CN105713916B - 一种铜绿假单胞菌基因及其dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种铜绿假单胞菌OprF‑VP22基因，以及该基因作为制造防治铜绿假单胞菌感染疫苗的用途，以及一种含有该基因的铜绿假单胞菌DNA疫苗。

Description

一种铜绿假单胞菌基因及其DNA疫苗
技术领域
本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌 OprF-VP22基因和含有该基因的DNA疫苗。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，种Pa)又称绿脓杆菌，假单胞杆菌属，是一种专性需氧的革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，土壤、水、空气，正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有该菌存在。该菌是一种条件致病菌，机体在某些条件下，如抵抗力降低，被严重烧伤或患代谢性疾病、血液病、恶性肿瘤，以及术后或某些治疗后容易感染该菌。铜绿假单胞菌是院内获得性感染的重要致病菌，我国全国性监测数据显示：从1994年到2006年，铜绿假单胞菌在所有院内感染的革兰氏阴性菌中排第1位；2008年9月至2011年8月住院患者标本中分离出的革兰氏阴性杆菌进行分析发现，铜绿假单胞菌连续3年名列第 1，并成为呼吸机相关性肺炎的首位致病菌。
随着抗生素不合理的应用，该菌对抗菌药的耐药性呈现逐年上升的趋势，并且开始产生对3类或3类以上抗菌药均表现耐药的多重耐药，甚至泛耐药的现象。Pa因耐药率高导致抗菌药物治疗困难的现状已成为目前国内外临床抗感染治疗的棘手问题，2012年的中国CHINET细菌耐药性检测结果显示：除阿米卡星和多粘菌素B以外，铜绿假单胞菌对其他临床常用的抗菌药物耐药率为 17％-35％，其中对美罗培南和亚胺培南的耐药率高达27.1％和29.0％，与10年前相比有了明显的上升。铜绿假单胞菌存在天然耐药、获得性耐药及适应性耐药等复杂的耐药机制。
鉴于Pa日益严重的耐药现状，迫使我们急切需要寻求抗菌药物之外的其他手段来治疗和预防Pa感染。免疫预防一直都是人们防治疾病的一个重要手段，因此研究有效的疫苗成为防治Pa感染的重要策略之一。随着分子生物技术及基因工程技术的发展，DNA疫苗逐渐成为人们关注的焦点。DNA疫苗，又称核酸疫苗或基因疫苗，是把编码目的抗原基因序列的真核表达质粒DNA，经过一定的途径导入人或动物体内，通过宿主细胞的转录翻译系统，在体内表达出抗原蛋白，从而刺激机体产生免疫应答起到免疫保护的作用。作为新一代的疫苗形式，与传统疫苗相比,DNA疫苗具有许多潜在的优势：如制备简单,成本低廉,易于大规模生产；可以制成冻干疫苗，便于保存和运输；既能介导体液免疫又能介导细胞免疫，可以将多种质粒DNA组成多价疫苗等。
关于Pa疫苗的研究已有半个多世纪的历史，对Pa疫苗的研究大致经历了灭活与减毒活疫苗→结合疫苗→基因工程疫苗几个阶段，做为一种新型的基因工程疫苗，迄今铜绿假单胞菌DNA疫苗尚处于动物实验研究阶段，虽取得了一定进展，但在研究中发现，DNA疫苗普遍存在免疫效力较低的缺点，即使以免疫原性较强的外膜蛋白F(the outer membraneprotein F，OprF)为抗原的DNA疫苗仍然存在这样的问题。因此，至今还没有一种能真正有效防治Pa感染的DNA疫苗问世。
具有蛋白转导功能的细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP)逐渐成为科研者关注和研究的对象，CPP是一类能够顺利通过生物膜进入细胞的多肽，能够携带不同种类的外源物质，包括蛋白质、核酸及多肽等大分子物质通过生物膜和生理屏障(包括血脑屏障和胎盘屏障)进入细胞，并且不受细胞类型的限制，在体内外均能发挥作用。
I型单纯疱疹病毒间层蛋白VP22已被证实是一种含有CPP结构的蛋白质，在α疱疹病毒中有较高的同源性。VP22具有高效的细胞间转导功能,能够在没有媒介物或受体的情况下携带外源物质跨越生物膜质结构进入细胞，并介导被转运物质从转染细胞传递至邻近细胞，且保留转运物质的生物学活性和功能。VP22 与抗原DNA融合的VP22-DNA疫苗有着较大的研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铜绿假单胞菌外膜蛋白F与I型单纯疱疹病毒间层蛋白VP22融合表达的铜绿假单胞菌OprF-VP22基因及其DNA疫苗。该基因编码的蛋白质可有效地穿透细胞膜，可以促进抗原蛋白OprF进入细胞,从而提高抗原递呈细胞提呈抗原蛋白的能力，进而增强DNA疫苗的免疫效力。
本发明的一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
本发明的一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因在制备铜绿假单胞菌疫苗中的用途。
本发明的目的还在于提供一种铜绿假单胞菌DNA疫苗，包含铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述本发明的DNA疫苗，所述基因构建于表达载体上，所述所述表达载体为pVAX-1。
本发明的有益效果如下：
1.以铜绿假单胞菌PAO1为模板扩增OprF基因，以pcDNA3-VP22为模板扩增VP22基因，以FDA批准人DNA疫苗质粒pVAX1为载体，采用Overlapping PCR 方法获得DNA疫苗pVAX1-OprF-VP22。
2.酶联免疫吸附实验(ELISA)间接法确证pVAX1-OprF-VP22免疫BALB/c 小鼠的抗体效价高于pVAX1-OprF免疫BALB/c小鼠，说明pVAX1-OprF-VP22增强了OprF DNA疫苗的体液免疫效力。
3.T淋巴细胞增殖实验和IFN-γ酶联免疫斑点法确证pVAX1-OprF-VP22免疫BALB/c小鼠T淋巴细胞的增殖能力与T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力均高于 pVAX1-OprF免疫BALB/c小鼠，说明pVAX1-OprF-VP22增强了OprF DNA疫苗的细胞免疫效力。
4.pVAX1-OprF-VP22对BALB/c小鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型的保护作用强于pVAX1-OprF免疫小鼠，说明pVAX1-OprF-VP22增强了OprF DNA疫苗的动物免疫保护作用。
附图说明
图1是pVAX1-OprF-VP22DNA疫苗的酶切鉴定结果，其中图中1泳道为 pVAX1-OprF-VP22DNA疫苗，2泳道为pVAX1-OprF-VP22BamHI和EcoRI双酶切产物，M泳道为核酸分子量标准
图2为小鼠血清OprF抗体效价盒形图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步理解和说明本发明质，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1 pVAX1-OprF-VP22构建方法
采用overlapping PCR的方式构建铜绿假单胞菌DNA疫苗pVAX1-OprF-VP22
1、PCR扩增OprF基因：按北京天根生物有限公司细菌基因组提取试剂盒说明书,从铜绿假单胞菌PAO1提取铜绿假单胞菌基因组，再采用引物扩增OprF 基因序列开放阅读框1～1050bp(GenBank:NC_002516.2)。P3： 5′-CGCGGATCCACCATGAAACTGAA GAACAC-3’)，其中以下划线表示BamHI 酶切位点；P7:5′-CTGAAGCCAAGATGACCTCTCGCCG-3′。PCR参数：预变性温度与时间94℃3min；变性温度与时间94℃30sec，退火(复性)温度与时间55℃30sec，延伸温度与时间72℃1min，共30个循环；72℃5 min后终止反应。
2、PCR扩增VP22基因：以pcDNA3-VP22为模板，采用引物扩增VP22基因序列开放阅读框1～906bp。P8:5′-CGGCGAGAGGTCATCTTGGCTTCAG-3′，P2： 5’-ATTGAATTCTCACTCGACGGGCCG-3’，其中以下划线表示EcoRI酶切位点。 PCR参数：预变性温度与时间94℃3min；变性温度与时间94℃30sec，退火(复性)温度与时间55℃30sec，延伸温度与时间72℃1min，共30 个循环；72℃5min后终止反应。
3、构建铜绿假单胞菌DNA疫苗pVAX1-OprF-VP22：步骤1和步骤2中得到的 OprF基因与VP22基因各100ng做模板，30μl体系进行PCR，参数：预变性温度与时间94℃3min；变性温度与时间94℃30sec，退火(复性)温度与时间55℃30sec，延伸温度与时间72℃1min，共10个循环；72℃ 5min后终止反应。以产物为模板，P3和P2引物，50μl体系进行PCR，参数同1。用BamHI和EcoRI分别双酶切扩增OprF-VP22重组基因与DNA 疫苗载体pVAX1后回收目的片段，用Quick T4DNA ligase连接酶在25℃连接10min。然后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性筛选、限制性内切酶酶切鉴定，得到DNA疫苗pVAX1-OprF-VP22, 经基因测序，得到序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。酶切结果如图1 所示。
实施例2 pVAX1-OprF-VP22DNA疫苗免疫小鼠及制备小鼠抗血清
1.DNA疫苗免疫小鼠：将SPF级6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠随机分成PBS 免疫组(阴性对照)、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22组，每组8只小鼠。 pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22组小鼠肌肉注射相应质粒20ug，阴性对照组注射PBS，共免疫3次，每次间隔2周。
2.小鼠血清的制备：于末次免疫后1周处死小鼠，眼球摘除法取静脉血,采集的血样于37℃放置1h充分凝固后4℃过夜，在4℃下，4000rpm离心 10min收集血清，分装后-70℃保存。
3.小鼠T淋巴细胞制备：于末次免疫后1周处死小鼠，获取脾脏，将脾细胞悬液调整浓度为1×108cells/mL，免疫磁珠法分选T淋巴细胞。
实施例3 pVAX1-OprF-VP22增强OprF DNA疫苗的体液免疫效力
1.ELISA间接法测定：
1)抗原包被：将纯化的OprF用0.05M的pH 9.6的碳酸盐缓冲液以最适稀释度稀释(1ug/ml)后,加入聚苯乙烯微量塑料板中,每孔100ul，4℃包被过夜 (16h-24h)。
2)洗涤：甩掉其中液体，吸水纸上拍干，加入洗涤液，300ul/孔，震荡，室温放置5min，共洗涤3次。
3)封闭：封闭液300ul/孔。37℃培养箱2h，封闭之后洗涤3次(同前)。
4)一抗孵育：加入系列倍比稀释的待检血清(1:500始),每孔加入100ul (双复孔),同时设空白对照孔和阴性对照，37℃孵育1h。
5)洗涤3次(同前)。
6)二抗孵育：用封闭液稀按1：250稀释二抗，100ul/孔，孵育：37℃， 1h。
7)洗涤5次(同前)。
8)加入TMB显色液，100ul/孔，37℃下孵育10-15min。
9)终止反应，30-50ul/孔，预热酶标仪，5min内读数450nm和630nm吸光值(OD值＝OD450-OD630)。
10)结果判定：试验中以PBS免疫小鼠血清(1:500稀释)为阴性对照，样本血清的OD值>0.1且OD样本/OD阴性对照≥2.1时判为阳性；将抗体效价定义为:阳性血清与阴性对照血清的OD比值(即OD阳性血清/OD阴性对照)≥2.1时最大的血清稀释倍数。小鼠血清OprF抗体效价：pVAX1-OprF免疫组血清OprF抗体效价中位数为6000，pVAX1-OprF-VP22免疫组血清OprF抗体效价中位数为48000， pVAX1-OprF-VP22免疫组血清OprF抗体效价显著高于pVAX1-OprF免疫组(P<0.001)。因此，pVAX1-OprF-VP22增强了OprF DNA疫苗的体液免疫效力。抗体效价结果见图2(图中***P<0.001)
实施例4 pVAX1-OprF-VP22增强OprF DNA疫苗的细胞免疫效力
(一)T淋巴细胞增殖
1.CCK-8法检测
1)将T淋巴细胞调至浓度为4×106cells/mL，取100μl加入到96孔板中，每组设三个复孔，一个对照孔，一个调零孔(对照孔加细胞和培养基，调零孔只加培养基)。
2)将96孔板置于5％CO2，37℃培养箱中孵育过夜。
3)用纯化的OprF分别刺激细胞，培养箱中孵育60h。
4)取出96孔板后，更换新鲜无血清培养基100μl，每孔加入10μlCCK-8溶液， 37℃孵育4h。
5)检测450nm处的吸光值。刺激指数＝(A实验组-A调零孔)/(A空白组-A调零孔)
2.T淋巴细胞增殖结果：PBS组刺激指数为1.02±0.02，pVAX1-OprF组刺激指数为1.47±0.02、pVAX1-OprF-VP22组刺激指数为2.24±0.04。 pVAX1-OprF-VP22免疫组T淋巴细胞增殖能力显著高于pVAX1-OprF免疫组 (P<0.001)。
(二)T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力
1.ELISPOT检测
1)将捕获抗体加入到PBS无菌包被液中，混匀，向96PVDF微孔板中每孔加 100μl，4℃孵育过夜。
2)倒去液体，用200μLPBS洗涤两次。
3)每孔加入200μl RPMI-1640完全培养基，在室温下孵育1h，倒去液体。
4)调节细胞浓度为2×106cells/mL，每孔加入100μl细胞悬液和100μl纯化的OprF(终浓度为8μg/ml)进行刺激，阴性对照孔不加纯化蛋白，加入等量的RPMI-1640完全培养基，每组各设3个复孔。
5)5％CO2，37℃培养箱中孵育24h。
6)移去孔中的液体，用ELISPOT洗涤缓冲液清洗三次。
7)将检测抗体加入到检测稀释液中，每孔加入100μl，37℃孵育2h。
8)倒去液体,用洗涤液冲洗4次(每次洗涤需等待1min后再倒去液体)。
9)将HRP标记的亲和素用稀释液稀释，每孔加入100μl，室温孵育1h。
10)倒去液体，然后用洗涤液洗3次，PBS洗2次。
11)每孔加入100μl新鲜配置的AEC底物显色液，室温下反应10～30min。
12)完全显色后，每孔加200μl蒸馏水终止反应，洗涤三次。
13)膜风干后，在低倍显微镜下读取斑点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。
2.T淋巴细胞分泌IFN-γ的实验结果：PBS组分泌IFN-γT淋巴细胞斑点数 8.6±1.2，pVAX1-OprF组31.6±2.1，pVAX1-OprF-VP22组72.0±2.6。 pVAX1-OprF-VP22组T淋巴细胞分泌IFN-γ能力显著高于pVAX1-OprF免疫组(P<0.001)。因此，综合T淋巴细胞增殖与T淋巴细胞分泌IFN-γ的实验结果，表明pVAX1-OprF-VP22增强了OprF DNA疫苗的细胞免疫效力。
实施例5 pVAX1-OprF-VP22增强OprF DNA疫苗的免疫保护作用
小鼠如实施例2的1的方法免疫后1周腹腔内注射5×106CFU铜绿假单胞菌PAO1，观察小鼠10天的死亡率。PBS组小鼠在感染7天内全部死亡，pVAX1-OprF 组小鼠在感染9天内全部死亡，而pVAX1-OprF-VP22组小鼠感染10天后仍有40％存活。说明pVAX1-OprF-VP22组的免疫保护作用显著强于pVAX1-OprF组 (P<0.001)。因此，pVAX1-OprF-VP22增强了OprFDNA疫苗的免疫保护作用。

Claims (3)

1.一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1的OprF-VP22基因在制备铜绿假单胞菌疫苗中的用途。
3.一种铜绿假单胞菌DNA疫苗，包含铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述基因构建于表达载体上，所述表达载体为pVAX1。
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