CN103210921A - 茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品生物技术领域，公开了茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用，茶多酚可应用于抑制黄曲霉毒素产生菌的生长及黄曲霉毒素的生物合成，是茶多酚的一种新用途。研究表明，茶多酚对黄曲霉毒素产生菌的生长具有明显的抑制作用，且抑制效果具有浓度依赖关系。同时，茶多酚对农产品中黄曲霉毒素的生物合成均有显著抑制效果，0.2％的茶多酚对黄曲霉毒素的抑制率为21％～59％，而1％的茶多酚对黄曲霉毒素的抑制率为49％～81％，可用于食品和饲料贮藏过程中黄曲霉毒素的防控。

Description

茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种黄曲霉毒素生物防控制剂，具体的说，涉及茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用，是一种利用茶多酚抑制黄曲霉毒素产生菌的生长及其黄曲霉毒素生物合成的方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins，简称AFs)是一类结构相似的二氢呋喃氧杂萘衍生化合物的总称，根据其分子结构的不同，目前至少有包括B1，B2，G1，G2在内17种不同结构的黄曲霉毒素被确定。黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是产生黄曲霉毒素的两种主要真菌，但近年来发现集蜂曲霉(A.nomius)、溜曲霉(A.tamarii)、A.bombycis、A.pseudotamarii等也能产生AFs。毒力试验证明，B1毒性最强，接下来依次是：M1＞G1＞B2＞M2＞G2。黄曲霉毒素的主要化学特征是在紫外光照射下能发出强烈的特殊荧光，其中B族毒素发出蓝色荧光，G族毒素发出绿色荧光，并在紫外区域有一定的特征吸收峰。

黄曲霉毒素是农产品中污染最为严重的一类真菌毒素，可污染多种农产品，如花生、大豆、玉米、大米、无花果、杏仁、阿月浑子、香料、鸡蛋、巴西坚果、小麦面粉、坚果，以及肉类、牛奶等农产品和食品中均发现黄曲霉毒素的污染，对人类和动物的健康造成严重的威胁。黄曲霉毒素的毒性和稳定性很强，热稳定性非常好，分解温度高达280℃。黄曲霉毒素在非常低浓度下仍具有其生物学活性。它能引起人类及动物急性中毒死亡，还能致癌、致突变、致畸形，即使在极低的浓度下仍具有很大的毒性。被黄曲霉毒素B1严重污染的稻谷，在室温下自然存放20多年，仍可检出黄曲霉毒素B1。对黄曲霉及其毒素的生物防治，目前国内外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代谢产物及其产酶来获得具有抗菌或降解毒素特性的物质。植物提取物主要有山苍子精油、百里香油、海马齿香精油、玫瑰精油等，这些精油均为挥发性物质，对黄曲霉生长以及毒素的产生有较强抑制作用，但持效性较差；微生物中，乳酸菌、芽孢杆菌、橙黄杆菌、粘细菌、假单胞菌、雷尔氏菌、伯克霍尔德菌、部分酵母及少量真菌等均有抑制黄曲霉生长和产毒的能力，但在农产品贮藏期或食品加工中，这些微生物的应用受到限制。

发明内容

为解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用。通过实验研究证明，茶多酚可用于在黄曲霉毒素的生物防控，包括将茶多酚应用于抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素的生物合成。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用。

所述应用具体是将茶多酚用于抑制黄曲霉毒素产生菌的生长或黄曲霉毒素的生物合成。

所述应用可以是将茶多酚应用于食品或饲料贮藏过程中黄曲霉毒素污染的防控，具体是将茶多酚与食品或饲料混合后贮藏即可。

本发明涉及的茶多酚可采用多种提取方法，属于已知的成熟技术，在市场上已有相关产品出售。

本发明使用的茶多酚可以以各种茶叶品种为原料进行提取。所得茶多酚按照常规制剂工艺技术，以茶多酚为主要成分，加入常规的防腐剂、赋形剂、粘合剂、表面活性剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等作为辅料，制成任何一种方便于生产上使用的剂型，如粉剂或水剂等。

本发明首次公开了茶多酚用于抑制黄曲霉产生菌及黄曲霉生物合成的功效，将茶多酚用于产毒黄曲霉的生物防治或黄曲霉毒素生物合成的抑制，均属于本发明保护范畴。

采用茶多酚制成任何一种剂型，在其包装或说明书等标识材料或其他宣传材料中，只要注明或提到具有产毒黄曲霉的生物防治或抑制黄曲霉毒素生物合成的功效，则落入本发明保护范围。

本发明的茶多酚可应用于农产品采后贮藏期间和田间植物生长期黄曲霉产生菌及黄曲霉生物合成的抑制，将茶多酚与农产品混合即可，茶多酚相关制剂的这两种使用方式也在本发明保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提出的将茶多酚应用于产毒黄曲霉生物防控和黄曲霉毒素生物合成的抑制具有以下优点：

1、茶多酚原料来源广，采用茶渣或粗老茶叶提取，产品成本低廉、可行性高，使本发明具有良好的应用前景。

2、茶是我国传统保健饮料，将茶多酚应用于食品和农产品，安全性高。

3、茶多酚用于产毒黄曲霉的生物防治和黄曲霉毒素生物合成的抑制，可在较低浓度下起到效果，且效果稳定，不易受环境变化的影响。

附图说明

图1为实施例1中茶多酚对黄曲霉毒素生物合成的影响。

图2为实施例2中得到的茶多酚对黄曲霉As3.4408菌株在不同农产品中生物合成黄曲霉毒素的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

通过平板抑菌实验证实茶多酚对黄曲霉As3.4408CGMCC3.4408(中国微生物菌种保藏中心)菌株菌落生长速率具有显著的影响。实验过程如下：

(1)制作含茶多酚的PDA培养基：将茶多酚(茶多酚的纯度为80％，四川富正源生物科技有限公司)溶解于蒸馏水，分别配制成浓度为0.5％(m/v)(茶多酚5g溶于1L蒸馏水得到浓度为0.5％(m/v)的溶液)和1％(m/v)的茶多酚溶液(茶多酚10g溶于1L蒸馏水得到浓度为1％(m/v)的溶液)，然后分别用这两种茶多酚溶液代替蒸馏水，按常规方法配制PDA固体培养基，灭菌后倒入直径为9cm的灭菌平皿，得到含茶多酚的PDA平板。用蒸馏水按常规方法配制PDA固体培养基，灭菌后倒入直径为9cm的灭菌平皿，得到的PDA平板作为对照。

(2)接种培养：将黄曲霉As3.4408菌株转接于PDA斜面培养基，28℃恒温培养5d后，用接种针无菌点接于(1)中的PDA平板中央，28℃恒温培养，每24h测定一次菌落直径，共测定4次。ck表示用蒸馏水进行的实验组，A为用茶多酚溶液进行的实验组，B为用1％茶多酚溶液进行的实验组，每个实验组的实验重复3次，同一时间测定的菌落直径取平均值。实验结果见表1。

表1茶多酚对黄曲霉As3.4408菌株菌落生长速率的影响(n＝3)

表中数据为菌落直径，单位：mm。数据采用Duncan法进行多重比较。同一行中标有不同大写字母、小写字母者分别表示组间差异极显著(p＜0.01)和显著(p＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(p＞0.05)。

由表1可见，从第1d开始，与用不添加茶多酚的蒸馏水进行的实验结果比较，茶多酚溶液的浓度为0.5％和1％时，对黄曲霉As3.4408菌株的生长均表现出极显著的抑制效果，茶多酚溶液浓度为1％时，抑菌效果显著优于浓度为0.5％时的实验结果。可见，茶多酚对产毒黄曲霉As3.4408的生长具有显著的抑制作用，且抑制效果具有浓度依赖性。

此外，通过黄曲霉毒素产毒实验证实茶多酚对黄曲霉毒素生物合成的影响具有显著的影响。由于黄曲霉毒素具有在紫外光下可激发产生蓝绿色荧光的特性，这种荧光强弱与黄曲霉毒素含量成正相关关系(方祥等.2005.食品与发酵工业，36(4)：185-188)。对以上实验过程中得到的3个实验组中培养4d时的PDA平板，打开皿盖置于365nm紫外光下观察并拍照，黄曲霉毒素在365nm紫外光下激发荧光，菌落周围荧光强弱(对应图片中菌落周围的白色光圈的亮度)反应出黄曲霉毒素浓度的高低。结果见图1。

可见，茶多酚溶液浓度为0.5％时，黄曲霉As3.4408菌株菌落周围绿色荧光亮度(菌落周围的白色光圈的亮度)明显降低，且面积也大大减小；而茶多酚溶液浓度为1％时，PDA平板上几乎没有绿色荧光(菌落周围的白色光圈淡化)，表明茶多酚对黄曲霉As3.4408菌株生物合成黄曲霉毒素具有显著的抑制效果。

综上，茶多酚可用于在黄曲霉毒素的生物防控，包括将茶多酚应用于抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素的生物合成。

实施例2

本实施例将茶多酚用于对几种农产品中黄曲霉毒素生物合成的抑制，即把黄曲霉As3.4408接种到花生、大米、大豆、核桃仁、杏仁、玉米种子上，研究茶多酚对几种农产品在贮藏期间黄曲霉毒素生物合成的抑制效果。

实验方法：

实验材料与试剂如下：

市售花生、大米、大豆、核桃仁、杏仁、玉米各1kg；

黄曲霉毒素产毒菌株：黄曲霉As3.4408CGMCC3.4408(中国微生物菌种保藏中心)；

茶多酚(质量浓度为80％，四川富正源生物科技有限公司)；

操作步骤如下：

(1)接种培养：

1)菌种活化：将黄曲霉As3.4408菌株接种到察氏培养基斜面上，28℃恒温活化培养4d，至其产生绿色的孢子，即得活化后的黄曲霉As3.4408菌株。

2)挑取活化后的黄曲霉As3.4408菌株到察氏斜面培养基上培养4d，斜面表面产生黄曲霉菌孢子；于试管中注入无菌水，通过无菌操作，用接种环刮取斜面表面的黄曲霉菌孢子，收集黄曲霉菌孢子，用无菌纱布过滤，离心，无菌水重悬，调整孢子液浓度为1×10⁸个/ml，得到黄曲霉孢子悬浮液；

3)将花生(标记为A)、大豆(标记为B)、玉米(标记为C)、大米(标记为D)、核桃仁(标记为E)、杏仁(标记为F)种子样品各取300g，分别洗净干燥。每种样品分成三份，每份100g样品，一个灭菌三角瓶中装入一份样品，即一个瓶中装有100g样品。每个瓶中接入1ml黄曲霉孢子悬浮液，接着往装有同种样品的3个三角瓶中分别加入无菌蒸馏水10mL、10％(m/v)茶多酚溶液(配制方法为将100g绿茶水浸提取物溶于1L蒸馏水，下同)2mL+无菌蒸馏水8mL、10％(m/v)茶多酚溶液10mL，充分搅拌混合均匀，使每一粒样品均匀粘上黄曲霉孢子和茶多酚，置于白瓷盘中风干多余水分，使3个三角瓶中样品上的黄曲霉孢子浓度均为1×10⁶个/g，茶多酚浓度分别为0％(m/m)、0.2％(m/m)(即每100g样品中含有0.2g茶多酚)和1％(m/m)(即每100g样品中含有1g茶多酚)，分别标记为c、1和2。

4)将所有样品于28℃下作恒温、恒湿(RH85％)暗培养5d，然后用国标的荧光光度法(GB/T18979-2003)测定样品中黄曲霉毒素含量。

实验结果见图2，图中Ac代表未用茶多酚处理(茶多酚浓度为0％)的粘上黄曲霉孢子的花生种子样品，为对照样品之一；A1代表茶多酚浓度为0.2％并且粘上黄曲霉孢子的花生种子样品，其他样品依此类推。

由图2可见，对照样品中，6种种子样品上的黄曲霉毒素含量达到2005.11±180.21～5878.97±862.51ug/kg，而茶多酚浓度为0.2％时，样品上的黄曲霉毒素含量为830.63±55.02～3049.46±431.41ug/kg，茶多酚浓度为1.0％时，各样品上的黄曲霉毒素含量为380.82±83.58～1913.16±212.13ug/kg。可见，茶多酚对几种农产品中黄曲霉毒素的生物合成均有显著抑制效果，0.2％的茶多酚对黄曲霉毒素的抑制率为21％～59％，而1％的茶多酚对黄曲霉毒素的抑制率为49％～81％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将茶多酚用于抑制黄曲霉毒素产生菌的生长或黄曲霉毒素的生物合成。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将茶多酚应用于食品或饲料贮藏过程中黄曲霉毒素污染的防控。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将茶多酚与食品或饲料混合后贮藏。

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