CN114774345B - 一种降低细菌毒力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降低细菌毒力的方法。一种降低细菌毒力的方法，该方法采用噬菌体与细菌进行混合培养。本发明采用噬菌体处理细菌，能够使细菌鞭毛素基因fliC表达量显著降低，进而降低细菌的毒力，并且采用该方法降低细菌毒力，不易返毒，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降低细菌毒力的方法。
背景技术
病原菌能否引起宿主疾病取决于它们的致病性和毒力。同一细菌不同菌株间的致病能力有所差异。病原菌致病力的强弱程度称为毒力(virulent)，据此有强毒、弱毒(减毒)和无毒之分。因此，毒力是菌株个体的特征。
减毒菌株由于毒性降低，致病性减弱，不仅可以减少发病率，同时可以充当活疫苗使用，引发免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆B和T细胞，获得长期或终生保护的作用。
目前，传统的细菌减毒方法主要有以下几种：发明专利“降低细菌的毒力的方法，CN102883602A”公开了通过化学接触的方法可以降低包含GacS/GacA-型系统、HrpX/HrpY-型系统、T3SS-型系统和rsm-型系统中的至少一种细菌的毒力。所述方法包括：使所述细菌接触本文所述化合物，并检测下述的至少一项：(i)细菌的GacS/GacA-型系统、HrpX/HrpY-型系统、T3SS-型系统和rsm-型系统中的至少一种的组分的变化，和(ii)宿主病理学的变化。使用方法在已经筛选所述化合物的减少毒力诱导的效力以后，可以测试表现出有效减少的那些类似物(也称作“活性化合物”)，用于降低与受试者(诸如植物或动物，包括人)有关的细菌的毒力。所述细菌可以是在受试者的表面上或在受试者内部或以其它方式与受试者相关。活性化合物可以用于治疗具有细菌感染的受试者的方法中。所述方法包括：给所述受试者施用有效量的包含所述化合物的组合物(参见实施例)。活性化合物也可以施用于表面上，以降低与表面有关的细菌的毒力。
研究(虞秀芳.关于亚抑制浓度庆大霉素可通过抑制大肠杆菌丛动性降低细菌毒力的研究[D].石河子大学,2019.)发现，庆大霉素的亚抑制浓度预处理可以抑制大肠杆菌标准菌株的丛动能力，该机制可能与抑制琥珀酸脱氢酶(SDH)表达，延胡索酸产生减少相关，提示庆大霉素在治疗大肠杆菌感染有其自身优势。通过对临床分离菌株及标准菌株分别进行庆大霉素预处理，结合体内外实验，及荧光实时定量PCR验证亚抑制浓度庆大霉素可降低细菌毒力及其相关机制，结果表明亚抑制浓度庆大霉素可通过降低细菌鞭毛相关基因表达量进而抑制其运动性。
随着生物技术的发展，越来越来的生物工程方法被应用于细菌减毒菌株的构建，例如，通过基因重组技术，敲除致病菌的毒力基因，构建重组菌等。另外，还可以通过多次传代的方法，使细菌的毒力降低。采用上述生物技术获得减毒菌株的方法，只能是针对体外培养的细菌进行。而对于活体内的致病菌，如何在体内减毒，目前还没有相关文献进行报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低细菌毒力的方法，该方法采用噬菌体作用于宿主菌，能够减小宿主菌的毒力，降低其致病性，在临床应用中该方法可以作用于活体，例如病禽，病畜等，安全性高，不会出现耐药性。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种降低细菌毒力的方法，该方法采用噬菌体与细菌进行混合培养。
进一步地，所述噬菌体按其裂解稀释度的量与细菌以1:1的体积比混合。
进一步地，所述噬菌体的裂解稀释度为其效价的10-7～10-5倍。
进一步地，所述噬菌体的裂解稀释度为其效价的10-6倍。
进一步地，所述的噬菌体为大肠杆菌噬菌体。
本发明采用噬菌体处理细菌，能够使细菌鞭毛素基因fliC表达量显著降低，进而降低细菌的毒力，并且采用该方法降低细菌毒力，不易返毒，安全性高。
附图说明
图1为本发明实施例中用噬菌体处理前大肠杆菌鞭毛素基因fliC电泳图；图中，1、2、3分别代表大肠杆菌CMCC(B)44829、大肠杆菌CMCC(B)44102、大肠杆菌CMCC(B)44103的鞭毛素基因fliC；
图2为本发明实施例中用噬菌体处理后大肠杆菌鞭毛素基因fliC电泳图；图中，1、2、3分别为处理后鞭毛素基因fliC不表达或表达降低(消除)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
本发明实施例中用到的实验材料例如：大肠杆菌CMCC(B)44829、CMCC(B)44102、CMCC(B)44103均购自中国医学细菌保藏管理中心。噬菌体RDP-EC-20123受赠于瑞科盟(青岛)生物工程有限公司，保藏编号为CGMCC No.22486。
实施例1大肠杆菌鞭毛素基因fliC检测
将大肠杆菌CMCC(B)44829、CMCC(B)44102、CMCC(B)44103分别划线接种于麦康凯平板，置于37℃恒温培养。挑选具有特征性的单个菌落接种于肉汤中，于37℃恒温水浴振荡器中培养。取菌液，室温下离心收集细菌沉淀，按照试剂盒的说明提取细菌总DNA。按照文献《安徽部分地区APSD分离鉴定及耐药性与毒力基因分析》中提供的引物及检测方法进行大肠杆菌鞭毛素基因fliC检测。结果显示，CMCC(B)44829、CMCC(B)44102、CMCC(B)44103，均含有鞭毛素基因fliC，片段大小为600bp，如图1所示，1、2、3分别代表大肠杆菌CMCC(B)44829、大肠杆菌CMCC(B)44102、大肠杆菌CMCC(B)44103。
实施例2噬菌体的制备
(1)宿主菌增殖：首先配制增殖培养基，其主要成分为：添加30％甘油的LB液体培养基。将宿主菌按照5％的接种量接种至增殖培养基中；将宿主菌在37℃的温度下培养至对数期；将噬菌体RDP-EC-20123原液100μl与宿主菌E10300μl均匀混合，静置15分钟使其感染。将混合液接至含10ml新鲜液体培养基的试管中，于37℃下振荡培养约8小时。离心去除杂质：将上一步的混合液3000r/min离心15min，去除杂质，收集上清。
实施例3用噬菌体处理大肠杆菌,降低大肠杆菌毒性
(1)噬菌体效价的测定：按照感染复数为0.1的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价为1.13×1010。
(2)将噬菌体RDP-EC-20123分别与大肠杆菌CMCC(B)44829、大肠杆菌CMCC(B)44102、大肠杆菌CMCC(B)44103进行复配作用：将上述效价的噬菌体RDP-EC-20123进行10倍系列稀释，取-5倍的噬菌体进行试验，分别取100ul噬菌体与100ul大肠杆菌CMCC(B)44829、大肠杆菌CMCC(B)44102、大肠杆菌CMCC(B)44103同步接种于LB肉汤中，37℃温箱中分别培养24h、48h、72h及96h。
(3)作用后大肠杆菌鞭毛素基因fliC检测
分别选取不同作用时间处理后的大肠杆菌进行稀释后涂板，每株细菌各选取100个按照文献《安徽部分地区APSD分离鉴定及耐药性与毒力基因分析》中提供的引物及检测方法进行大肠杆菌鞭毛素基因fliC检测。检测结果显示，表经过噬菌体的作用，可使大肠杆菌鞭毛素基因fliC表达有一定的降低或不表达，如图2所示，但与培养时间无明显关联。具体结果如表1所示。
表1不同作用时间对大肠杆菌鞭毛素基因fliC表达的影响
实施例4噬菌体与大肠杆菌作用复配系数的确定
(1)噬菌体效价的测定：按照感染复数为0.1的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价为1.13×1010。
(2)将噬菌体RDP-EC-20123按照其裂解稀释度的量(RTD)与大肠杆菌进行复配作用：将上述效价的噬菌体RDP-EC-20123进行10倍系列稀释，取-7、-6、-5及-8倍的噬菌体进行试验，分别取100ul噬菌体与100ul大肠杆菌CMCC(B)44829、大肠杆菌CMCC(B)44102、大肠杆菌CMCC(B)44103同步接种于LB肉汤中，37℃温箱中分别培养24h。
分别选取作用后的大肠杆菌进行稀释后涂板，每株细菌各选取100个按照文献《安徽部分地区APSD分离鉴定及耐药性与毒力基因分析》中提供的引物及检测方法进行大肠杆菌鞭毛素基因fliC检测。检测结果如表2所示，表明经过噬菌体的作用，可使大肠杆菌鞭毛素基因fliC表达量有一定的降低，并且其降低率与复配系数有一定的相关性，综合比较，-6倍稀释的噬菌体效价对大肠杆菌鞭毛素基因fliC消除率最高。
表2不同效价(复配系数)噬菌体对大肠杆菌鞭毛素基因fliC消除率影响
Claims (2)
1. 一种降低细菌毒力的方法，其特征在于：该方法采用噬菌体与细菌进行混合培养；所述噬菌体按其裂解稀释度的量与细菌以1:1的体积比混合；使细菌鞭毛素基因 fliC 表达降低，进而降低细菌的毒力；所述噬菌体的裂解稀释度为其效价的10-7～10-5倍；所述的噬菌体是保藏编号为 CGMCC No.22486的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20123；所述的细菌为大肠杆菌CMCC(B)44829、大肠杆菌 CMCC(B)44102、大肠杆菌 CMCC(B)44103。
2.根据权利要求1所述的降低细菌毒力的方法，其特征在于：所述噬菌体的裂解稀释度为其效价的10-6倍。
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