CN102342298B - 包含噬菌体的活体外杀菌组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含噬菌体的活体外杀菌组合物，包括鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的噬菌体及载体。本发明还提供一种用于医疗机构或与医疗相关的研究机构的清洁方法，其包括将有效量的鲍氏不动杆菌噬菌体施用于该医疗机构或与医疗相关的研究机构，以减少该医疗机构或与医疗相关的研究机构中鲍氏不动杆菌的数量。

Description

包含噬菌体的活体外杀菌组合物

技术领域

本发明涉及一种杀菌组合物及应用该杀菌组合物的杀菌方法，尤其涉及一种包括噬菌体及载体的杀菌组合物及应用该杀菌组合物的杀菌方法。

背景技术

院内感染(nosocomial infection)是医院最棘手的难题，据统计，医院的院内感染率一般约为3％至5％。院内感染的细菌通常为条件致病菌(opportunistic pathogen)，亦即，对于免疫力正常的宿主而言，该种细菌为无害的，有些细菌甚至是人体表面的正常菌群(normal flora)；但在宿主免疫力下降时，该种细菌就容易引起感染，造成疾病。

常见院内感染的细菌包括，例如，葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、肠球菌(Enterococci)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、非发酵革兰阴性杆菌(Non-fermentative gram-negativebacilli)、军团杆菌属(Legionella)、梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等。

目前，最常见的院内感染细菌包括绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等。

院内感染细菌可能生存于听诊器、病历、止血带、手套、针头、呼吸器、潮湿瓶、家具、地板、通风口、监视器等设备；或存在于水、土壤及食物(水果、蔬菜中)和下水道污物中；或存在于人体，如皮肤、腋下、结膜、口腔、上呼吸道、鼻咽及肠胃道等处。

院内感染的发生，以加护病房为例，由于病患多为重症患者，人体免疫力较差，且常需要接受侵入性治疗，例如插管、血管装置等，大幅提高院内感染的可能，据统计，加护病房的感染率约为千分之20至30左右。

一般细菌感染的治疗方法即为使用抗生素。然而，由于抗生素的滥用，细菌会被筛选而演化出更多的抗药性，目前院内感染已出现越来越多对抗生素具有抗药性的细菌。要治疗感染此种细菌的病患，则必须使用昂贵的新型抗生素，且若细菌的抗药性继续发展，将会致使无有效抗生素可供应用。有鉴于此，有必要研发降低及/或预防院内感染的替代方法。

噬菌体(phage、bacteriophage)为病毒的一种，特征在于噬菌体的宿主为细菌，必须在细菌体内才能够生长与复制。噬菌体可分为溶裂型(lytic)和溶原型(lysogenic)，溶裂型噬菌体会感染宿主细菌，在宿主内复制完成后，噬菌体会将细菌溶裂而释出，细菌则破裂死亡。溶原型噬菌体是较温和的噬菌体，可以进行溶裂型或溶原型的生活史，在溶原型的路径中，会与宿主共存。

已有利用噬菌体进行治疗细菌性疾病的前案，例如可见美国专利案第5,688,501号、第5,997,862号等、第6,248,324号、第6,485,902号，分别公开了利用包括噬菌体的医药组合物治疗细菌性疾病、A型链球菌(Streptococcus A)、造成皮肤感染的细菌、大肠杆菌O157菌株等；美国专利案第6,121,036号公开了包括一种以上的噬菌体的医药组合物；美国专利案第6,699,701号公开了利用肠炎沙门氏杆菌(Salmonella enteritidis)特异性噬菌体进行食品包装的方法，其将该噬菌体涂布至包装材料上，再以包装材料包覆食品(如蔬果)。

综上所述，目前已知噬菌体的应用，尚未提供针对院内感染的细菌有效的预防或治疗的方法，特别是，上述前案均未公开鲍氏不动杆菌的噬菌体，亦未公开针对减少院内感染细菌的鲍氏不动杆菌的数量的方法。

发明内容

为克服上述及其它问题，本发明提供一种活体外杀菌组合物，包括至少一种鲍氏不动杆菌的噬菌体(以下有时简称AB菌噬菌体)及载体。在一个具体实施方式中，该噬菌体专一性感染鲍氏不动杆菌，例如，可专一性感染对下列至少一种抗生素具抗药性的鲍氏不动杆菌噬菌体，该抗生素的实例包括健达霉素(gentamicin)、安霉素(amikacin)、达比霉素(piperacillin/tazobactam)、特泯菌(ticarcillin/clavulanate)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、头孢匹罗(cefpirome)、胺曲南(aztreonam)、亚安培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、环丙沙星(ciprofloxacin)及左氧氟沙星(levofloxacin)所构成之组群。

在一个具体实施方式中，该噬菌体包含至少一种纯系鲍氏不动杆菌噬菌体。例如，具有二十面体的头部以及短尾巴型态之鲍氏不动杆菌噬菌体，或具有二十面体的头部以及收缩的尾巴型态之鲍氏不动杆菌噬菌体。本发明组合物中，鲍氏不动杆菌噬菌体可为短尾噬菌体科(Podoviridae)双链去氧核糖核酸病毒，或肌尾噬菌体科(Myoviridae)双链去氧核糖核酸病毒。

在本发明组合物中，该噬菌体具有酸耐受性及碱耐受性。在一个具体实施方式中，该噬菌体于pH 4以上至pH 12以下的条件下保有噬菌体的生物活性。

在一个具体实施方式中，该AB菌噬菌体可于表面活性剂中保有噬菌体的生物活性。

其中，“噬菌体的生物活性”是指该噬菌体于环境中仍保有对宿主鲍氏不动杆菌的感染力，能够感染宿主、在宿主细胞内增殖、及/或将宿主细胞溶裂的能力。

在一个具体实施方式中，本发明的噬菌体为溶裂型噬菌体，感染鲍氏不动杆菌，并于细菌细胞内增殖完成后，能够溶裂鲍氏不动杆菌的细胞壁而释出增殖的噬菌体，鲍氏不动杆菌则死亡，由此，本发明的噬菌体可用于抑制鲍氏不动杆菌的活性、或减少鲍氏不动杆菌的数量。

于本发明组合物中，并未特别限制该载体，只要该载体与AB菌噬菌体为可兼容性(compatible)以使该噬菌体可于载体中保有生物活性，即可用于该杀菌组合物中。

在一个具体实施方式中，该载体为溶液、悬浮液、粉末、喷雾剂、或软膏的形式，但不限于此。于实施例中，该载体选自水、油、表面活性剂(如清洁剂、肥皂)、蛋白胨(peptone)等，亦可为两种以上的组合，其中，以水及/或表面活性剂为优选。

在优选实施例中，该表面活性剂为至少一种选自阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂及非离子性表面活性剂的表面活性剂。

在实施例中，该阴离子性表面活性剂为，举例但非限制，月桂酯硫酸铵、月桂醇聚醚磺基琥珀酸酯二钠、辛基磺酰基琥珀酸酯二钠、软性十二烷基苯磺酸、十二烷基磷酸酯(MAP)、次级烷基磷酸盐

(SAS)、椰油酰羟基乙基磺酸钠(SCID)、月桂醇聚醚硫酸酯钠(SLES)、月桂酰肌胺酸钠、月桂酰醚硫酸钠(SLS)、甲基椰油酰基牛磺酸钠等。

在实施例中，该阳离子性表面活性剂为，举例但非限制，十六烷基(Cetyl)三甲基氯化铵、二椰油基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、双酯季铵盐、烷基芐基二甲基氯化铵、牛油烷基二甲基氯化铵(DTDMAC)、咪唑啉季铵盐等。

在实施例中，该两性离子性表面活性剂为，举例但非限制，椰油基咪唑啉甜菜碱(cocoyl lmidazolinium betaine)、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基二甲基甜菜碱、椰油酰两性基二丙酸二钠、月桂酰胺丙基二甲基甜菜碱、烷基两性基丙酸钠(sodium alkylamphopropionate)、牛脂基二羟乙基甜菜碱等。

在实施例中，该非离子性表面活性剂为，举例但非限制，烷基聚葡萄糖苷(APG)、椰子酰胺(cocoamide DEA)、月桂基胺氧化物、月桂基醚羧酸酯、Triton X(如TX-100、TX-405等)、PEG-150二硬脂酸酯、Tween(如Tween-40、Tween-80等)、Span(如Span-20、Span-80等)等。

在优选实施例中，该表面活性剂可为市售产品，特别是清洁剂产品。

本发明所述的组合物视需要还包括第二噬菌体，其中，该第二噬菌体为院内感染细菌的噬菌体。

在一个具体实施方式中，该院内感染细菌是一种或多种选自不动杆菌(Acinetobacter)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococci)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、非发酵革兰阴性杆菌(Non-fermentative gram-negativebacilli)、军团杆菌属(Legionella)、梭菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)或假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌。

在实施例中，该不动杆菌是一种或多种选自鲍氏不动杆菌(A.baumannii)、醋酸钙不动杆菌(A.Calcoaceticus)、溶血性不动杆菌(A.haemolyticus)、琼氏不动杆菌(A.junii)、约氏不动杆菌(A.johnsonii)或鲁菲不动杆菌(A.lwoffii)的细菌。

在实施例中，该葡萄球菌是一种或多种选自表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血性葡萄球菌(S.hemolyticus)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、头葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、溶血性葡萄球菌(S.hominis)、巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)、溶血性葡萄球菌(S.simulans)、瓦氏葡萄球菌(S.warneri)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)或腐生性葡萄球菌(S.saprophyticus)的细菌。

在实施例中，该肠杆菌科是一种或多种选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、变形菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、摩根氏菌属(Morganella)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serrartia)、志贺氏菌属(Shigella)或耶尔森氏菌属(Yersinia)的细菌。

在实施例中，该假单胞菌属为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。

本发明组合物所含的第二噬菌体为溶裂型噬菌体，可感染宿主(细菌)，并于细菌细胞内增殖完成后，能够溶裂宿主的细胞壁而释出增殖的噬菌体，宿主则死亡，由此，本发明所述的第二噬菌体可用于抑制其宿主的活性、或减少宿主的数量。

在一个具体实施方式中，该第二噬菌体可在表面活性剂中保有噬菌体的生物活性。

在一个具体实施方式中，该鲍氏不动杆菌噬菌体在该组合物中的初始浓度为1x10⁷PFU/ml至1x10⁹PFU/ml。由此，可根据使用者的需求，将AB菌噬菌体与其它细菌的噬菌体组合而制备本发明所述的组合物，由此，可达到同时减少多种细菌的效果。

另一方面，本发明提供一种用于医疗机构或与医疗相关的研究机构的活体外杀菌方法，其包括：将包括鲍氏不动杆菌的噬菌体及载体的杀菌组合物施用于该医疗机构或与医疗相关的研究机构，以减少该医疗机构或与医疗相关的研究机构中的细菌数量。在一个具体实施方式中，本发明所述的方法特别是针对减少鲍氏不动杆菌的数量。

其中，该鲍氏不动杆菌的噬菌体及载体如上述所定义。视需要，该杀菌组合物还包括第二噬菌体，该第二噬菌体如上述所定义。由此，可根据使用者的需求，将AB菌噬菌体单独或与其它细菌的噬菌体组合而制备本发明所述的组合物，由此，可达到减少鲍氏不动杆菌的数量、或同时减少多种细菌的数量的效果。

在一个具体实施方式中，将该杀菌组合物雾化为喷剂，施用于医疗机构或与医疗相关的研究机构，例如，医院或疗养院。在一实施例中，将该杀菌组合物施用于该医院或疗养院的环境中，例如，举例但非限制，加护病房、手术室、恢复室、诊疗室、会客室等；或施用于该医院或疗养院的设备，例如，举例但非限制，插管、血管装置、听诊器、病历、止血带、手套、呼吸器、潮湿瓶、家具、地板、通风口、监视器等的表面。该施用的方法为，视施用的目的物而选择，直接喷洒、间接喷洒、浸泡或直接涂抹于人体皮肤表面。

本发明所述的杀菌组合物及杀菌方法可通过噬菌体与宿主间的专一性而有效降低目的细菌的数量或抑制目的细菌的活性，因此可解决因细菌产生抗生素抗药性而无法使用抗生素杀菌的困扰，且利用本发明所述的杀菌组合物亦不会造成目的细菌产生进一步的抗药性。本发明所述的杀菌组合物可与市售清洁剂搭配使用，在商业化上具有优势。另外，本发明所述的杀菌方法步骤简单、效果良好，且无化学杀菌剂毒性残留、无细菌的抗药性产生的疑虑，因此可有效解决院内感染的问题。

保藏信息

本发明的鲍氏不动杆菌噬菌体保藏于德国菌种保存中心(DSMZ)，ψAB1的保藏编号为DSM 23599(保藏日2010年5月6日)，ψAB2的保藏编号为DSM 23600(保藏日2010年5月6日)。

附图说明

图1A至1J为本发明杀菌组合物的具体实施例中，鲍氏不动杆菌噬菌体的形态；

图2为鲍氏不动杆菌噬菌体对于宿主细菌的吸附率；

图3为鲍氏不动杆菌噬菌体的一步生长曲线；

图4为在表面活性剂中，鲍氏不动杆菌噬菌体的活性；

图5A说明在不同温度条件下，本发明所述的杀菌组合物的稳定性；

图5B说明在不同温度及解冻条件下，本发明所述的杀菌组合物的稳定性；

图6说明在不同酸碱度条件下，本发明所述的杀菌组合物的稳定性；以及

图7说明在化学物质存在下，本发明所述的杀菌组合物的稳定性。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域普通技术人员可由本说明书所揭示的内容了解本发明的其它优点与功效。

实施例1

噬菌体的制备：自花莲慈济医院收集的导管洗液、排水系统的废水、未经处理的污水等样本，将样本分别于4℃以5,000×g离心10分钟，将上清液以0.45-μm孔径的膜过滤，接着进行溶菌斑测试。

将10μl的样本滤液滴至覆盖在一般LB琼脂培养基上的AB菌的细菌层(bacteriallawns)(于0.7％的LB琼脂培养基中)，样本滤液中若含有噬菌体，则会于细菌层上产生清除区(clear zone)，将其挑出并浸于LB培养基，进行过滤以去除AB菌，即可得到高浓度的噬菌体。再将噬菌体稀释后，平涂于培养基上形成溶菌斑。进行至少两次的单一溶菌斑分离步骤以得噬菌体纯株。

自样本所分离的AB菌噬菌体经鉴定后共得到10株AB菌噬菌体，ψAB1-9以及ψAB11。其中，ψAB 1-7以及ψAB 9具有二十面体的头部以及短尾巴型态，如第1A至1H图所示(ψAB1，保藏编号DSM23599，DSMZ，保藏日期2010年5月6日；ψAB2，保藏编号DSM23600，DSMZ，保藏日期2010年5月6日)；ψAB8以及ψAB 11具有二十面体的头部以及收缩的尾巴型态，如第1I及1J图所示。

实施例2

为测试本发明所述的杀菌组合物的宿主专一性，选用127株鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii，本说明书中有时简称AB菌)，其中125株自花莲慈济医院收集，2株来自ATCC(American Type Culture Collection)分别为ATCC 19606与ATCC 17978。

将细菌培养于LB培养基(Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)，37℃，并根据混浊度监测细菌生长，于600nm(OD₆₀₀)测定吸光值，OD为1时表示细菌浓度为3×10⁸细胞/毫升。并于一般LB琼脂培养基上覆盖一层含有宿主细菌的0.7％的LB琼脂培养基，由此制备宿主细菌层(bacterial lawns)。

将10μl的噬菌体培养液(噬菌体浓度为10¹⁰PFU/ml)滴至细菌层，将培养基平盘于无菌层流操作台中干燥10分钟，于37℃培养18至20小时，并观察溶菌斑产生与否。

表1

结果显示，根据实施例1所分离的AB菌噬菌体于表1所列的醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、E.coli的菌株、6株肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)的菌株、及3株绿脓杆菌(P.aeruginosa)的菌株的细菌层上均未产生溶菌斑，仅于AB菌的细菌层上产生溶菌斑，显示本发明所述的杀菌组合物确实对于AB菌具有宿主专一性。其中，ψAB1、ψAB2、ψAB3、ψAB4、ψAB5、ψAB6、ψAB7、ψAB8、ψAB9、以及ψAB11分别可在25、25、4、20、28、4、29、9、21及39株AB菌的细菌层上产生溶菌斑。在127株AB菌中，噬菌体共溶裂113株AB菌(即，89％)，其中110株属于多重抗药性AB菌(MDRAB)。由于各株噬菌体皆可感染AB菌，且各自对AB菌的不同菌株(strain)之感染力略有差异，使用者可在组成物中视需要选用至少一或组合多个AB菌噬菌体。

另外，根据实施例1所分离的AB菌噬菌体可于多种AB菌之细菌层上产生溶菌斑，对于临床分离的多重抗药性AB菌菌株具备感染力，其中，ψAB2(具有头部及尾部，头部呈现20面体构造，尺寸约为60nm；尾部则具有丝状结构，用于附着于宿主细胞表面，尺寸约为9至11nm)不仅对于ATCC的两个标准菌株具有感染力，亦对于临床分离的多重抗药性AB菌具备感染力，确实可以解决院内感染与多重抗药性AB菌感染的问题。

实施例3

当宿主细菌浓度达OD₆₀₀为0.6U时，将AB菌噬菌体(纯株或是混合物)以0.0005的MOI(Multiplicity Of Infection)值添加至宿主细菌培养液中，于室温下培养。于培养0、1、2、3、4、5、10、20、30分钟的时间点取样100μl，并以0.9mL的冷LB稀释，以12,000×g离心5分钟，取上清液，测定未吸附至宿主细菌的噬菌体的量。结果如第2图所示。

观察添加噬菌体的宿主细菌培养液，发现培养液于100分钟内自混浊转为澄清，显示噬菌体将宿主细菌完全溶裂掉，证实本发明所述的杀菌组合物确实可达到杀菌效果。

由图2可知，约75％的噬菌体颗粒于2分钟内吸附至宿主细菌，约95％的噬菌体颗粒于4分钟内吸附至宿主细菌，于10分钟时达到100％的吸附。

另外，以一步生长曲线(one-step growth curve)测定噬菌体复制曲线，将OD₆₀₀为0.8U的宿主细菌离心后收取细胞，再以0.8ml的LB培养基重新溶散，使浓度为10⁹CFU/ml。将AB菌噬菌体以0.0001的MOI值添加至宿主细菌培养液中，置于4℃下30分钟，以使噬菌体吸附至宿主细菌。将混合物以12,000×g离心10分钟，再将包含受感染细菌的沉淀物以20ml的LB培养基重新溶散，于37℃下培养，每隔5分钟取样，并将样本立刻稀释及定量。结果如图3所示。

“潜伏期”的定义为自吸附(不包含预处理的10分钟)至第一次释放(burst，噬菌体溶裂细菌而释出)开始，如第3图所示潜伏期为15分钟。根据最终噬菌体颗粒量与受感染细菌初始量的比例，计算得到平均释放量约为200PFU/细胞。

因此，本实施例证实本发明所述的杀菌组合物的杀菌效果迅速、需时短、效果良好；且能在溶裂宿主细菌后释出更多量的噬菌体至环境中，可使杀菌效果持续存在。

实施例4

以表面活性剂TWEEN 20、TWEEN 80以及Triton X-100(购自Sigma-AldrichBiotechnology，USA)与自实施例1分离出的AB菌噬菌体制备本发明杀菌组合物。

已知表面活性剂的常用浓度多落在0.1～1wt％之间，因此，制备本发明所述的杀菌组合物时，包括0.1～1wt％的表面活性剂，以及起始浓度为5x10⁷PFU/ml的噬菌体，将两者混合后置于室温，每隔24小时采样测定噬菌体浓度，根据下式计算噬菌体存活率(survival fraction)：

噬菌体存活率＝取样的噬菌体浓度/噬菌体原始浓度

以测定表面活性剂的影响，当表面活性剂为1wt％的结果如图4所示。

经测定，包含0.1～1wt％的表面活性剂，均不会对AB菌噬菌体的活性造成影响。另外，由图4可知，AB菌噬菌体于Triton X-100中最稳定，TWEEN 20次之；而在TWEEN 80中虽然AB菌噬菌体的存活率变化较大，但仍然可维持足够感染宿主细菌的活性。且随着时间进展，噬菌体浓度下降的趋势则趋于缓和，再逐渐升高。以变异系数(coefficient ofvariation)评估，三种表面活性剂的CV值均低于20％，因此，证实噬菌体于此三种表面活性剂中均非常稳定。表示本发明所述的杀菌组合物很稳定。

实施例5

在不同环境条件下测定本发明杀菌组合物的稳定性。

(1)温度

将噬菌体以无菌水稀释至10⁸PFU/ml后，置于不同的温度条件下，分别为4℃、25℃、37℃、42℃、-20℃以及-80℃。在4℃、25℃及37℃的实验中，于培养24小时内每3小时采样测定噬菌体浓度，而后每星期持续追踪至12周，结果如图5A所示。在-20℃及-80℃的实验则各分为两组，第一组是重复冷冻解冻，追踪时间为12周，第二组只解冻一次，追踪时间为5周，结果如图5B所示。

(2)酸碱度

将噬菌体以酸性(pH值为4)及碱性(pH值为11)水溶液稀释到噬菌体浓度为10⁸PFU/ml后，在pH值为4.7、7、11的实验中24小时内每3小时测定浓度，而后每周固定追踪一次，连续追踪12周，结果如图6所示。

(3)化学物质

将噬菌体加入氯仿溶液(0.5％及2％)稀释浓度到10⁸PFU/ml后，在24小时内每3小时测定浓度，而后在0.5％的氯仿溶液的实验中，每周固定追踪一次，连续追踪3周；2％的氯仿溶液的实验则是追踪6周，结果如图7所示。

(4)干燥处理

将10¹⁰PFU/ml的噬菌体分为A、B两组，A组以蛋白胨(peptone)，B组以无菌水分别将噬菌体浓度稀释10倍的后再以真空离心干燥系统(speed vac)干燥处理，干燥后的A、B两组再分别重新溶解于0.5ml蛋白胨及0.5ml无菌水中，观察噬菌体在干燥前后的浓度变化，结果如表2所示。

表2

由上述测试结果发现，本发明所述的杀菌组合物在低温(-20℃、-80℃、4℃)条件下，噬菌体至少可存活8周以上且存活率达5％以上。在环境温度(25℃以及37℃)条件下，噬菌体可存活11周以上且存活率达14.9％以上。而在高温环境(42℃)下追踪2周，噬菌体存活率仍达到14.8％。

本发明所述的杀菌组合物在碱性(pH＝11)环境下，约11周后噬菌体的存活率可维持约30％，而在酸性(pH＝4)环境下，至第11周仍可测得存活的噬菌体。另，于真空干燥及重新溶解后所测得的AB菌噬菌体存活率高达20％以上。再者，本发明所述的杀菌组合物在0.5％及2％的氯仿溶液中，噬菌体可存活3周以上且存活率达30％。

综上所述，对于环境的温度、干湿度、酸碱值及化学物质，噬菌体均可维持存活率，证实本发明所述的杀菌组合物的稳定性。

实施例6

杀菌测试条件：在相同规格的容器中置入相同浓度的细菌(10⁷CFU/ml)，将包括10⁷PFU/ml的噬菌体的本发明所述的杀菌组合物喷洒至容器中，于不同时间点取样，依标准程序分别测量细菌及噬菌体浓度，根据细菌减少量测定杀菌效果。

本发明所述的杀菌组合物的成分可包括如下所示的成分：

(1)AB菌噬菌体及无菌水

(2)AB菌噬菌体及表面活性剂

(3)AB菌噬菌体、无菌水、及表面活性剂

(4)AB菌噬菌体、第二噬菌体(葡萄球菌属(Staphylococcus)噬菌体)、及无菌水

(5)AB菌噬菌体、第二噬菌体(葡萄球菌属(Staphylococcus)噬菌体)、及表面活性剂

(6)AB菌噬菌体、第二噬菌体(葡萄球菌属(Staphylococcus)噬菌体)、无菌水、及表面活性剂

另外，以喷洒无菌水作为对照组。

观察发现容器内的混合物会自混浊转为澄清，显示噬菌体将宿主细菌完全溶裂掉，并可有效降低细菌量达数个对数值(logs)，证实本发明所述的杀菌组合物确实可达到杀菌效果。

上述实施例仅例示性说明本发明所述的组合物与制备方法，而非用于限制本发明。任何本领域普通技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围如权利要求书所述。

Claims (11)

1.一种活体外杀菌组合物，其包括：

鲍氏不动杆菌噬菌体；及

载体，该载体是非离子性表面活性剂；

其中，该噬菌体与该载体间具可兼容性，以使该鲍氏不动杆菌噬菌体保有生物活性，以及

其中，该鲍氏不动杆菌噬菌体为保藏编号DSM 23599的噬菌体。

2.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其中，该鲍氏不动杆菌噬菌体是具有二十面体的头部以及短尾巴型态的短尾噬菌体科(Podoviridae)双链去氧核糖核酸病毒。

3.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其还包括是具有二十面体的头部以及收缩的尾巴型态的肌尾噬菌体科(Myoviridae)双链去氧核糖核酸病毒的鲍氏不动杆菌噬菌体。

4.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其中，该鲍氏不动杆菌噬菌体是溶裂型噬菌体。

5.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其中，该鲍氏不动杆菌噬菌体于pH 4至12的条件下保有鲍氏不动杆菌噬菌体的生物活性。

6.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其中，该组合物为溶液、悬浮液、粉末、喷雾剂或软膏形式。

7.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其还包括第二噬菌体，其中，该第二噬菌体为一种或多种选自葡萄球菌、肠球菌、肠杆菌科、非发酵革兰阴性杆菌、梭菌属或分枝杆菌属的院内感染细菌的噬菌体。

8.根据权利要求7所述的活体外杀菌组合物，其中，该非发酵革兰阴性为一种或多种选自杆菌不动杆菌、军团杆菌属或假单胞菌属的院内感染细菌的噬菌体。

9.根据权利要求1所述的活体外杀菌组合物，其中该鲍氏不动杆菌噬菌体在该组合物中的初始浓度为1x10⁷PFU/ml至1x10⁹PFU/ml。

10.一种用于医疗机构或与医疗相关的研究机构的活体外杀菌方法，其包括将有效量的如权利要求1至9项中任一项所述的杀菌组合物施用于该医疗机构或与医疗相关的研究机构，以减少该医疗机构或与医疗相关的研究机构中细菌的数量。

11.根据权利要求10所述的用于医疗机构或与医疗相关的研究机构的活体外杀菌方法，其中，该施用的方式为直接喷洒、间接喷洒、浸泡或涂抹。