CN102861324A - 治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂。试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液。制备方法包括噬菌体AB3的分离与纯化、噬菌体AB3基因组的提取、噬菌体AB3DNA的酶切分析、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析、噬菌体AB3裂解酶基因的扩增、原核表达载体的构建，以及裂解酶基因的表达及纯化。这种通过构建原核表达载体对噬菌体AB3裂解酶基因表达及纯化的方法，可用于临床上对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的治疗，具有特异性高，见效快等特点，作为新型的抗菌药物具有独特的优势和良好的应用前景。

Description

治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂

技技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂。 

背景技术

鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物具有广泛的耐药性，这使得鲍曼不动杆菌的治疗变得日益困难。碳青霉烯类抗生素被认为是目前临床治疗鲍曼不动杆菌感染最有效的药物之一。近年来感染耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌比例逐年增高，一旦细菌对碳青霉烯类抗生素耐药，则对其他抗生素亦基本耐药，患者往往死于无药可选。研究者将抗感染治疗的目光开始转向噬菌体的研究。噬菌体是一类细菌依赖性病毒，又称细菌病毒，能在菌体内快速增殖并最终裂解细菌从而达到抗菌作用。但是，活噬菌体制剂治疗细菌感染所面临的最主要障碍是宿主专一性太强，宿主谱太窄。自然分离的噬菌体具有高度专一的宿主选择性，往往只能感染单一的细菌分离株，而不能感染同一种细菌的其他分离株。这种高度专一的宿主选择性使噬菌体的应用受到极大限制。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种耐药率低，杀菌谱宽的治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂。 

本发明的技术方案如下：一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其关键是：所述生物试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液，该噬菌体AB3裂解酶的蛋白质序列为： 

MILTKDGFGI IRNELFGGKLDQNQVDAINFI IEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPI KEAGSDSYLRSKKYYPY I GYGYVQLTWKDNYER I GKL I G I DLVKNPEKALEPL I A I Q I A I KGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNI INGKDKAELIAKYAI IFERALRSL SEQ NO1； 

所述合成噬菌体AB3裂解酶的基因序列为： 

5’-ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’SEQ NO2。 

来源于噬菌体AB3的裂解酶为治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆感染提供了另一种途径。噬菌体AB3的裂解酶水解细菌肽聚糖破坏细胞壁以释放子代噬菌体，作为潜在的新型杀菌物质，具有活噬菌体制剂和抗生素无法比拟的优势，细菌对噬菌体裂解酶产生耐药性的几率小于抗生素，噬菌体AB3裂解酶的杀菌谱比噬菌体相对较宽。 

一种噬菌体AB3裂解酶的制备方法，按照如下步骤完成： 

A、噬菌体AB3的分离与纯化： 

取医院污水适量，将处于早期对数生长期的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌悬液和B50ml加入到污水中37℃24h。离心后过滤除菌。10μl处理后的污水与200μl宿主菌混合20min后，与2ml顶层琼脂混匀铺板。单个噬斑经过5次反复纯化后即可得到均一的噬菌体； 

B、提取噬菌体AB3的DNA： 

(1)挑单个细菌菌落接种于200mL液体LB培养基中，37℃振荡培养6h，至早期对数生长期； 

(2)挑噬菌体AB3单个噬斑分别接种到对应宿主菌悬液中，37℃振荡培养16h； 

(3)培养物加DNase I及RNase A至终浓度各1μg/m，37℃×1h； 

(4)按5.84g/100mL加入NaCl，混匀溶解，冰浴1h，离心10000g×10min，收集上清； 

(5)加入固体PEG8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃离心12000g×10min，弃尽上清； 

(6)用2mLTM液混悬沉淀； 

(7)加等体积氯仿，振荡30sec，离心5000g×10min，收集上层水相； 

(8)加DNase I至终浓度5μg/m，RNase A至终浓度1μg/mL，37℃温育1h； 

(9)然后加入EDTA(pH8.0)至终浓度20mmol/L； 

(10)加蛋白酶K至终浓度50μg/m，加SDS至终浓度0.5％，混匀，56℃×1h； 

(11)等体积平衡酚(pH8.0)抽提，离心5000g×10min，收集上层水相； 

(12)等体积氯仿再抽提一次，离心5000g×10min，收集上层水相； 

(13)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃离心12000g×10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀； 

(14)用适量TE(pH8.0)混悬沉淀，在核酸定量仪上粗略定量，-20℃保存； 

C、噬菌体AB3DNA的酶切分析： 

取上述得到的噬菌体核酸溶液，常规进行酶切。于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，90V电压1h。使用限制性内切酶Hind I、BamH I、EcoR I、Pst I、XbaI、Xho I、BglI、Aat I、Dra I、Nhe I、Sac I和Sa I分别消化噬菌体核酸； 

D、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析； 

灌注10％分离胶，聚合后再灌注5％积层胶。用5×SDS-PAGE上样缓冲液混合样品，100℃10min后立即移至冰上冷却。离心后逐孔加样，最后将1×SDS-PAGE的上样缓冲液加入剩余孔。给予8V/cm电压，待染料前端进入分离胶后，15V/cm电压继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部； 

E、噬菌体AB3裂解酶基因的PCR反应扩增； 

PCR反应扩增的引物： 

正向引物：5’-TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3’SEQNO3 

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3’SEQ NO4 

1)试管编号(N)：N=样本编号数量+1个阴性对照 

2)PCR反应体系 

3)PCR循环体系： 

4)1.5％琼脂糖凝胶检测： 

在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，检测条带的是否存在； 

F、原核表达载体的构建； 

噬菌体AB3裂解酶基因以Nco I和Xho I酶切位点装入pET28a载体中， 

在蛋白C端引入6His tag作为亲和纯化标签。经测序验证正确后，在大肠杆菌中表达； 

G、噬菌体AB3裂解酶基因的表达及纯化； 

将噬菌体AB3表达质粒转化到表达菌株BL21(DE3)中，第二天挑单克隆到200ml LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，加入1mM IPTG分别于25℃诱导表达20h，37℃诱导表达6h。诱导后，离心收集菌体。PBS溶液悬起菌体，超声波破碎菌体，4℃冷冻离心，上清部分用Ni柱纯化，以含50mM咪唑PBS溶液洗涤杂蛋白，以含500mM咪唑的PBS溶液洗脱。并取样SDS-PAGE检测。 

在上述技术方案中，将耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌培养至分裂旺盛期，可有效保证菌株的繁殖，确保实验的有效进行；采用成熟的PCR反应扩增技术，保证了制备过程的准确性，并将PCR扩增的退火温度设定为55℃，引物浓度确定为5pmol/ul，可得到较多的噬菌体AB3裂解酶基因的扩增产物，且表达纯化后目的蛋白的产量和纯度也最高。所得蛋白质的分子量与理论分子量22.3kD基本一致。 

所述的噬菌体AB3裂解酶的基因序列长度为558bp，基因序列如SEQ NO2所示，噬菌体AB3裂解酶的基因序列全部表达，合成的蛋白质长度为185aa， 

氨基酸序列如SEQ NO1所示。 

所述生物试剂治疗的最佳给药途径是滴鼻途径。滴鼻途径可以使该生物试剂在体内的存留时间更长，疗效更好。 

所述步骤A中所述噬菌体浓度的确定采用双层琼脂法，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌由重庆巿临床检验中心提供，采用双层琼脂法所形成噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确。 

所述步骤B、G中SDS、蛋白酶K、PEG8000、EDTA、DNA酶、RNA酶、LB培养基、咪唑、BSA牛血清蛋白为美国sigma公司生产。 

所述步骤C、F中限制性内切酶HindI、BamHI、EcoRI、PstI、XbaI、BglII、Aat I、DraI、NheI、SacI、SaII、XhoI、NcoI为加拿大Fermentas公司生产。 

所述步骤E中设计用于PCR反应扩增的引物是： 

正向引物：5’-TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3’SEQ NO3 

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3’SEQ NO4 

其中基因序列SEQ NO3的画线部分为Nco I酶切位点，SEQ NO4的画线部分为Xho I酶切位点，更好的保证了原核表达载体的构建，引物为上海生工生物工程公司生产。KOD DNA聚合酶为大连宝生物工程公司生产。 

所述步骤G中Ni-NTA Sepharose为美国GE公司生产。 

所述临床前期动物研究中BABLc小鼠(SPF级，21±3g)购自重庆医科大学实验动物中心(动物生产许可证号SCXK渝2007-0001，动物使用许可证号SYXK渝2007-0001)。 

有益效果： 

1、噬菌体AB3裂解酶具有与抗生素完全不同的杀菌机制，细菌对噬菌体裂解酶产生耐药性的几率小于抗生素。 

2、噬菌体需在受体识别蛋白特异性识别并吸附细菌表面受体的前提下才能裂解细菌，而噬菌体裂解酶不需要该过程。因此，噬菌体AB3裂解酶的杀菌谱比噬菌体相对较宽。 

3、噬菌体裂解酶对细菌发挥作用极其迅速，足以使其杀灭细菌。 

4、制备过程技术较成熟，生产成本低。 

5、临床前研究显示：噬菌体AB3裂解酶与对照组相比，疗效明显，安全性好，有应用前景。 

附图说明

图1噬菌体AB3电镜图片(200000×)。 

图2噬菌体AB3基因组单酶切电泳图。 

图3噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析。 

图4噬菌体AB3裂解酶基因PCR扩增产物。 

图5噬菌体AB3裂解酶表达的SDS-PAGE分析。 

图6对照组小鼠肺组织(HE×400)。 

图7治疗组小鼠肺组织(HE×400)。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明： 

实施例1 

A、噬菌体AB3的分离与纯化； 

取医院污水处理中心污水1，将40株处于早期对数生长期的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌悬液和LB50ml加入到污水中37℃24h。离心后过滤除菌。10μl处理后的污水与200μl宿主菌混合20min后，与2ml顶层琼脂混匀铺板。单个噬斑经过5次反复纯化后即可得到均一的噬菌体，所得噬菌体浓度经过双层琼脂法确认。共分离出10株裂解性耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌噬菌体。将40株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌制成菌苔，将分离所得的10株噬菌体(108PFU/ml)各取10ul滴在各个菌苔上的相应位置待干，37℃12h后观噬菌斑形成状况，得到相应噬菌体的裂解率。选取其中裂解谱相对较宽的噬菌体AB3作为进一步研究的对象，其裂解率为62.5％。电镜可见纯化的噬菌体AB3颗粒类似多面体立体对称结构，直径约60-70nm，无尾，无囊膜(见图1)。 

B、提取噬菌体AB3的DNA： 

(1)挑单个细菌菌落接种于200mL液体LB培养基中，37℃振荡培养6h，至早期对数生长期。 

(2)挑噬菌体AB3单个噬斑分别接种到对应宿主菌悬液中，37℃振荡培养16h。 

(3)培养物加DNase I及RNase A至终浓度各1μg/m，37℃×1h。 

(4)按5.84g/100mL加入NaCl，混匀溶解，冰浴1h，离心10000g×10min，去除菌体及碎片，收集上清。 

(5)加入固体PEG8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃离心12000g×10min，尽量弃尽上清。 

(6)用2mL M液混悬沉淀。 

(7)加等体积氯仿，振荡30sec，离心5000g×10min，收集上层水相。 

(8)加DNase I至终浓度5μg/m，RNase A至1μg/m，37℃温育1h，再次降解宿主菌来源的DNA及RNA。 

(9)然后加入EDTA(pH8.0)至终浓度20mmol/L，终止DNase I活性。 

(10)加蛋白酶K至终浓度50μg/m，加SDS至终浓度0.5％，混匀，56℃×1h，破坏噬菌体衣壳，释放出噬菌体核酸，同时也降解DNase I。 

(11)等体积平衡酚(pH8.0)抽提，离心5000g×10min，收集上层水相。 

(12)等体积氯仿再抽提一次，离心5000g×10min，收集上层水相。 

(13)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃离心12000g×10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀。 

(14)用适量TE(pH8.0)混悬沉淀，在核酸定量仪上粗略定量，-20℃保存。 

C、噬菌体AB3DNA的酶切分析； 

取上述得到的噬菌体核酸溶液，常规进行酶切。于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，90V电压1h。使用限制性内切酶Hind III、BamH I、EcoR I、Pst I、Xba I、Xho I、Bgl I、Aat I、Dra I、Nhe I、Sac I和Sa I分别消化噬菌体核酸。仅 有Hind I和Bgl I能够切开基因组。上述酶均为双链DNA酶，故噬菌体基因组为双链DNA。将各条带相加，估计基因组大小在35kb左右(见图2左.BglI；中.Hind I；右.Marker)。 

D、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析； 

灌注10％分离胶，聚合后再灌注5％积层胶。用5×SDS-PAGE上样缓冲液混合样品，100℃10min后立即移至冰上冷却。离心后逐孔加样，最后将1×SDS-PAGE的上样缓冲液加入剩余孔。给予8V/cm电压，待染料前端进入分离胶后，15V/cm电压继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。按常规进行蛋白SDS-PAGE电泳，可见蛋白条带上至少出现了13个条带，相对分子质量从大到小依次为264000、226000、109000、100000、94000、86000、69000、62000、52000、49000、47000、43000和35000，说明噬菌体至少有13个结构蛋白。其中相对分子质量为35000的蛋白条带最粗，是噬菌体的主要衣壳蛋白(见图3左.噬菌体AB3衣壳蛋白；右.Marker)。 

E、噬菌体AB3裂解酶基因的PCR反应扩增； 

PCR反应扩增的引物： 

正向引物：5’-TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3’SEQ NO3 

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3’SEQ NO4 

1)试管编号(N)：N=样本编号数量+1个阴性对照 

2)PCR反应体系 

3)PCR循环体系： 

4)1.5％琼脂糖凝胶检测 

完成PCR循环之后，立即取6ul PCR产物加相应DNA上样缓冲液，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，检测条带的是否存在(见图4左.噬菌体AB3裂解酶基因；右.DNA marker)； 

F、原核表达载体的构建； 

噬菌体AB3裂解酶基因以Nco I和Xho I酶切位点装入pET28a载体中，在蛋白C端引入6Hi s tag作为亲和纯化标签。经测序验证正确后，在大肠杆菌中表达。与理论序列的比对结果表明，除了在噬菌体AB3裂解酶的N端引入载体上的MG两个氨基酸和C端的引入的亲和纯化标签，测序序列与理论序列完全一致。可进一步往下做表达纯化； 

G、噬菌体AB3裂解酶基因的表达及纯化； 

将噬菌体AB3表达质粒转化到表达菌株BL21(DE3)中，第二天挑单克隆到200ml LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6，加入1mM IPTG分别于25℃诱导 表达20h，37℃诱导表达6h。诱导后，离心收集菌体。PBS溶液悬起菌体，超声波破碎菌体，4℃冷冻离心，上清部分用Ni柱纯化，以含50mM咪唑PBS溶液洗涤杂蛋白，以含500mM咪唑的PBS溶液洗脱。并取样SDS-PAGE检测。表达纯化结果提示，25℃进行诱导表达上清中目的蛋白含量最高，纯化后目的蛋白浓度约为0.2mg/ml，总体积8ml，蛋白总量1.6mg，纯度95％。SDS-PAGE显示该蛋白质分子量与理论分子量22.3kD基本一致(见图5，1：37℃诱导表达的全菌；2：37℃诱导表达后全菌裂解上清；3：37℃表达，Ni柱纯化样品，上样8ul；4：37℃表达，Ni柱纯化样品，上样16ul；5：25℃诱导表达的全菌；6：25℃诱导表达后全菌裂解上清；7∶25℃表达，Ni柱纯化样品，上样8ul；8：25℃表达，Ni柱纯化样品，上样16ul；9：Marker；10：0.5ug BSA；11：1ug BSA；12：2ug BSA；13：5ug BSA)； 

临床前期动物研究结果： 

将系列稀释的菌液经鼻滴入5组小鼠(每组n=5)，观察小鼠7d，导致一组小鼠全部死亡的最小剂量即100％最低致死量，将小鼠病变肺组织研磨后接种至LB培养基，若有细菌生长，用16S rRNA方法进行菌株鉴定，若鉴定为鲍曼不动杆菌，说明感染动物模型建立成功。取2倍100％最低致死量为动物感染剂量。取2组小鼠(每组n＝20)，用2倍100％最低致死量的菌液滴鼻后，分别滴入对照LB培养液及噬菌体AB3裂解酶，观察小鼠存活状态7d。结果：对照LB培养液及噬菌体AB3裂解酶治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌肺部感染小鼠，存活率分别为0％和85％，2组间存活率具有非常显著差异(P＜0.01)。取对照组及治疗组小鼠的肺组织送病理学检查，可见对照组小鼠肺泡腔淤血水肿，肺泡间隔内毛细血管充血扩张；而噬菌体AB3裂解酶治疗组小鼠的肺组织结构基本正常(见图6和图7)。 

Claims (6)

1.一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于：所述生物试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液，该噬菌体AB3裂解酶的氨基酸序列为：

MILTKDGFGIIRNELFGGKLDQNQVDAINFIIEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWKDNYERIGKLIGIDLVKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNIINGKDKAELIAKYAIIFERALRSL   SEQ N01；所述合成噬菌体AB3裂解酶的基因序列为：

5’-ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’SEQ N02。

2.一种如权利要求1所述噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于，按照如下步骤完成：

A、噬菌体AB3的分离与纯化：

取医院污水适量，将处于早期对数生长期的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌悬液和LB 50ml加入到污水中37℃，24h。离心后过滤除菌。10μl处理后的污水与200μl宿主菌混合20min后，与2ml顶层琼脂混匀铺板。单个噬斑经过5次反复纯化后即可得到均匀的噬菌体；

B、提取噬菌体AB3的DNA：

(1)挑单个细菌菌落接种于200mL液体LB培养基中，37℃振荡培养6h，至早期对数生长期；

(2)挑噬菌体AB3单个噬斑分别接种到对应宿主菌悬液中，37℃振荡培养16h；

(3)培养物加DNase I及RNase A至终浓度各1μg/mL，37℃×1h；

(4)按5.84g/100mL加入NaCl，混匀溶解，冰浴1h，离心10000g×10min，收集上清；

(5)加入固体PEG 8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃离心12000g×10min，弃尽上清；

(6)用2mL TM液混悬沉淀；

(7)加等体积氯仿，振荡30sec，离心5000g×10min，收集上层水相；

(8)加DNase I至终浓度5μg/mL，RNase A至终浓度1μg/mL，37℃温育1h；

(9)然后加入EDTA(pH8.0)至终浓度20mmol/L；

(10)加蛋白酶K至终浓度50μg/mL，加SDS至终浓度0.5％，混匀，56℃×1h；

(11)等体积平衡酚(pH8.0)抽提，离心5000g×10min，收集上层水相；

(12)等体积氯仿再抽提一次，离心5000g×10min，收集上层水相；

(13)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃离心12000g×10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀；

(14)用适量TE(pH8.0)混悬沉淀，在核酸定量仪上粗略定量，-20℃保存；

C、噬菌体AB3 DNA的酶切分析：

取上述得到的噬菌体核酸溶液，常规进行酶切。于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，90V电压1h。使用限制性内切酶Hind III、BamH I、EcoR I、Pst I、XbaI、Xho I、Bg lII、Aat II、Dra I、Nhe I、Sac I和Sa II分别消化噬菌体核酸；

D、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析；

灌注10％分离胶，聚合后再灌注5％积层胶。用5×SDS-PAGE上样缓冲液混合样品，100℃10min后立即移至冰上冷却。离心后逐孔加样，最后将1×SDS-PAGE的上样缓冲液加入剩余孔。给予8V/cm电压，待染料前端进入分离胶后，15V/cm电压继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部；

E、噬菌体AB3裂解酶基因的PCR反应扩增；

PCR反应扩增的引物：

正向引物：5’-TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3’SEQ NO3

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3’SEQ NO4

1)试管编号(N)：N＝样本编号数量+1个阴性对照

2)PCR反应体系

3)PCR循环体系：

4)1.5％琼脂糖凝胶检测：

在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，检测条带的是否存在；

F、原核表达载体的构建；

噬菌体AB3裂解酶基因以Nco I和Xho I酶切位点装入pET28a载体中，在蛋白C端引入6His tag作为亲和纯化标签。经测序验证正确后，在大肠杆菌中表达；

G、噬菌体AB3裂解酶基因的表达及纯化；

将噬菌体AB3表达质粒转化到表达菌株BL21(DE3)中，第二天挑单克隆到200ml LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，加入1mM IPTG分别于25℃诱导表达20h，37℃诱导表达6h。诱导后，离心收集菌体。PBS溶液悬起菌体，超声波破碎菌体，4℃冷冻离心，上清部分用Ni柱纯化，以含50mM咪唑PBS溶液洗涤杂蛋白，以含500mM咪唑的PBS溶液洗脱。并取样SDS-PAGE检测。

3.根据权利要求1所述的治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于：所述的噬菌体AB3裂解酶基因序列的长度为558bp，噬菌体AB3裂解酶的基因序列全部表达，合成的蛋白质长度为185aa。

4.根据权利要求1所述的治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于：所述生物制剂治疗的最佳给药途径是滴鼻途径。

5.根据权利要求2所述的噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于：所述步骤A中噬菌体浓度的确定采用双层琼脂法。

6.根据权利要求2所述的噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于：所述步骤E中所设计用于PCR反应扩增的引物是：

正向引物：5’-TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3’SEQ NO3

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3’SEQ NO4

其中基因序列是SEQ NO3的画线部分为Nco I酶切位点，SEQ NO4的画线部分为Xho I酶切位点。

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