/mL和1.0mg/mL的茶多酚溶液对大肠杆菌噬菌体滴度的钝化作用均有显著性差异，分别降低了0.86lgPFU/mL和1.22lgPFU/mL。其中0.4mg/mL的茶多酚溶液对大肠杆菌噬菌体滴度的影响无显著性差异。与实施例1茶多酚对粪肠球菌的钝化结果相比，可见茶多酚对大肠杆菌噬菌体的钝化作用较小。

(2)GA对大肠杆菌噬菌体滴度的影响

(A)大肠杆菌的准备：同本实施例第(1)部分。

(B)不同浓度的GA溶液的制备：操作步骤同实施例2步骤(2)。

(C)不同浓度的GA对大肠杆菌噬菌体滴度的影响：同本实施例第(1)部分，区别仅在于将TP换为GA。

(D)实验结果：结果如图7所示。从图7可知，与对照组(6.83lgPFU/mL)相比，0.4mg/mL(pH3.31)，0.6mg/mL(pH3.23)，0.8mg/mL(pH3.16)和1.0mg/mL(pH3.09)的GA溶液对大肠杆菌噬菌体滴度钝化作用有显著性差异，分别降低了0.23lgPFU/mL，0.12lgPFU/mL，0.19lgPFU/mL和0.4lgPFU/mL。与实施例3GA对粪肠球菌的钝化结果相比，可见，GA对大肠杆菌噬菌体的钝化作用远远弱于粪肠球菌噬菌体。

(3)EGCG对大肠杆菌噬菌体滴度的影响

(A)大肠杆菌的准备：同本实施例第(1)部分。

(B)不同浓度的EGCG溶液的制备：操作步骤同实施例2步骤(2)。

(C)不同浓度的EGCG对大肠杆菌噬菌体滴度的影响：同本实施例第(1)部分，区别仅在于将TP换为EGCG。

(D)实验结果：结果如图8所示。由图8可知，与对照组(7.34lgPFU/mL)相比，浓度为0.4mg/mL(pH5.02)、0.6mg/mL(pH5.0)、0.8mg/mL(pH4.96)、1.0mg/mL(pH5.11)的EGCG溶液对大肠杆菌噬菌体滴度的钝化作用有显著性差异，分别降低了0.34lgPFU/mL、0.75lgPFU/mL、0.84lgPFU/mL和1.19lgPFU/mL。与实施例2EGCG对粪肠球菌的钝化结果相比，可见，EGCG对大肠杆菌噬菌体的钝化作用弱于粪肠球菌噬菌体。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用，其特征在于：所述的组分为表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用，其特征在于：所述的粪肠球菌噬菌体钝化剂为茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸中的一种或至少两种。

3.根据权利要求2所述的茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用，其特征在于：所述的粪肠球菌噬菌体钝化剂为表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸按质量比1：4～4：1复合得到。

4.根据权利要求3所述的茶多酚或其组分在制备粪肠球菌噬菌体钝化剂中的应用，其特征在于：所述的粪肠球菌噬菌体钝化剂为表没食子儿茶素没食子酸酯和没食子酸按质量比4:1复合得到。

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