CN103211272B - 茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品生物技术领域，公开了茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用，具体是茶叶提取物在抑制黄曲霉毒素产生菌的生长及黄曲霉毒素生物合成中的新用途。所述茶叶提取物包括绿茶、红茶和黑茶等通过常规提取方法得到的茶叶提取物，对黄曲霉毒素产生菌的生长具有明显的抑制作用，同时对黄曲霉毒素的生物合成也具有显著的抑制效果。实际应用中，可以将茶叶提取物用于粮食或饲料贮藏过程中黄曲霉毒素的防控，效果显著。

Description

茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及茶叶提取物的新用途，具体的说，涉及茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用，具体为该茶叶提取物在抑制黄曲霉毒素产生菌的生长及其抑制黄曲霉毒素生物合成的应用。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxins)是一种对人类和畜禽强致癌性的霉菌毒素，是指一类结构类似的化合物的总称，根据其分子结构的不同，天然产生的黄曲霉毒素分为B1，B2，G1，G2。黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是产生黄曲霉毒素的两种主要真菌。毒力试验证明，B1毒性最强，接下来依次是：M1＞G1＞B2＞M2＞G2。由于AFB1是已知致癌毒性最强的霉菌毒素，而且目前研究最多，因此通常所说的黄曲霉毒素主要是指AFB1。AFB1的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，致癌力为二甲基亚硝胺的75倍。食品或饲料中AFB1的含量高于1mg/kg就有剧毒。它除了主要诱使动物发生肝癌外，也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症。

黄曲霉毒素可污染多种农产品，对人类和动物的健康造成严重的威胁。黄曲霉毒素的毒性和稳定性很强。被黄曲霉毒素B1严重污染的稻谷，在室温下自然存放20多年，仍可检出黄曲霉毒素B1。玉米、花生、大豆、大米、小麦等等大宗农产品和核桃、杏仁等果仁类产品最易受到黄曲霉及其毒素的污染。对黄曲霉及其毒素的生物防治，目前国内外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代谢产物及其产酶来获得具有抗菌或降解毒素特性的物质。植物提取物主要有山苍子精油、百里香油、海马齿香精油、玫瑰精油等，这些精油均为挥发性物质，对黄曲霉生长以及毒素的产生有较强抑制作用，但持效性较差；微生物中，乳酸菌、芽孢杆菌、橙黄杆菌、粘细菌、假单胞菌、雷尔氏菌、伯克霍尔德菌、部分酵母及少量真菌等均有抑制黄曲霉生长和产毒的能力，但在农产品贮藏期或食品加工中，这些微生物的应用受到限制。

发明内容

为解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用，具体为该茶叶提取物在抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素生物合成中的新用途。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用。

所述应用可以为所述茶叶提取物在抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素生物合成中的应用。

所述应用具体为茶叶提取物在食品或饲料贮藏过程黄曲霉毒素污染防控中的应用。将茶叶提取物与食品或饲料混合后贮藏即可。

所述茶叶提取物属于已知的成熟产品，在市场上已有相关产品出售，可采用多种提取方法得到，包括水提取和醇提取等，其成分主要包括儿茶素、咖啡碱、茶氨酸等。

所述茶叶提取物可以是以各种茶叶品种为原料经过提取得到，可用茶叶鲜叶、干叶提取，也可以用各大茶类，如绿茶、红茶、黑茶、黄茶、乌龙茶和白茶等进行提取。所得茶叶提取物，按照常规制剂工艺技术，将茶叶提取物作为主要成分，加入常规的防腐剂、赋形剂、粘合剂、表面活性剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等作为辅料，制成任何一种方便于生产上使用的剂型，如粉剂或水剂等剂型。

本发明首次公开了茶叶提取物具有抑制黄曲霉产生菌及其黄曲霉生物合成的功效，将茶叶提取物用于产毒黄曲霉的生物防治或黄曲霉毒素生物合成的抑制，均属于本发明保护范畴。

采用茶叶提取物制成任何一种剂型，在其包装或说明书等标识材料或其他宣传材料中，只要注明或提到具有产毒黄曲霉的生物防治或抑制黄曲霉毒素生物合成的功效，则落入本发明保护范围。

本发明的茶叶提取物可应用于农产品采后贮藏期间和田间植物生长期产毒黄曲霉的生物防治或黄曲霉毒素生物合成的抑制，茶叶提取物相关制剂的这两种使用方式也在本发明保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的茶叶提取物在产毒黄曲霉的生物防治和黄曲霉毒素生物合成的抑制中的新用途具有以下优点：

1、茶叶提取物原料来源广，采用茶渣或粗老茶叶提取，产品成本低廉、可行性高、有良好的应用前景。

2、茶是我国传统保健饮料，茶叶提取物应用于食品和农产品，其安全性高。

3、茶叶提取物用于产毒黄曲霉的生物防治和黄曲霉毒素生物合成的抑制，可在较低浓度下起到效果，且效果稳定，不易受环境变化的影响。

附图说明

图1为实施例1中茶叶水浸提取物对黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124生长的抑制效果。

图2为实施例1中绿茶水浸提取物对黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124生物合成的影响。

图3为实施例2中绿茶水浸提取物对黄曲霉AS3.4408在不同农产品中生物合成黄曲霉毒素的影响。

图4为实施例3中黑茶水提取物对寄生曲霉AS3.124在不同农产品中生物合成黄曲霉毒素的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

通过平板抑菌实验考察茶叶提取物对黄曲霉As3.4408(中国微生物菌种保藏中心，现用编号为CGMCC3.4408)和寄生曲霉As3.124(中国微生物菌种保藏中心，现用编号为CGMCC3.124)生长的抑制效果，该实验研究过程如下：

(1)茶叶提取物的制备：将绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶各500g分别于5L沸水中保温浸泡20分钟后，过滤，滤液浓缩除去2/3的水分，再通过冷冻干燥升华剩余水分获得4种茶叶水浸提取物。

(2)含茶叶提取物的PDA固体培养基的制作：分别称取4种茶叶水浸提取物溶解于蒸馏水，配制成溶液，其中取绿茶提取物1g溶于1L蒸馏水，得到绿茶提取物浓度为0.1％(m/v)的溶液，将红茶、乌龙茶和黑茶提取物各8g分别溶解于1L蒸馏水中，所得茶叶提取物溶液浓度均为0.8％(m/v)。然后分别以上述溶液代替蒸馏水按常规方法配制含茶叶提取物的PDA固体培养基，灭菌后倒入灭菌平皿(直径9cm)，制成含茶叶水浸提取物的PDA平板。按相同的方法用蒸馏水(即不加入茶叶水浸提取物)制得的PDA平板作为对照。

(3)将黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124菌株分别转接于PDA斜面培养基，28℃恒温培养5d后，用接种针无菌点接于各含茶叶水浸提取物的PDA平板及用蒸馏水制备的PDA平板中央，28℃恒温培养，每24h测定一次菌落直径，共培养4d，每个实验重复3次，直径取平均值，实验结果见表1～2。

(4)由于黄曲霉毒素具有在紫外光下可激发产生蓝绿色荧光的特性，这种荧光强弱与黄曲霉毒素含量成正相关关系(方祥等.2005.食品与发酵工业，36(4)：185-188)。将接种后的PDA平板于28℃恒温培养4d时，打开皿盖置于254nm紫外光下观察并拍照，黄曲霉毒素在365nm紫外光下激发荧光，菌落周围荧光强弱(对应图片中菌落周围的白色光圈的亮度)反应出黄曲霉毒素浓度的高低。实验结果见图1。

图1和表1～2中，1表示用黄曲霉As3.4408进行的实验，2表示用寄生曲霉As3.124进行的实验；CK为用蒸馏水进行的实验(不添加茶叶水浸提取物)；A表示用0.1％(m/v)的绿茶水浸提取物溶液进行的实验，B为用0.8％(m/v)黑茶水浸提取物溶液进行的实验、C为用0.8％(m/v)红茶水浸提取物溶液进行的实验、D为用0.8％(m/v)乌龙茶水浸提取物溶液进行的实验，则CK1表示用蒸馏水和黄曲霉As3.4408进行的实验，而D2表示用0.8％乌龙茶水浸提取物溶液和寄生曲霉As3.124进行的实验，其他编号依此类推。

表1和表2中数据为菌落直径，单位mm。数据采用Duncan法进行多重比较。同一行中标有不同大写字母、小写字母者分别表示组间差异极显著(p＜0.01)和显著(p＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(p＞0.05)。

由图1、表1和表2可见，添加0.1％(m/v)绿茶水浸提取物溶液、0.8％(m/v)黑茶水浸提取物溶液、0.8％(m/v)红茶水浸提取物溶液和0.8％(m/v)乌龙茶水浸提取物溶液后，均对黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124的生长起到显著的抑制效果。

表1茶叶水浸提取物对黄曲霉As3.4408菌落生长速率的影响(n＝3)

表2茶叶水浸提取物对寄生曲霉As3.124菌落生长速率的影响(n＝3)

另通过黄曲霉毒素产毒实验考察绿茶提取物对黄曲霉毒素生物合成的影响。将黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124菌株在含茶叶提取物的PDA平板接种后(所述茶叶提取物为上一实验中的绿茶水浸提取物，PDA平板的制备过程及接种过程与上一实验相同)，28℃恒温培养4d，打开皿盖置于365nm紫外光下观察并拍照，黄曲霉毒素在365nm紫外光下激发荧光，菌落周围荧光强弱(对应图片中菌落周围的白色光圈的亮度)反应出黄曲霉毒素浓度的高低。

实验结果见图2。A、B、C采用的菌株为黄曲霉AS3.4408，从左到右绿茶水浸提取物溶液的浓度分别为0％、0.1％(m/v)(1g绿茶水浸提取物溶于1L蒸馏水后得到)、1.0％(m/v)(10g绿茶水浸提取物溶于1L蒸馏水后得到)；D、E、F中所用的培养物为寄生曲霉AS3.124，从左到右绿茶水浸提取物的浓度分别为0％、0.1％(m/v)(1g绿茶水浸提取物溶于1L蒸馏水后得到)、1.0％(m/v)(10g绿茶水浸提取物溶于1L蒸馏水后得到)。

由图2可见，绿茶水浸提取物对黄曲霉毒素的生物合成具有显著的抑制效果。绿茶水浸提取物溶液的浓度为0.1％时，黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124菌株菌落周围绿色荧光(对应图中菌落周围的光圈)亮度明显降低，面积也大大减小；绿茶水浸提取物溶液的浓度为1％(m/v)时PDA平板上几乎没有绿色荧光(即光圈淡化)，可见，绿茶水浸提取物对黄曲霉As3.4408和寄生曲霉As3.124菌株生物合成黄曲霉毒素具有显著的抑制效果。

实施例2

对绿茶提取物对几种农产品中黄曲霉毒素生物合成的抑制作用进行实验研究，是通过将黄曲霉As3.4408接种到花生、大米、大豆、核桃仁、杏仁、玉米种子上，研究绿茶水浸提取物对几种农产品在贮藏期抑制黄曲霉毒素生物合成的效果。

实验方法如下：

(1)实验材料与试剂：

市售花生、大米、大豆、核桃仁、杏仁、玉米各1kg；

黄曲霉毒素产毒菌株：黄曲霉AS3.4408(现保藏在中国微生物菌种保藏中心，现用编号为CGMCC3.4408)

绿茶水浸提取物(制备方法如前所述)；

(2)接种培养：

1)菌种活化：将黄曲霉AS3.4408菌株接种在察氏培养基斜面上，28℃恒温活化培养4天，至其产生绿色的孢子，得到活化后的黄曲霉As3.4408菌株。

2)挑取活化后的黄曲霉As3.4408菌株到察氏斜面培养基上培养4d，斜面表面出现霉菌孢子；于试管中注入无菌水，通过无菌操作，用接种环轻轻刮取斜面表面霉菌孢子，收集霉菌孢子，用无菌纱布过滤，离心，无菌水重悬，调整孢子液浓度为(1×10⁸/ml)，得到黄曲霉孢子悬浮液；

3)将花生、大米、大豆、核桃仁、杏仁、玉米种子样品各取300g，分别洗净干燥。每种样品分成三份，每份100g，一个灭菌三角瓶中装入1份样品，同时各接入1ml黄曲霉孢子悬浮液。在装有同种样品的3个三角瓶分别加入无菌蒸馏水10mL、10％(m/v)(配制方法为将100g绿茶水浸提取物溶于1L蒸馏水，下同)绿茶水浸提取物溶液2mL+无菌蒸馏水8mL、10％绿茶水浸提取物溶液(m/v)10mL，充分搅拌混合均匀，使样品中的每一粒均匀粘上黄曲霉孢子和绿茶提取物，置于白瓷盘中风干多余水分，使3个三角瓶中的黄曲霉孢子浓度均为1×106/g样品，绿茶水浸提取物浓度分别为0％(m/m)、0.2％(m/m)(即每100g样品中含有0.2g绿茶水浸提取物)和1％(m/m)(即每100g样品中含有1g绿茶水浸提取物)。

4)将所有样品于28℃下作恒温、恒湿(RH85％)暗培养5d，然后采用国标的荧光光度法(GB/T18979-2003)测定样品中黄曲霉毒素含量。

(4)实验结果与分析：

实验结果见图3，其中，c-ck表示用蒸馏水(即未添加绿茶提取物)进行的实验，即对照实验，1表示绿茶水浸提取物浓度为0.2％时的实验，2表示绿茶水浸提取物浓度为1.0％的实验；A-花生，B-大豆，C-玉米，D-大米，E-核桃仁，F-杏仁。

由图3可见，用于对照的几种样品上黄曲霉毒素的含量达到2005.11±180.21～5878.97±862.51ug/kg，而绿茶水浸提取物浓度为0.2％时，实验后样品上黄曲霉毒素含量为400.65±85.01～1769.86±391.01ug/kg，绿茶水浸提取物浓度为1％时，实验后1样品上黄曲霉毒素含量为200.55±42.32～800.4±100.98ug/kg。可见，绿茶水浸提取物对几种农产品中黄曲霉毒素的生物合成均有显著抑制效果。

实施例3

对黑茶提取物对几种农产品中黄曲霉毒素生物合成的抑制作用进行实验研究，是通过将寄生曲霉As3.124(现保藏在中国微生物菌种保藏中心，现用编号为CGMCC3.124)接种到花生、大米、大豆、核桃仁、杏仁、玉米种子上，研究黑茶水浸提取物对几种农产品在贮藏期抑制黄曲霉毒素生物合成的效果。

材料与试剂及方法均同实施例1，只是用黑茶水浸提取物代替绿茶水浸提取物(提取方法也一致)，并用另一种产毒黄曲霉菌株寄生曲霉AS3.124进行实验，考察黑茶提取物对寄生曲霉AS3.124在不同农产品中生物合成黄曲霉毒素的影响。

实验结果见图4。其中，c-ck表示用蒸馏水(即未添加黑茶提取物)进行的实验，即对照实验；1表示黑茶水浸提取物浓度为0.2％的实验，2表示黑茶水浸提取物浓度为1.0％的实验；A-花生，B-大豆，C-玉米，D-大米，E-核桃仁，F-杏仁。

由图4可知，对照实验的几种样品上黄曲霉毒素含量达到2400.87±190.2～6500.2±425.74ug/kg，而黑茶水浸提取物浓度为0.2％时，实验后样品上黄曲霉毒素含量为350.6±55.22～1788.86±521.66ug/kg，黑茶水浸提取物浓度为1.0％时，实验后样品上黄曲霉毒素含量为200.54±23.6～855±220.85ug/kg。可见，黑茶水浸提取物对几种农产品中黄曲霉毒素的生物合成均有显著的抑制效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述应用具体为茶叶提取物在食品或饲料贮藏过程黄曲霉毒素污染防控中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述茶叶提取物的提取原料为绿茶、红茶、黑茶、黄茶、乌龙茶或白茶茶叶的鲜叶或干叶，所述茶叶提取物的提取方法按常规方法进行。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用具体为茶叶提取物在抑制黄曲霉毒素生物合成中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用方法是将茶叶提取物与食品或饲料混合后贮藏。