CN113201050A

CN113201050A - 一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113201050A
Application number: CN202010785640.3A
Authority: CN
Inventors: 潘强; 任慧英; 王佳; 孙虎芝
Original assignee: Qingdao No Antibiotics Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao No Antibiotics Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN113201050B

Abstract

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用，具体公开了一种分离的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。还公开了述的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白在制备治疗支原体感染疾病的药物中的用途。本发明首次发现噬菌体的穿孔素对支原体具有较强抑制作用，为治疗和抑制支原体疾病打下基础。

Description

一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物药物领域，涉及到一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用范围。

背景技术

因为支原体广泛存在于自然界中，有些支原体是致病性支原体，所以对畜牧养殖业具有极大的危害性。例如肺炎支原体，既能让人类得病，也能够引起猪、牛、羊等养殖动物得病，导致大面积的死亡，给畜牧养殖业带来巨大经济损失。

传统畜牧养殖业，针对支原体疾病，普遍采用抗生素疗法。随着抗生素对生态环境的污染被大众所知，国际陆续出台文件，在不久的将来，抗生素将会退出畜牧养殖行业，所以，寻找能够替代抗生素治疗支原体疾病，并且具有良好效果的产品，将会具有广阔的经济效益和社会效益。

噬菌体是一类能够特异性识别并且感染细菌的病毒，它广泛存在于自然界中。相较于传统的抗生素治疗家畜细菌病，噬菌体具有独特的优势：不会产生广泛的耐药性；不会污染环境。噬菌体依靠独特的裂解酶和穿孔素，将细菌外膜和内膜破裂，杀死细菌。

发明内容

本发明的目的是开发一种来源于金黄色葡萄球菌噬菌体的穿孔素，该穿孔素能够应用在家畜养殖中抑制和杀灭致病支原体。发明人意外发现来源于噬菌体的穿孔素对支原体也具有显著的抑制作用。作为一类新型的抑菌剂，噬菌体穿孔素具有比抗生素更加广泛的应用优势，特别是针对绵羊肺炎支原体、猪肺炎支原体和鸡滑液囊支原体具有明显的抑制作用。

本发明通过下属技术方案实现：

本发明一个方面提供了一种金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明另一个方面提供了一种编码金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白SEQ ID No.2的核苷酸序列，优选地，其序列如SEQ ID No.1所示。

本发明再一个方面提供了一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素，其为由SEQ IDNo.1序列编码的蛋白。

本发明再一个方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含SEQ IDNo.1的核苷酸序列、编码SEQ ID No.2序列所示蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述的表达载体是pColdTF载体。

本发明再一个方面提供了一种抗支原体制剂，其包括金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白。

本发明再一个方面提供了金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白在制备治疗支原体感染疾病的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白作为抗支原体的制剂的用途。

优选地，所述的支原体选自绵羊肺炎支原体、鸡滑液囊支原体或猪肺炎支原体。

优选地，支原体感染疾病选自羊传染性胸膜肺炎、鸡滑液囊支原体病、猪支原体肺炎。

本发明再一个方面提供了金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其包括如下步骤：

1)将核苷酸序列SEQ ID No.1克隆到原核表达重组载体上，获得重组表达质粒

2)将重组表达质粒转化进入大肠杆菌BL21表达菌株中，进行液体培养，诱导表达，收集菌液，提取纯化，获得的金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素HolSA2。

其中，所述的酶切采用SacI和XhoI双酶切。

其中，所述的表达载体是pColdTF载体。

其中，诱导表达的穿孔素为可溶解表达，并且采用亲和层析方法得到穿孔素HolSA2蛋白质。

本发明的有益结果：

本发明从已经分离得到的金黄色葡萄球菌噬菌体SA2上，克隆得到该噬菌体穿孔素holSA2，采用原核表达方式,诱导表达可溶解的穿孔素HolSA2。本发明首次发现噬菌体的穿孔素对支原体具有较强抑制作用，为治疗和抑制支原体疾病打下基础。

附图说明

图1 holSA2基因的PCR结果：M为DNA标准分子量Marker，泳道1是PCR条带。

图2 holSA2-pColdTF质粒双酶切结果：M为DNA标准分子量Marker，泳道1是SalI和XhoI双酶切条带。

图3 HolSA2蛋白的可溶解诱导表达：M为蛋白标准分子量Marker，泳道1是细菌上清表达，泳道2是细菌沉淀表达。

图4 HolSA2蛋白表达后抑制BL21细菌生长

图5 穿孔素HolSA2与鸡红细胞作用结果：泳道是对照PBS，泳道2是对照pColdTF，泳道3是穿孔素HolSA2作用鸡红细胞。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的菌株材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素holSA2基因克隆和载体构建

1)菌体菌株

金黄色葡萄球菌噬菌体SA2是本申请人已经分离所得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月27日，保藏编码为CGMCC No.14331。

2)穿孔素HolSA2的结构域分析

噬菌体SA2全基因序列已经提交NCBI，编码MH356730。根据已提交NCBI噬菌体SA2的全基因组序列及预测的ORF，确定噬菌体SA2的穿孔素holSA2基因序列，其序列表SEQ IDNo.1所示：ATGGCAGAATCAAAGAAACAGCCCAAAGTAGTAGGCGGAATAAACTGGAGTACAAGAGCGAAAAGTAAAACTTTCTGGGTCGCAATAGTCTCAGCGGTAGCAGTTTTGGCAAATCAAGTAACAGGTGCGCTTGGTGTGGATTATTCTACACAGATTGAACAAGGTGTAAATATAGCAGGTTCTTTTCTGACTTTCTTAGCAATAATTGGTGTAGTAGCGGATAATAACACTAAAGGTATTAAAGATAGCGAAATAGTTAGAACAGACTATATTCAACCACGTGATAGTAACAATCCAAACCACTACATTCAATGGCAAGACCAGTCAAACTCTGAGAAGCAAGAACAGTTAAATCAACTAGGTATTATGGAGCCTAAAGAATTTGATACTTCAGAACCATTTACAGATGATAGTGAAGATGTAGAATGGGATGTATCAGAACGTGAAGAACAGCAAGGTGTAAGAGGTCAAAAAGAATTAAGTGAAGAAAACGTATCTACAGAAGAGAATAATCAGAAAGGGGAAGATAATCAATGA。

其表达产物HolSA2，氨基酸序列如下SEQ ID No.2：MAESKKQPKVVGGINWSTRAKSKTFWVAIVSAVAVLANQVTGALGVDYSTQIEQGVNIAGSFLTFLAIIGVVADNNTKGIKDSEIVRTDYIQPRDSNNPNHYIQWQDQSNSEKQEQLNQLGIMEPKEFDTSEPFTDDSEDVEWDVSEREEQQGVRGQKELSEENVSTEENNQKGEDNQ。

采用TMHMM网站的软件，对该HolSA2蛋白质进行跨膜结构域预测分析，结果显示：HolSA2具有2个α螺旋跨膜结构域，分别是氨基酸24-46和56-73，属于Ⅱ型穿孔素，同时N端和C端都在细胞膜内侧。穿孔素的N端带有6个正电荷和1个负电荷氨基酸，C端带有10个正电荷和28个负电荷氨基酸。

3)引物设计

根据目的基因序列和表达载体pColdTF的序列，应用Primer Premier 5.0软件分别设计穿孔素holSA2基因正反向引物，并在引物两端分别加入SacI和XhoI酶切位点，引物由上海生物工程股份有限公司合成。

holSA2-F：gaaggtaggcatatgGAGCTCATGGCAGAATCAAAGAAACAGCC

holSA2-R：cttgaattcggatccCTCGAGTCATTGATTATCTTCCCCTTTCTGA

4)PCR扩增和回收

以噬菌体SA2增殖液为模板，分别建立25μL的PCR反应体系：噬菌体增殖液SA2 1μL，上下游引物各1μL，DNA Polymerase 0.5μL，dNTP Mix 0.5μL，2×Mix buffer 12.5μL，ddH₂O8.5μL。反应条件：94℃预变性5min，开始循环：94℃变性1min，61.4℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃总延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，得到与预期大小537bp相符的目的条带。见图1。

5)重组表达质粒的连接和转化感受态细胞

将表达载体pColdTF质粒进行双酶切反应，酶切体系：pCold TF质粒10μL，SacI 1μL，XhoI 1μL，10×M Buffer 2μL，ddH₂O 6μL。37℃，水浴4h，酶切体系经1％琼脂糖凝胶电泳验证，胶回收，得到具有粘性末端的载体。

PCR产物采用相同的酶切方式酶切。

根据目的基因PCR胶回收产物和pColdTF质粒双酶切回收产物的浓度，确定10μL连接体系：胶回收产物7μL，质粒双酶切产物1μL，10×Ligation Buffer 1μL，T4 DNA Ligase1μL。50℃连接10min。

将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热激90s，迅速置于冰上2-3min。加入890μL LB肉汤，37℃培养90min。12,000×g离心5min，弃去800μL上清液后重悬菌液。取100μL菌液涂布于含Amp的营养琼脂板，待液体完全吸收后37℃恒温倒置培养过夜。

6)重组表达质粒的双酶切和测序鉴定

随机挑取Amp平板上单个菌落，接种到含Amp的LB肉汤培养基中培养，得到菌悬液，通过PCR鉴定阳性菌液；提取PCR阳性菌液质粒进行SacI和XhoI双酶切鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物，见图2。

同时将PCR阳性菌液送到上海派森诺生物科技有限公司测序，根据测序结果使用Lasergene软件包中的MegAlign工具与目的基因序列进行比对，结果显示插入重组质粒的基因与目的基因序列一致。

实施例2重组表达质粒菌的诱导表达与纯化，

1)重组表达质粒转入BL21感受态细胞

取1μL重组质粒加入100μL大肠杆菌BL21感受态细胞，混匀后冰浴30min；42℃水浴热激90s，迅速置于冰上3min，加入900μL LB肉汤，37℃恒温震荡培养90min；取100μL菌液涂布于含Amp的营养琼脂板，37℃恒温过夜培养。

2)重组表达质粒菌的诱导表达

随机挑取转入BL21感受态细胞的单菌落，接种到含Amp的LB液体肉汤，37℃振荡培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃振荡过夜诱导表达。设诱导表达的pColdTF空质粒作为对照。重组菌扩大培养后进行诱导表达，冰浴间歇超声菌体，菌体裂解后4℃离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，见图3。

结果显示，穿孔素HolSA2重组蛋白是可溶性表达。

3)穿孔素HolSA2重组蛋白的纯化

将超声裂解后重组蛋白进行4℃离心，取上清，用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。用非变性裂解液平衡层析柱2-3次，然后将重组蛋白多次上柱使蛋白与填料充分结合，用2mM咪唑分别洗涤5次，最后用50mM咪唑分别洗脱蛋白6次，得到不同浓度的纯化的带His标签的重组蛋白。对得到的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。用终浓度为2％的NaHCO₃和1mM的EDTA煮沸处理透析袋，将纯化后的蛋白分别装入透析袋，用PBS进行4℃透析，每6h换一次PBS，共透析24h，得到最终纯化的HolSA2蛋白。进行测序，其序列为SEQ ID No.2所示

实施例3穿孔素HolSA2体外抑菌活性测定

1)穿孔素HolSA2体外抑菌活性测定

将生长到对数期的HolSA2-pColdTF-BL21菌液加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，同时设未加IPTG的HolSA2-pColdTF-BL21菌液和pColdTF-BL21菌液对照，在16℃下震荡培养。在0-1h内每间隔15min，1-2h间隔30min，2-6h内间隔1h，各取200μL菌液加到96孔板中，每组3个重复，测定每孔的测定OD₆₀₀数值。

结果显示：对数期的HolSA2-pColdTF-BL21菌液加入IPTG诱导后，菌液浊度呈上升趋势，但是上升趋势低于对照组HolSA2-pColdTF-BL21未诱导菌液和空质粒pColdTF-BL21诱导菌液，见图4。

2)穿孔素HolSA2对支原体的抑制作用

将100μL穿孔素HolSA2蛋白用支原体改良Frey培养基稀释5倍，然后倍比稀释至2560倍。将绵羊肺炎支原体、鸡滑液囊支原体和猪肺炎支原体的新鲜培养物分别稀释1000倍，按照1:10的比例与穿孔素HolSA2蛋白混合，每个做2个重复。以支原体培养基和蛋白稀释液为对照，37℃培养3-7天，观察变色情况，测定蛋白对支原体的抑制作用。

结果显示：在绵羊肺炎支原体10⁸CCU/ml下，穿孔素HolSA2抑制绵阳肺炎支原体的变色倍数为320倍；在鸡滑液囊支原体10⁶CCU/ml下，穿孔素HolSA2抑制鸡滑液囊支原体的变色倍数为40倍；在猪肺炎支原体10⁵CCU/ml下，穿孔素HolSA2抑制猪肺炎支原体的变色倍数为640倍。说明穿孔素HolSA2对绵羊肺炎支原体和猪肺炎支原体有强烈的抑制作用，且对鸡滑液囊支原体也有抑制效果。

支原体种类	CCU/ml	变色倍数
			绵羊肺炎支原体	10<sup>8</sup>	320
鸡滑液囊支原体	10<sup>6</sup>	40
			猪肺炎支原体	10<sup>5</sup>	640

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛诺安百特生物技术有限公司

<120> 一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用

<130> CP120030533C

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 噬菌体SA2

<400> 1

atggcagaat caaagaaaca gcccaaagta gtaggcggaa taaactggag tacaagagcg 60

aaaagtaaaa ctttctgggt cgcaatagtc tcagcggtag cagttttggc aaatcaagta 120

acaggtgcgc ttggtgtgga ttattctaca cagattgaac aaggtgtaaa tatagcaggt 180

tcttttctga ctttcttagc aataattggt gtagtagcgg ataataacac taaaggtatt 240

aaagatagcg aaatagttag aacagactat attcaaccac gtgatagtaa caatccaaac 300

cactacattc aatggcaaga ccagtcaaac tctgagaagc aagaacagtt aaatcaacta 360

ggtattatgg agcctaaaga atttgatact tcagaaccat ttacagatga tagtgaagat 420

gtagaatggg atgtatcaga acgtgaagaa cagcaaggtg taagaggtca aaaagaatta 480

agtgaagaaa acgtatctac agaagagaat aatcagaaag gggaagataa tcaatga 537

<210> 2

<211> 178

<212> PRT

<213> 噬菌体SA2

<400> 2

Met Ala Glu Ser Lys Lys Gln Pro Lys Val Val Gly Gly Ile Asn Trp

1 5 10 15

Ser Thr Arg Ala Lys Ser Lys Thr Phe Trp Val Ala Ile Val Ser Ala

20 25 30

Val Ala Val Leu Ala Asn Gln Val Thr Gly Ala Leu Gly Val Asp Tyr

35 40 45

Ser Thr Gln Ile Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Gly Ser Phe Leu Thr

50 55 60

Phe Leu Ala Ile Ile Gly Val Val Ala Asp Asn Asn Thr Lys Gly Ile

65 70 75 80

Lys Asp Ser Glu Ile Val Arg Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Arg Asp Ser

85 90 95

Asn Asn Pro Asn His Tyr Ile Gln Trp Gln Asp Gln Ser Asn Ser Glu

100 105 110

Lys Gln Glu Gln Leu Asn Gln Leu Gly Ile Met Glu Pro Lys Glu Phe

115 120 125

Asp Thr Ser Glu Pro Phe Thr Asp Asp Ser Glu Asp Val Glu Trp Asp

130 135 140

Val Ser Glu Arg Glu Glu Gln Gln Gly Val Arg Gly Gln Lys Glu Leu

145 150 155 160

Ser Glu Glu Asn Val Ser Thr Glu Glu Asn Asn Gln Lys Gly Glu Asp

165 170 175

Asn Gln

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtaggc atatggagct catggcagaa tcaaagaaac agcc 44

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttgaattcg gatccctcga gtcattgatt atcttcccct ttctga 46

Claims

1.一种分离的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白的核苷酸序列，优选地，其序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或编码SEQID No.2序列所示蛋白的核苷酸序列；优选地，所述的表达载体是pColdTF载体。

4.一种抗支原体制剂，其包括权利要求1所述的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白。

5.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白在制备治疗支原体感染疾病的药物中的用途。

6.根据权利要求6所述的用途，支原体感染疾病选自羊传染性胸膜肺炎、鸡滑液囊支原体病、猪支原体肺炎。

7.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌穿孔素蛋白作为抗支原体的制剂的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，所述的支原体选自绵羊肺炎支原体、鸡滑液囊支原体或猪肺炎支原体。

9.权利要求1金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其包括如下步骤：

2)将重组表达质粒转化进入大肠杆菌BL21表达菌株中，进行液体培养，诱导表达，收集菌液，提取纯化，获得的金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素；

金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

10.根据权利要求9所述的制备方法，所述的酶切采用SacI和XhoI双酶切；

优选地，所述的表达载体是pColdTF载体；

优选地，诱导表达的穿孔素为可溶解表达，并且采用亲和层析方法得到金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素。