CN108659106A

CN108659106A - 重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1及制备方法与用途

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Publication number: CN108659106A
Application number: CN201710189951.1A
Authority: CN
Inventors: 刘全忠; 刘原君
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2037-03-28
Also published as: CN108659106B

Abstract

本发明公开了一种对沙眼衣原体生长具有特异性抑制作用的重组噬菌体衣壳蛋白1 (Recombinant phage capsid protein1，R‑phage‑Cp1)及制备方法与用途。本发明应用分子克隆等基因工程技术，从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体（phiCPG1）基因组中用PCR技术克隆出其衣壳蛋白1基因，进行针对沙眼衣原体PmpI的修饰，成为拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白基因1。其与原核表达质粒pet30a(+)定向连接构建表达载体。表达纯化出的重组噬菌体衣壳蛋白1(R‑phage‑Cp1）作用于沙眼衣原体标准株D‑K型和临床分离株，大肠杆菌、支原体等多种微生物，结果证实R‑phage‑Cp1蛋白对沙眼衣原体具有明显的特异性抑制作用。体内动物实验显示R‑phage‑Cp1蛋白对沙眼衣原体在恒河猴生殖道的感染具有一定的治疗作用。该蛋白有望用于临床治疗沙眼衣原体的泌尿生殖道感染，从而改善沙眼衣原体泌尿生殖道感染迁延难治、易于复发和耗资巨大的现状。

Description

重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1及制备方法与用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是涉及一种针对沙眼衣原体有特异抑制作用的重组衣原体噬菌体外膜R-phage-Cp1蛋白及其制备方法与用途。背景技术

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是涉及一种针对沙眼衣原体有特异抑制作用的重组衣原体噬菌体外膜R-phage-Cp1蛋白及其制备方法与用途。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, 简写为C.t)泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见的性传播疾病，据WHO估计，世界上每年约新增8900万衣原体感染患者。我国在20～64岁人群进行全国范围的抽样研究得出性工作者C.t感染率为38%。2010年美国统计有426/10万人衣原体感染者，超过美国人口的0.4%，成为所有疾病中前5位的疾病。

泌尿生殖道C.t感染主要引起男性尿道炎和女性粘液脓性宫颈炎。C.t的慢性迁延感染可以引起一系列严重的并发症和后遗症，表现为男性附睾炎、前列腺炎、直肠炎和女性子宫内膜炎、输卵管炎、不孕症、异位妊娠、流产、盆腔炎性疾病和垂直传播等。据世界卫生组织研究报道,不孕妇女中C.t感染率为18%～20% 。沙眼衣原体感染的临床症状轻，病情隐匿，但迁延难愈。

由于沙眼衣原体特殊的生物学特性，抗菌素治疗的效果并不令人满意，难以将其从人体彻底清除。随着近年来耐药C.t株的报道越来越多，许多学者把精力投入到了衣原体预防性和治疗性疫苗的研究中，包括蛋白疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗，甚至DNA疫苗，但迄今为止尚未获得具有免疫保护作用的疫苗。沙眼衣原体感染已成为威胁人类的公共健康难题。

国际衣原体流行趋势和新近研究显示：把衣原体这一具有特殊生物学特性的病原体作一般细菌给予抗菌素治疗可能没有前途,衣原体噬菌体可能会成为解决这个难题最重要的途径，有研究显示豚鼠结膜炎衣原体的噬菌体phiCPG1能够使宿主衣原体的生活周期受到抑制，使具有感染性的原体减少，因此国内外都聚焦在衣原体噬菌体的发现和研究上，但迄今为止尚未发现沙眼衣原体噬菌体。衣原体噬菌体上的三种衣壳蛋白1，2，3，由开放读码框1、2、3编码，在衣原体噬菌体phiCPG1与CPAR39之间相似性高达99.5%，在噬菌体Chp2与Chp3之间的相似性也很高，目前认为该蛋白可能是潜在的受体结合区，与噬菌体对宿主的黏附、植入和识别过程有关。

发明内容

本发明的目的旨在为克服临床目前治疗沙眼衣原体的困境，选择对宿主衣原体生长周期具有抑制作用的噬菌体phiCPG1为研究对象进行优化，提供对沙眼衣原体生长具有抑制作用的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）及制备方法与用途。本发明通过实验研究证实，所R-phage-Cp1对沙眼衣原体生长具有明显的抑制作用，具有重要的科研和临床价值。

为实现本发明的目的，本发明公开了一种对沙眼衣原体生长有特异抑制作用的衣原体噬菌体重组衣壳蛋白1（R-phage-Cp1），其特征在于该蛋白是从含有重组质粒/pet30a（+）的大肠杆菌中原核重组表达，并通过纯化得到的单一蛋白。

本发明还公开了一种制备所述重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的方法，其特征在于从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1提取噬菌体基因组DNA，PCR扩增出编码衣壳蛋白1的基因，针对沙眼衣原体衣壳蛋白1进行修饰成拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1基因，再克隆到pet30a（+）载体质粒中构建成原核表达的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌后，IPTG诱导表达蛋白，然后经过SDS-PAGE纯化

本发明所述针对沙眼衣原体的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）可以在泌尿生殖道沙眼衣原体感染性疾病的预防和治疗中应用。

本发明基于现有技术的研究基础，构建针对沙眼衣原体的噬菌体衣壳蛋白1的重组质粒，原核表达并纯化得到蛋白，通过一系列体外细胞实验证实该重组噬菌体蛋白能够特异抑制沙眼衣原体标准株D-K型和临床野生株的生长，而对大肠杆菌、McCoy细胞等的生长没有抑制作用；通过恒河猴体内实验证实蛋白对沙眼衣原体感染具有一定的治疗作用。

【附图说明】

图1：扩增出的拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1基因；

图2：基因和质粒pet30a（+）的双酶切；

图3：重组质粒- pet30a(+)的双酶切鉴定；

图4：重组质粒- pet30a(+)的PCR扩增鉴定；

图5：重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的鉴定；

图6：纯化后的重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的鉴定

【具体实施方式】

本发明从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1中提取噬菌体基因组DNA，PCR扩增出编码衣壳蛋白1的基因，进行针对沙眼衣原体外膜蛋白的修饰成拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1基因，克隆到pet30a（+）载体质粒中构建成原核表达的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌后，IPTG诱导表达蛋白。

重组表达的蛋白结构描述如下：

（1）序列特征

长度：553aa

类型：蛋白质

（2）分子类型：氨基酸

（3）豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1基因组DNA来自美国马里兰大学Patrick教授实验室。

（4）蛋白的氨基酸序列描述如下：

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FRSNATGSLDAWHLAQQFENLPTLSPEFIEENPPMDRVVA 520

VDTEPDFLLDGWFSLRCARPMPVYSVPGLIDHF 553

一、重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的制备和鉴定

1. 重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的制备

①含有phiCPG1噬菌体的衣原体GPIC株培养后，收集上清液，4℃30000rpm离心30 min，0.22um滤膜过滤除菌，随后加入Dnase I，37℃作用1hr，在4℃下 100000rpm离心3hr，收集phiCPG1沉淀颗粒，加蛋白酶K后37℃作用1hr。用酚氯仿抽提，乙醇沉淀制备噬菌体单链DNA，－20℃储存备用。

②设计基因的扩增引物P1 5’ AGTAGGGAAGCCATGGTTAGGAGG 3’； P2 5’ACTGACTCGAGATTAGAAATGATCAAT 3’。 P1、P2引物扩增的基因片段全长1686碱基对（basepair, bp）修饰primer 1:gTTCAAggTTTAggAATTCAAgTgCCgAATCTTAgTgCCCCAAATCCTATA

The primer 2: TATAggATTTggggCACTAAgATTCggCACTTgAATT

CCTAAACCTTgAAC

其中包括C.t E型完整的omp1基因1662bp，两个限制性核酸内切酶识别位点共12bp，保护性碱基12bp，PCR反应体系见表1。PCR扩增条件：95℃预变性2min；94℃变性15s；58℃退火30s；68℃延伸120s；35个循环后，68℃后延伸10min，使反应完全。取10μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳后与Marker对照，在1700bp左右的位置出现清晰特异性条带，与要扩增的目的基因片段大小一致，提示PCR成功，结果见图1，（1、2泳道在1700bp处有扩增产物，M: DNAMarker）。

表1：omp1基因PCR扩增体系

成分	加样体积	终浓度
			10×pfu Buffer	5μl	Mg^2＋1.5mM
dNTPmix	5μl	0.25 mM each
			上游引物P1	2μl	2μM
下游引物P2	2μl	2μM
			模板DNA	5μl	100～200ng
Pfu DNA聚合酶	1μl	2.5u
			双蒸水	补足至50μl

③使用限制性核酸内切酶NcoI和XhoI切割扩增的基因和pet30a(+)载体质粒，37℃保温6h。结果显示：双酶切后的基因大小为1700bp左右，提示基因片段中间没有NcoI和XhoI的酶切位点，见图2（1：双酶切基因；M: DNA Marker）；双酶切载体后在约5400bp处有清晰的DNA条带，提示酶切后质粒的环状结构断开成线状，片段与pet30a(+)载体的理论大小一致，见图2（双酶切pet30a(+)质粒；M: DNA Marker）。将基因和pet30a(+)载体的双酶切产物分别在1%琼脂糖凝胶中电泳后切下目的片段，按照琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒说明操作，回收双酶切片段，分别溶于20μl蒸馏水中。将上述酶切后回收的基因与pet30a(+)质粒按大约4:1的分子比率建立反应体系，16℃反应16～24h，在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应，构建成的重组表达载体。

④ 氯化钙法将重组质粒转化至制备感受态E.coli DH5α，此步骤设立两个对照组：阳性对照，取10μl(约40ng) pet30a(+)质粒转化感受态E.coli；阴性对照，不加质粒，代以10μl蒸馏水转化感受态E.coli。结果阳性对照平板与连接转化平板都有菌落生长，而且前者较后者菌落密集，阴性对照平板无菌落生长。

⑤酶切鉴定

碱裂解法小量提取转化到E.coli DH5α中的重组质粒，NcoI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，37℃保温过夜，1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示双酶切后- pet30a(+)重组质粒被切成1.7 Kb和5.4Kb两个片段，证明基因插入到了pet30a(+)质粒内，见图3（1-4:重组质粒的双酶切；5：pet30a(+)载体质粒的双酶切；M: DNA Marker）。

⑥扩增鉴定

上述酶切的“重组质粒”为模板，用P1、P2引物PCR扩增重组质粒- pet30a(+)中的基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在约1700bp位置有清晰的扩增产物，产物片段的长度与基因相一致，证实重组质粒中有基因片断插入，见图4（1-4:重组质粒的扩增；M: DNAMarker）。

⑦基因序列分析

经过重组质粒的序列测定分析，结果与Genbank中的豚鼠结膜炎噬菌体phiCPG1基因组（登陆号：NC_001998 ）中的序列相比较其相似性为97%，序列分析结果也显示插入位点处插入的方向和读码框均正确无误。

2.重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的鉴定

① 蛋白的表达

将-pET30a(+)重组质粒转化至BL21感受态细胞接种至带有卡那霉素抗性的LB平皿中，37 ℃过夜培养。挑取单菌落接种至含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，以1：100的比例转接扩增4 h，至对数生长期，加入IPTG(终浓度0．03 mmol／L)诱导2 h，离心收集细菌沉淀，加入溶菌酶（终浓度3mg/ml）和Triton-X 100(终浓度3%)超声破碎仪碎菌，收集沉淀。沉淀中加入PBS(含6mol/L尿素)，以20%的振幅超声重悬沉淀，可见管内液体变得清亮，冻存于－80℃。

② 蛋白的鉴定

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)法鉴定诱导表达蛋白的分子量，与对照BL21和含有空质粒pet30a（+）菌体相比，含有重组质粒- pet30a(+)的菌体可见在分子量大约70 000处有明显的蛋白条带，用Western印迹鉴定蛋白的特异性，一抗为抗组氨酸标签单抗，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，显色剂为BCIP/NBT底物显色液，只有含有重组质粒-pet30a(+)的菌体在分子量大约70 000处有明显的蛋白条带，而对照BL21和含有空质粒pet30a（+）的菌体均没有条带，见图5（1含有- pet30a(+)重组质粒的菌体蛋白；2含有空质粒pet30a(+)的菌体蛋白；3空的BL21菌体蛋白；M: 蛋白Marker）。

③蛋白的纯化

将诱导表达的蛋白混合液进行丙烯酰胺凝胶电泳，制备凝胶时使用只有一个上样孔的梳子，每次上样700ul,恒140V，电泳1h；电泳结束后凝胶从玻璃板上取下，放入0.25M的KCL溶液中，染色10min,目的条带被染为乳白色，用刀片切下，将目的条带放入盛有Tris-甘氨酸1.0ml电泳液的透析带中；透析带放入水平电泳槽中，置于冰上，电泳液为Tris-甘氨酸，恒100mA电流，电泳15min，等电泳液变凉后，再电泳15min；透析液吸入1.5ml的Ep管中，-80℃保存。SDS—PAGE法和Western印迹对纯化的蛋白进行鉴定，结果如图6所示，考马斯亮蓝染色结果可见分子量大小正确、单一的目的条带，Western印迹结果显示相应位置处有目的条带，见图6（1:纯化后的蛋白；M: 蛋白Marker）。

④蛋白的定量

取一块酶标板，按照表2加入试剂

表2 标准品BSA的加入比例

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀；各孔加入200μlBCA工作液；把酶标板放在振荡器上振荡30s，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定，以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μl，加入BCA工作液200μl，充分混匀，37℃放置30min后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

根据所测样本的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），

除以样品稀释液总体积（20μl），乘以样品稀释倍数即为样品试剂浓度（单位：μg/μl）。

⑤蛋白氨基酸序列：

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二、重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）对沙眼衣原体的抑制作用

1.体外分析R-phage-Cp1蛋白对沙眼衣原体的作用

①R-phage-Cp1蛋白与C.t的共同培养：取两次冻融并经玻璃珠震荡后的衣原体液体200μL，加入6.25 μL的蛋白，另取出200 μL衣原体液，分别加入培养液、Tris-甘氨酸溶液做对照，使R-phage-Cp1蛋白的终浓度为53 μg/mL，室温作用3 h，使R-phage-Cp1蛋白与衣原体原体充分接触，将等量的上述混合物分别加入单层致密McCoy细胞中，离心1 h后间隔2 h换感染液，离心液和感染液中均含有相同体积的培养液、Tris-甘氨酸溶液、蛋白，孵箱中培养48 h后弃去各孔中的液体，自然干燥，甲醇室温固定10 min后，碘染色计数包涵体数，取30个视野下的包涵体数求平均值，比较各组之间包涵体数的差异，每一菌株均重复三次试验。

将R-phage-Cp1蛋白作用于沙眼衣原体的D、E、F、G、H、I、K各型标准株和临床野生株。

②R-phage-Cp1蛋白对大肠杆菌BL21和DH5α的作用检测

取出冻存的细菌BL21和DH5α，室温使其融解,取500 μL接种至5 mL的LB培养基中，摇床37 ℃，150 rpm振荡过夜。LB培养基稀释上述菌液，使OD620值为0.2,将上述稀释好的菌液取96 μL接种至96孔板中，在各孔中补加3.2 μL的LB培养基、Tris-甘氨酸溶液、R-phage-Cp1蛋白，总体积为100 μL，R-phage-Cp1蛋白的终浓度为53 μg/mL，每组设3个复孔，将96孔板放入37℃温箱孵育16 h后，酶标仪测波长595nm的各孔吸光度值（OD595），比较各组之间吸光度值的差异，重复三次试验，数据结果以±s表示，用SPSS 13.0软件进行单向方差分析

③R-phage-Cp1蛋白对McCoy细胞的作用检测

取对数生长期的McCoy细胞，消化后调整细胞浓度为5×10⁴/mL，在96孔板中每孔加入96.8 µL的细胞悬液，置37 ℃、5 ％CO2孵箱培养，转天每孔依次加入3.2 µL培养液、Tris-甘氨酸溶液、R-phage-Cp1蛋白，各设三个复孔，每孔的终体积为100 µL。培养48 h后取出培养板，每孔加MTT 20 µL（5mg/mL），置37 ℃、5％CO₂孵箱中继续培养4 h。取出培养板，500 g离心5 min后弃上清。每孔加入100 µL DMSO后摇动混匀，µQuant酶标仪测波长570nm的各孔吸光度值（OD₅₇₀）。比较各组之间吸光度值的差异，重复三次试验，数据结果以±s表示，用SPSS 13.0软件进行单向方差分析。

2.体内分析R-phage-Cp1蛋白对沙眼衣原体的治疗效果

沙眼衣原体E型标准株感染的恒河猴四只，分为Tris-甘氨酸溶液和R-phage-Cp1蛋白处理组两组，E型沙眼衣原体的原体攻击后第一天开始，分别取Tris-甘氨酸溶液和R-phage-Cp1蛋白溶液以女性拭子经阴道擦洗阴道和宫颈，以吸湿性凝胶海绵固定，连续5天，第六天用女性阴道拭子于恒河猴阴道内，旋转15-20次后取出，将拭子涂于玻片上，至空气中干燥，甲醇固定10分钟后，加荧光抗体20ul，置于湿盒中37℃孵育作用45分钟，缓冲液冲洗后吸水纸吸干多余的液体自然干燥，加盖玻片后荧光显微镜下观察。

综上所述，应用构建的针对沙眼衣原体的重组噬菌体衣壳蛋白1(R-phage-Cp1）进行了一系列体内和体外实验，结果证实：

1.原核表达的重组噬菌体衣壳蛋白1(R-phage-Cp1）对沙眼衣原体的生长具有抑制作用，而对大肠杆菌BL21、DH5α和真核细胞McCoy等的生长没有抑制作用，说明这种抑制作用具有特异性。

2.原核表达的重组噬菌体衣壳蛋白1(R-phage-Cp1）对恒河猴沙眼衣原体E型标准株的生殖道感染具有一定的治疗作用。

氨基酸序列：

[0013] （4）：

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[0023] （5）：

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Claims

1.一种对沙眼衣原体生长有抑制作用的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1(R-phage-Cp1），其特征在于该蛋白是从含有重组质粒/pet30a（+）的大肠杆菌中原核重组表达，并通过纯化得到的单一蛋白。

2.按照权利要求1所述的R-phage-Cp1蛋白，其特征在于所说的R-phage-Cp1蛋白氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表所示。

3.按照权利要求1所述的R-phage-Cp1蛋白，其特征在于所说的原核表达载体为pet30a（+）。

4.一种按照权利要求1所述R-phage-Cp1蛋白的制备方法，其特征在于从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1提取噬菌体基因组DNA，PCR扩增出编码衣壳蛋白1的基因，进行针对沙眼衣原体omp1的修饰，克隆到pet30a（+）载体质粒中构建成原核表达的重组质粒。

5.重组质粒转化至大肠杆菌后，IPTG诱导表达R-phage-Cp1蛋白。

6.一种按照权利要求1所述的R-phage-Cp1蛋白，对沙眼衣原体标准株D-K和临床野生株的生长具有明显的抑制作用,对沙眼衣原体在恒河猴生殖道的感染具有一定的治疗作用。