CN108379571A - 支原体疫苗的制备方法 - Google Patents

支原体疫苗的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108379571A
CN108379571A CN201810161003.1A CN201810161003A CN108379571A CN 108379571 A CN108379571 A CN 108379571A CN 201810161003 A CN201810161003 A CN 201810161003A CN 108379571 A CN108379571 A CN 108379571A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma
antigen
bacterium
serum
immunogenic composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810161003.1A
Other languages
English (en)
Inventor
D·M·M·乔丹
B·T·马丁森
C·M·米伦塞勒
A·纽鲍尔
A·V·耶尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49917778&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN108379571(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Publication of CN108379571A publication Critical patent/CN108379571A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/70—Non-animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明尤其系关于制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含在低血清或无猪血清真核细胞系统中培养支原体菌；获得该等支原体菌之抗原；及添加医药上可接受之载体。此外，本发明系关于可通过该方法获得之免疫原性组合物及对对象进行免疫之方法，该方法包含将该免疫原性组合物施用对象。

Description

支原体疫苗的制备方法
本申请是申请日为2013年12月20日的第201380066001.X号发明名称为“支原体疫苗的制备方法”的中国专利申请的分案申请。
背景技术
支原体(Mycoplasma)属菌属于柔膜菌纲(Mollicutes)且代表一组源自厚壁菌门(Firmicutes)谱系之生物体。柔膜菌纲系最小自主复制生物体，其在结构上与其它真细菌之不同之处在于其缺少细胞壁。业内认为其单膜表面系在复杂免疫活性宿主环境中介导适应及存活之关键界面。此外，柔膜菌纲具有小基因组及数目有限之代谢路径。因此，亦将支原体属成员描述为“最小自我复制生物体”。然而，尽管其非常简单，多种支原体菌系人类及多种动物之病原体。与其它毒力主要取决于毒素、侵袭素及细胞溶素之病原性细菌相比，病原性支原体菌似乎不具有该等典型主要毒力因子(Chambaud,I.等人，2001,Nucleic AcidsRes.29:2145-2153,Fraser等人，1995,Science 270:397-403)。目前可获得之对允许病原性支原体引起宿主细胞损伤、发炎及疾病之分子机制及效应物之了解极少。
病原性支原体菌主要引起人类及动物之非典型肺炎、泌尿生殖道感染及关节炎(Blanchard,A.及G.F.Browning(编辑).2005.Mycoplasmas:Molecular biology,pathogenicity and strategies for control.Horizon Bioscience,Wymondham U.K.；Kobisch M.及Friis N.F.1996,Swine mycoplasmoses,Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.15,1569-1605)。已知该等体征之再活化或加重会反复并逐渐转变成慢性疾病，且因此通过早期诊断及早期治疗预防或治疗加重或再活化非常重要。猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)系地方性肺炎之病因。在猪中，其因体重增长降低及饲料效率低而系最常见且经济上最重要之疾病之一。该疾病引起肺损害、慢性咳嗽、毛色无光、生长迟滞及持续数周之不兴旺外观。肺损害、尤其在腹侧顶叶及心叶中之损害之特征在于上皮细胞增生及单核细胞之血管周及细支气管周累积增加。猪呼吸道之另一常见支原体，即猪鼻支原体(M.hyorhinis)可引起仔猪之多发性浆膜炎及关节炎。猪滑液支原体(M.hyosynoviae)一般位于扁桃体中且可引起关节炎疾病，从而导致经济损失。猪滑液支原体系自关节及咽/扁桃体样品分离且可在血液及关节液中诱导抗体。牛支原体(M.bovis)被认为系致病性更强之支原体菌中之一且在世界上造成显著经济损失。支原体菌引起所有年龄之牛之严重临床体征。牛支原体系发现引起牛之肺炎、乳腺炎及关节炎之最常见支原体病原体，且其病因学作用与母牛及公牛之耳炎、角膜结膜炎、滑膜炎及生殖障碍有关。
由于支原体缺少细胞壁，许多靶向细胞壁合成之常见抗生素(例如青霉素或其它β-内酰胺抗生素)对其无影响。实际使用之支原体感染之治疗剂系一些抗生素，例如基于大环内酯或基于新喹诺酮或基于四环素之抗生素，但该等抗生素具有严重不良效应，例如抗药性菌株之出现，其导致支原体感染变严重同时预期治疗效应不足，且成为转变成慢性疾病的病因。此外，疫苗接种系控制支原体感染之有效方法。然而，通常仅在复合培养基中培养才可获得制备疫苗所需之支原体之极高产率(Kobisch M.及Friis N.F.1996,Swinemycoplasmoses,Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.15,1569-1605；Gabridge M.G.等人，1976,Cultivation of mycoplasma in a modified tissue culture medium,Applied andEnvironmental microbiology.31,986-989；Sotoodehnia A.等人2007,Preparation ofagalactia vaccine in fermentor,Archives of razi institute,62,45-48；Dahlia等人，2009Isolation of mycoplasma hyosynoviae from penumonic lung of swine,Tropical Biomedicine 26:341-345)。取决于欲培养之支原体菌，复合培养基补充有10-30％血清且有时补充有酵母提取物。因此，由于血清之高价格，培养支原体菌之成本密集。此外，减少复合培养基中之血清亦将有益于动物福利。因此，业内需要以极高产率在低血清培养系统中培养支原体，以供制备有效预防支原体感染之免疫原性组合物。此外，猪特异性支原体菌一般系在含有猪特异性血清之复合培养基中培养(Kobisch M.及FriisN.F.1996,Swine mycoplasmoses,Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.15,1569-1605)。然而，猪特异性血清可含有其它猪特异性病原体或可含有可使欲制备之免疫原性组合物之免疫原性降低之针对猪特异性病原体之抗体。因此，业内亦需要以极高产率在无猪血清培养系统中培养支原体，以供制备有效预防支原体感染之免疫原性组合物。
发明内容
在阐述本发明各态样之前，必须注意，除非上下文明确指示其它含义，否则如在本文中及在随附申请专利范围中使用之单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该”包括复数参考。因此，例如，在提及“一抗原”时包括复数种抗原，在提及“细胞”时系指一或多个细胞及本领域技术人员已知之其等效物，等等。除非另有定义，否则本文中所使用之所有技术及科学术语皆具有熟习本发明所属领域技术者一般理解之相同意义。尽管在本发明之实践或测试中可使用任何与本文所述之方法及材料类似或等效之彼等，但现在阐述较佳方法、装置及材料。本文所提及之所有出版物皆系以引用方式并入本文中，用于阐述及揭示该等出版物中所报导可结合本发明使用之细胞系、载体及方法之目的。本文中所有内容皆不应视为承认该揭示内容由于先前发明而有资格先于本发明。
本发明解决先前技术中固有之问题并提供技术现况之独特进步。
概言之，本发明提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。
有利地，本发明所提供实验数据揭示，可在低血清真核细胞系统中产生支原体菌。
术语“免疫原性组合物”系指包含至少一种抗原之组合物，其引发被施用该免疫原性组合物之宿主之免疫反应。该免疫反应可为细胞及/或抗体介导之针对本发明免疫原性组合物之免疫反应。该宿主亦被称为“对象”。较佳地，本文所阐述或提及之任一宿主或对象系动物。
通常，“免疫反应”包括(但不限于)以下效应中之一或多者：特异性指向本发明免疫原性组合物中所包括抗原之抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞及/或细胞毒性T细胞及/或γ-δT细胞之产生或活化。较佳地，宿主将展示保护性免疫反应或治疗反应。
“保护性免疫反应”将显示为受感染宿主通常展示之临床体征之减少或缺少、较短回复时间及/或缩短之感染性持续时间或组织或体液或受感染宿主之排泄物中降低之病原体效价。
若宿主展示保护性免疫反应而使得对新感染之抗性将增强及/或疾病之临床严重度降低，则将免疫原性组合物称为“疫苗”。
如本文所用“抗原”系指(但不限于)引发宿主对包含该抗原或其免疫活性组份之所关注免疫原性组合物或疫苗之免疫反应之组份。抗原或免疫活性组份可为完整微生物(呈灭活或改良活形式)或其任何碎片或部分，若将其施用宿主可引发宿主之免疫反应。抗原可为或可包含呈其原始形式或作为所谓改良活疫苗(MLV)中之减毒生物体之完整的活生物体。抗原可进一步包含该等生物体之适当组件(亚单位疫苗)，其中该等组件系通过以下方式来生成：破坏完整生物体或该等生物体之生长培养物且实施后续纯化步骤以产生期望结构；或通过对适宜系统(如但不限于细菌、昆虫、哺乳动物或其它物种)进行适当操作来诱导合成过程，且随后视情况实施分离及纯化程序；或通过使用适宜医药组合物在需要疫苗之动物中直接引入遗传物质来诱导该等合成过程(多核苷酸疫苗接种)。抗原可包含所谓的死菌疫苗(KV)中之通过适当方法灭活之完整生物体。若生物体系细菌，则死菌疫苗称为死菌苗(bacterin)。
术语“治疗及/或预防”系指减小畜群中具体支原体感染之发病率或降低由具体支原体感染引起或与该感染相关之临床体征之严重度。因此，术语“治疗及/或预防”亦系指减小畜群中受具体支原体菌感染之动物数(＝减小具体支原体感染之发病率)，或与动物未接受如本文所提供免疫原性组合物之动物组相比，在动物已接受有效量之该免疫原性组合物之动物组中降低通常与支原体感染相关或由该感染引起之临床体征之严重度。
“治疗及/或预防”一般涉及向需要或可受益于此治疗/预防之对象或对象群施用有效量之本发明免疫原性组合物。术语“治疗”系指一旦对象或畜群中之至少一些动物已被该支原体感染且其中该等动物已显示一些由该支原体感染引起或与该感染相关之临床体征，则施用有效量之免疫原性组合物。术语“预防”系指在对象之任何支原体感染之前，或至少在该动物或动物组中没有动物不显示任何由该支原体感染引起或与该感染相关之临床体征时，向该对象施用。
如本文所用术语“有效量”意指(但不限于)引发或能引发对象之免疫反应之抗原之量。该有效量能减小畜群中具体支原体感染之发病率或降低具体支原体感染之临床体征之严重度。
较佳地，与未经治疗或经在本发明之前可获得之免疫原性组合物治疗但随后被具体支原体菌感染之对象相比，临床体征之发病率或严重度减小至少10％、更佳至少20％、更佳至少30％、甚至更佳至少40％、更佳至少50％、甚至更佳至少60％、更佳至少70％、甚至更佳至少80％、更佳至少90％且最佳至少95％。
如本文所用术语“临床体征”系指对象来自支原体菌之感染体征。感染之临床体征取决于所选病原体。该等临床体征之实施例包括(但不限于)呼吸窘迫、多发性浆膜炎(例如腹膜炎、肋膜炎、心包炎)、关节炎(跛行及关节肿胀)、耳炎、被毛粗化、微热、抑郁症、食欲下降及菌血症。然而，临床体征亦包括(但不限于)可自活动物直接观察到之临床体征。可自活动物直接观察到之临床体征之实施例包括鼻排出物及眼分泌物、嗜睡、咳嗽、喘鸣、膈痉挛性呼吸(thumping)、高热、体重增加或减少、脱水、腹泻、关节肿胀、跛行、消瘦、皮肤苍白、羸弱、腹泻及诸如此类。
可通过向有需要对象施用一或多个剂量之本发明免疫原性组合物来降低对象中由具体支原体感染引起或与该感染相关之临床体征之发病率或严重度。如实施例2及3中所显示，已证实如本文所提供免疫原性组合物在向有需要对象施用单一剂量后有效。
术语“感染”或“受感染的”系指对象被病原体(即猪鼻支原体(M.hyorhinis)，或猪鼻支原体及猪滑液支原体(M.hyosynoviae)，或猪鼻支原体、猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)及猪滑液支原体)感染。
术语“支原体”为本领域技术人员已知。“支原体”系指一细菌属，例如如以下文献中所述：Blanchard,A.及G.F.Browning(编辑).2005.Mycoplasmas:Molecular biology,pathogenicity and strategies for control.Horizon Bioscience,Wymondham U.K.；Kobisch M.及Friis N.F.1996,Swine mycoplasmoses,Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.15,1569-1605。可基于细菌之生物化学及微生物性质以及其形态对其加以分类。该等分类准则为业内所熟知。一般而言，支原体感染与本说明中其它地方阐述之临床体征有关。
如本文所用术语“支原体”系指猪鼻支原体，或猪鼻支原体及猪滑液支原体，或猪鼻支原体、猪肺炎支原体及猪滑液支原体。然而，术语支原体亦涵盖牛支原体(M.bovis)。猪鼻支原体之全基因组序列例示性地由(例如)Liu,W.等人，J.Bacteriol.2010，第192卷(21),5844-45doi:10.1128/JB.00946-10.Epub 2010年8月27日或Calcutt MJ.等人，2012,J.Bacteriol.，第194卷(7),1848doi:10.1128/JB.00033-12提供。猪滑液支原体之分离物例示性地以登录号ATCC 25591或ATCC 27095保藏于美国组织培养物保藏中心(AmericanTissue Culture Collection)。猪肺炎支原体之分离物例示性地以登录号ATCC 25095、ATCC 25617及ATCC 25934保藏于美国组织培养物保藏中心。猪肺炎支原体J-菌株之基因组DNA以登录号ATCC 25934D保藏于美国组织培养物保藏中心。牛支原体之分离物为本领域技术人员所熟知且一些分离物例示性地以登录号ATCC 25025、ATCC 25523及ATCC 27368保藏于美国组织培养物保藏中心。
术语“培养”为本领域技术人员已知。该术语系指细胞在生物体外之培养物中之增殖。具体而言，术语“培养”系指细胞在生物体外在细胞系统中之增殖。
术语“细胞系统”为本领域技术人员已知。具体而言，术语“细胞系统”系用于培养微生物、例如支原体菌之活体外细胞培养系统。该细胞系统包含宿主细胞及适合该等细胞在生物体外增殖之细胞培养基。具体而言，宿主细胞可易受或可不易受支原体菌感染。该等宿主细胞可作为呈灭活形式之活细胞或作为细胞碎片存在。较佳地，该等宿主细胞系真核细胞系统中之真核细胞。
术语“真核细胞系统”包含初代真核细胞及源自诸如植物或动物等多细胞生物体之真核细胞。此外，真核细胞系统涵盖真核单细胞生物体(亦称作微生物)，例如细菌或真菌(包括酵母)。然而，应理解，真核细胞与支原体菌不同。可用于实践如本文所述之方法之真核宿主细胞包括(但不限于)马-达二氏(Madin-Darby)犬肾上皮(MDCK)细胞(例如美国组织培养物保藏中心以登录号ATCC CCL-34或ATCC CRL-2285保藏之马-达二氏犬肾上皮细胞)或McCoy细胞(例如美国组织培养物保藏中心以登录号ATCC CRL-1696所保藏)。
如本文所用术语“无细胞培养系统”系指除了支原体菌以外不包括任何细胞之培养系统。
术语“低血清的”系指与用于在无细胞培养系统中培养相同物种之支原体菌之血清之量相比，经添加用于在真核细胞系统中培养支原体菌之血清之减少量。与用于在无细胞培养系统中培养支原体菌之血清之量相比，用于在真核细胞系统中培养支原体菌之血清之量减少至少10％、较佳至少20％、更佳至少30％、甚至更佳至少40％、甚至更佳至少50％、甚至更佳至少60％、甚至更佳至少70％、甚至更佳至少80％、甚至更佳至少90％、甚至更佳至少95％、甚至更佳至少96％、甚至更佳至少97％、甚至更佳至少98％、甚至更佳至少99％、最佳100％。因此，必须理解，根据本发明，最佳在缺少任何血清之真核细胞系统中培养支原体菌。
用于在真核细胞系统中培养支原体菌之血清之较佳量包括介于约0–10％(v/v)之间、更佳约1–9％(v/v)、更佳约1–8％(v/v)、甚至更佳约1–7％(v/v)、甚至更佳约1–6％(v/v)且最佳约2–5％(v/v)之血清浓度。
用于在包含MDCK细胞之真核细胞系统中培养支原体菌之血清之较佳量包括介于约0–6％(v/v)之间、更佳约1–5％(v/v)、更佳约2–4％(v/v)、甚至更佳约2–3％(v/v)且最佳约2％(v/v)之血清浓度。
用于在包含McCoy细胞之真核细胞系统中培养支原体菌之血清之较佳量包括介于约0–10％(v/v)之间、更佳约1–9％(v/v)、更佳约2–8％(v/v)、甚至更佳约3–7％(v/v)、甚至更佳约4–6％(v/v)且最佳约5％(v/v)之血清浓度。
根据本发明之一方面，必须理解，真核细胞系统之真核细胞必须被支原体菌感染。支原体菌对真核细胞之感染及后温育期之条件为本领域技术人员所熟知。然而，较佳地，转染后将细胞温育长达21天、更佳约2天至约14天、更佳约2天至约8天、更佳约3至5天时期。较佳温育条件包括介于约32-42℃之间、更佳约34-40℃、更佳约35-39℃、甚至更佳约36-38℃且最佳约37℃之温度。较佳温育条件亦包括介于约2％至8％之间、更佳约3％至7％、甚至更佳约4％至6％且最佳约5％之CO2浓度。较佳地，在转染后观察真核细胞之特征变化，例如细胞密度趋势、在感染后时期期间活力之下降(包括细胞病变效应)及培养基由于pH变化所致之颜色变化。
术语“获得”包含抗原之采集、分离、纯化及/或配制(例如最后加工、灭活及/或掺和)。
术语“采集”系指自经转染真核细胞系统收集或回收支原体菌抗原。可使用业内已知之任何常规方法来回收该支原体抗原，例如任何分离方法。业内熟知方法包含离心或过滤，例如使用具有某一孔径之半透膜。
术语“分离”包含支原体抗原之分离步骤。用于自经感染真核细胞系统分离支原体菌抗原之方法为本领域技术人员已知。彼等方法包含物理及/或化学方法，包括(但不限于)冷冻-解冻循环、用超音波处理及诸如此类。
用于自分离物“纯化”抗原之方法为本领域技术人员已知，例如彼等阐述于《Protein purification methods-a practical approach》(E.L.V.Harris及S.Angel编辑，IRL Press at Oxford University Press)中之方法。彼等方法包括(但不限于)通过离心及/或过滤分离、沉淀、粒径筛析(凝胶过滤)层析、亲和层析、金属螯合物层析、离子交换层析、共价层析、疏水相互作用层析及诸如此类。抗原可以经纯化之纯净形式获得，或不含或实质上不含其它细胞物质或培养基等。在该分离及/或纯化后，抗原展现至少80％、较佳80％-90％、更佳90％-97％、最佳大于97％之纯度直至不含任何污染之绝对纯净形式。
根据另一方面，如本文所用“获得”可亦包括进一步最后加工步骤作为最终配制过程之一部分，如添加缓冲剂、灭活、中和步骤及诸如此类。
任何常规“灭活”方法皆可用于本发明之目的。因此，灭活法可通过本领域技术人员已知之化学及/或物理处理来实施。较佳灭活方法包括添加环化二乙烯亚胺(BEI)，包括添加已环化为二乙烯亚胺(BEI)之2-溴乙烯胺氢溴化物(BEA)。其它较佳化学灭活剂包含(但不限于)曲拉通(Triton)X-100、脱氧胆酸钠、溴化十六烷基三甲铵、β-丙内酯、硫柳汞(Thimerosal)、酚及甲醛(福尔马林)。然而，灭活亦可包含中和步骤。较佳中和剂包括(但不限于)硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠及诸如此类。
较佳福尔马林灭活条件包括约0.02％(v/v)–2.0％(v/v)、更佳约0.1％(v/v)–1.0％(v/v)、更佳约0.15％(v/v)–0.8％(v/v)、甚至更佳约0.16％(v/v)–0.6％(v/v)且最佳约0.2％(v/v)–0.4％(v/v)之福尔马林浓度。温育时间取决于支原体之抗性。一般而言，实施灭活过程直至在适宜培养系统中检测不到支原体生长。
根据另一方面，可使用已知技术将本发明灭活死菌苗组份纳入脂质体中，例如Nature,1974,252,252-254或Journal of Immunology,1978,120,1109-13中所述之技术。根据另一方面，可将本发明灭活死菌苗组份偶联至适宜生物化合物，例如多糖、肽、蛋白质或诸如此类或其组合。
因此，根据一方面，本申请提供一种制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该免疫原性组合物系支原体免疫原性组合物。
在本发明之一方面中，用于培养支原体菌之血清不含猪血清。术语“不含猪血清”意指在真核细胞系统中之支原体菌培养过程期间不添加猪血清。
因此，根据一方面，本申请提供一种制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该血清不含猪血清。根据另一方面，所有支原体抗原皆系在不含猪血清之真核细胞系统中产生。
在另一方面中，支原体菌之培养系在不存在血清下进行。此意指，在真核细胞系统中之支原体菌培养期间不添加血清。因此，根据一方面，本申请提供一种制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在不存在血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。根据另一方面，所有支原体抗原皆系在不存在血清下产生。
在本发明之一方面中，支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活支原体死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供一种制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该支原体抗原系完整灭活死菌苗。根据另一方面，免疫原性组合物内之所有支原体抗原皆系完整灭活死菌苗。可在包括灭活步骤之上述方法之该步骤b)中获得灭活支原体抗原。因此，根据另一方面，提供用于制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原并使该等支原体抗原灭活；及c)添加医药上可接受之载体。
完整灭活死菌苗可通过完整支原体菌之灭活、较佳通过如上文所述之方法来获得。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原并使该等支原体抗原灭活；及c)添加医药上可接受之载体，其中该等支原体抗原系完整支原体菌。
较佳地，支原体菌系如上文所述用福尔马林灭活。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原并用福尔马林使该等支原体抗原灭活；及c)添加医药上可接受之载体，其中该等支原体抗原系完整支原体菌。较佳地，以如上文所述之浓度使用福尔马林。
在本发明之一方面中，真核细胞系统包含MDCK细胞系。MDCK(马-达二氏犬肾上皮细胞)细胞系源自成年雌性克卡犬(cocker spaniel)之肾组织。然而，MDCK细胞系为本领域技术人员已知。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该真核细胞系统包含MDCK细胞系。同样，支原体抗原可为完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活霉浆菌死菌苗。
在本发明之另一方面中，真核细胞系统包含McCoy细胞系。McCoy细胞系为本领域技术人员已知。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该真核细胞系统包含McCoy细胞系。同样，支原体抗原可为完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。
在本发明之一方面中，支原体菌选自由以下组成之群：猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及牛支原体。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该支原体菌选自由以下组成之群：猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及牛支原体。较佳地，支原体抗原可为完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之另一方面中，支原体菌选自由以下组成之群：猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及其任何组合。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该等支原体菌选自由以下组成之群：猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及其任何组合。较佳地，支原体抗原可为完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养猪肺炎支原体菌；b)获得该等猪肺炎支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，猪肺炎支原体之抗原系完整灭活猪肺炎支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活猪肺炎支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有猪肺炎支原体抗原可为完整灭活猪肺炎支原体死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养猪鼻支原体菌；b)获得该等猪鼻支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，猪鼻支原体之抗原系完整灭活猪鼻支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活猪鼻支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有猪鼻支原体抗原可为完整灭活猪鼻支原体死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养猪滑液支原体菌；b)获得该等猪滑液支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，猪滑液支原体之抗原系完整灭活猪滑液支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活猪滑液支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有猪滑液支原体抗原可为完整灭活猪滑液支原体死菌苗。
根据另一方面，免疫原性组合物包含选自由以下组成之群之支原体抗原：猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及其任何组合。至少上述用于制备支原体免疫原性组合物之支原体中之一者之细菌(例如猪肺炎支原体或猪鼻支原体或猪滑液支原体)系根据本发明在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养。较佳地，所有用于制备支原体免疫原性组合物之支原体菌皆系根据本发明在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养。
因此，根据一方面，本申请提供制备包含猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及/或其任何组合之支原体抗原的用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养至少一种选自由以下组成之群之支原体菌：猪肺炎支原体、猪鼻支原体及猪滑液支原体；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，所有支原体菌皆系根据本发明在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供制备包含猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及/或其任何组合之支原体抗原的用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养至少猪肺炎支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，所有猪肺炎支原体菌皆系根据本发明在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养。较佳地，至少一种猪肺炎支原体抗原系完整灭活猪肺炎支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活猪肺炎支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有猪肺炎支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供制备包含猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及/或其任何组合之支原体抗原的用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养至少猪鼻支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，所有猪鼻支原体菌皆系根据本发明在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养。较佳地，至少一种猪鼻支原体抗原系完整灭活猪鼻支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活猪鼻支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有猪鼻支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
因此，根据一方面，本申请提供制备包含猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体及/或其任何组合之支原体抗原的用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养至少猪滑液支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，所有猪滑液支原体菌皆系根据本发明在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养。较佳地，至少一种猪滑液支原体抗原系完整灭活猪滑液支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活猪滑液支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有猪滑液支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之一方面中，免疫原性组合物经配制用于单一剂量施用。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该免疫原性组合物经配制用于单一剂量施用。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
有利地，本发明所提供实验数据揭示，施用单一剂量之本发明免疫原性组合物可靠且有效地刺激保护性免疫反应。特定而言，已显示针对猪鼻支原体及猪肺炎支原体之可测量之抗体反应。
如本文所用术语“对象”系指动物，较佳系指哺乳动物，例如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、仓鼠、猪、绵羊、狗、猫、马、猴或牛，且亦较佳系指人类。
在本发明之一方面中，对象系猪。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该对象系猪。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之另一方面中，对象系牛。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该对象系牛。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之另一方面中，对象系猫。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该对象系猫。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之另一方面中，对象系狗。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该对象系狗。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
术语“医药上可接受之载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。
在本发明之一方面中，医药上可接受之载体系佐剂。
如本文所用“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝；皂苷，例如Quil A,QS-21(Cambridge Biotech公司，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals公司，Birmingham,AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。乳液可尤其基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型(European Pharmacopea type))；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(尤其异丁烯或癸烯)寡聚产生之油；含有直链烷基之酸或醇之酯，更具体而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或脂肪醇之酯，尤其异硬脂酸酯。油可与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂较佳为非离子型表面活性剂，尤其山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸之视情况经乙氧基化之酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具体而言普流尼克(Pluronic)产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(编辑Stewart-Tull,D.E.S.)。JohnWiley and Sons,NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。举例而言，可使用M.Powell及M.Newman编辑之“Vaccine Design,The Subunitand Adjuvant Approach”,Plenum Press,1995第147页阐述之SPT乳液及同一本书的第183页阐述之乳液MF59。其它适宜佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi公司)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli，重组或其它)之不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽。在马来酸酐与烯基衍生物之共聚物中包括共聚物EMA(Monsanto)，其为马来酸酐与乙烯之共聚物。将该等聚合物溶解于水中产生酸溶液，较佳将其中和至生理pH以得到佐剂溶液，将免疫原性组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物本身加入该佐剂溶液中。
佐剂之另一实施例系选自丙烯酸系或甲基丙烯酸系聚合物及马来酸酐与烯基衍生物之共聚物之化合物。有利的佐剂化合物系丙烯酸系或甲基丙烯酸系聚合物，其尤其与糖或多元醇之聚烯基醚交联。该等化合物被称为术语卡波姆(carbomer)(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参考美国专利第2,909,462号，其阐述与聚羟基化化合物交联之该等丙烯酸聚合物，该聚羟基化化合物具有至少3个、较佳不多于8个羟基，至少3个羟基之氢原子经具有至少2个碳原子之不饱和脂肪族基团置换。较佳基团系彼等含有2至4个碳原子者，例如乙烯基、烯丙基及其它乙烯系不饱和基团。不饱和基团自身可含有诸如甲基等其它取代基。以名称(BF Goodrich,Ohio,USA)出售之产品尤其适合。其系与聚烯基醚或二乙烯基二醇交联或与烯丙基蔗糖或与烯丙基新戊四醇交联之丙烯酸聚合物。尤其可提及974P、934P及971P。最佳使用971P。
较佳地，佐剂系以约100μg至约10mg/剂量之量添加。甚至更佳地，佐剂系以约100μg至约10mg/剂量之量添加。更佳地，佐剂系以约500μg至约5mg/剂量之量添加。更佳地，佐剂系以约750μg至约2.5mg/剂量之量添加。最佳地，佐剂系以约1mg/剂量之量添加。
在本发明之较佳实施例中，佐剂选自由以下组成之群：氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液、丙烯酸系或甲基丙烯酸系聚合物、马来酸酐与烯基衍生物之共聚物、RIBI佐剂系统、嵌段共聚物、SAF-M、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺、来自大肠杆菌(重组或其它)之不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽及其组合。
因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该医药上可接受之载体系佐剂。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之一方面中，医药上可接受之载体系水包油包水乳液或卡波姆。因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该医药上可接受之载体系水包油包水乳液或卡波姆。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之一方面中，水包油包水乳液系Montanide ISA207VG。MontanideISA207VG系由无水甘露醇之油酸酯于非矿物油中之溶液组成之佐剂，且经设计以获得水包油包水疫苗乳液。Montanide ISA207VG为本领域技术人员所熟知且可立即使用。
因此，根据一方面，本申请提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该医药上可接受之载体系Montanide ISA207VG或较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
本发明亦系关于如上文所述用于增强支原体抗原之免疫原性之方法。有利地，本发明所提供实验数据揭示，通过上述方法提供之支原体菌抗原具有与自在无细胞培养系统中培养之支原体菌获得之抗原相比增强之免疫原性。特定而言，基于MDCK之猪鼻支原体疫苗显示较早开始血清转化、较大血清阳性猪数目及较高血清学效价。
因此，根据一方面，本申请提供增强抗原之免疫原性之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之一方面中，抗原具有与自在无细胞培养系统中培养之支原体菌获得之抗原相比增强之免疫原性。因此，根据一方面，本申请提供增强抗原之免疫原性之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该免疫原性组合物具有与包含自在无细胞培养系统中培养之支原体菌获得之相同抗原之免疫原性组合物相比增强之免疫原性。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
如本文所用术语“增强之免疫原性”意指，由包含所关注抗原之免疫原性组合物引起之免疫反应比包含相同抗原之参照免疫原性组合物更增强，其中参照免疫原性组合物中之抗原系由在无细胞培养系统中培养之支原体菌制备。
术语“增强”意指该细胞及/或抗体介导之免疫反应比由包含相同抗原之参照免疫原性组合物引发之细胞及/或抗体介导之免疫反应更增强至少10％、较佳至少20％、更佳至少30％、甚至更佳至少40％、甚至更佳至少50％、甚至更佳至少75％、最佳至少100％，其中参照免疫原性组合物之抗原系由在无细胞培养系统中培养之支原体菌制备。本领域技术人员通常已知如何测量细胞及/或抗体介导之免疫反应。具体而言，该本领域技术人员了解，可比较所关注免疫原性组合物之细胞介导之免疫反应与参照之细胞介导之免疫反应，或比较所关注免疫原性组合物与参照组合物之间之抗体介导之免疫反应，但不比较所关注免疫原性组合物之细胞介导之免疫反应与参照之抗体介导之免疫反应，或反之亦然。此外，细胞介导之免疫反应可通过(例如)测量所关注免疫原性组合物/抗原对细胞毒性T细胞之活化作用来测量。抗体介导之免疫反应可通过(例如)测量因向动物施用包含该抗原之免疫原性组合物而生成之抗原特异性抗体之量来测量。细胞及/或抗体介导之免疫反应可通过(例如)使用小鼠模型、猫模型、牛模型或猪模型来测量。然而，应使用实施例4及5中所述之分析作为参照分析，来检测针对猪鼻支原体及猪肺炎支原体之免疫反应。
术语“相同抗原”意指抗原之性质相同。因此，若在低血清真核细胞系统中产生之免疫原性组合物中之支原体抗原系猪鼻支原体之完整灭活死菌苗，则相同抗原意指无细胞系统之支原体抗原亦系猪鼻支原体之完整灭活死菌苗。此外，若在低血清真核细胞系统中产生之免疫原性组合物中之支原体抗原系根据特定方法制备或纯化，则相同抗原意指无细胞系统之支原体抗原系根据相同方法制备或纯化。
术语“参照”免疫原性组合物系指并非根据本发明通过在低血清或无猪血清真核细胞系统中培养支原体菌获得之免疫原性组合物。
相反，术语“参照”免疫原性组合物系指通过在补充有使用相同抗原之血清之无细胞培养系统中培养支原体菌获得之免疫原性组合物。在补充有血清之无细胞培养系统中培养支原体菌为本领域技术人员所熟知。血清来源及血清浓度取决于欲培养之支原体菌以及欲获得之支原体菌之产率。猪鼻支原体、猪肺炎支原体及猪滑液支原体一般系在补充有10-20％(v/v)猪血清及5-10％(v/v)酵母提取物之无细胞培养系统中培养以获得高产率。然而，应理解，血清浓度可变，可除去酵母提取物且血清来源可变为(例如)胎牛血清或诸如此类。
本发明不仅提供如上文所定义之制备免疫原性组合物之方法或增强抗原之免疫原性之方法，其亦系关于可通过如上文所述之方法获得之免疫原性组合物。因此，在另一方面中，本申请系关于可通过根据本发明且如本文所述之方法可获得之免疫原性组合物。一般而言，该方法包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在本发明之一方面中，免疫原性组合物显示与包含抗原之参照免疫原性组合物相比增强之免疫原性，其中参照免疫原性组合物之抗原系由在无细胞培养系统中培养之支原体菌制备。
因此，根据另一方面，本申请提供可通过包含以下之方法获得之免疫原性组合物：a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体。根据另一方面，该免疫原性组合物显示与包含由在无细胞培养系统中培养之支原体菌制备之相同抗原之参照免疫原性组合物相比增强之免疫原性。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在另一方面中，免疫原性组合物包含该真核细胞系统中之真核细胞之组份。
术语“真核细胞之组份”包含完整细胞及该等真核细胞之碎片二者。术语“碎片”包含真核细胞之任何部分，例如作为整体或其部分之细胞膜或细胞内细胞器之部分。然而，术语碎片亦涵盖该真核细胞中包含脂质、蛋白质、糖、DNA、RNA及诸如此类以及其组合之任何部分。此外，真核细胞之组份及支原体抗原可分开存于免疫原性组合物中或彼此附接或其组合。
因此，根据一方面，本申请提供可通过包含以下之方法获得之免疫原性组合物：a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该免疫原性组合物包含该真核细胞系统中之真核细胞之组份。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
在另一方面中，真核细胞之该等组份附接至支原体抗原。
术语“附接的”系指真核细胞之该等组份对支原体抗原之任何相互作用、缔合、结合、附着或连接。因此，术语附接的涵盖任何相互作用，包括间接或直接的、不可逆或可逆的、物理及化学的、静电及/或共价键。因此，必须理解，真核细胞之组份可(例如)结合至支原体抗原。然而，必须理解，真核细胞之组份亦可连接至支原体抗原。该连接可通过若干种本领域技术人员熟知之方法来产生，例如甲醛处理及诸如此类。
因此，根据一方面，本申请提供可通过包含以下之方法获得之免疫原性组合物：a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中真核细胞之该等组份附接至支原体抗原。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
通常，在使用菌抗原(该支原体死菌苗)时，免疫原性组合物含有约103至约1010菌落形成单位(CFU)之菌抗原/剂量、较佳约104至约109CFU之菌抗原/剂量、更佳约105至约106CFU之菌抗原/剂量之量。若在免疫原性组合物中使用灭活死菌苗，则CFU值系指支原体菌在灭活之前之量。
举例而言，本发明之包含猪肺炎支原体抗原之免疫原性组合物较佳以约102至约1010CFU/剂量、较佳约103至约109CFU/剂量之量使用，甚至更佳以约104至约108CFU/剂量之量使用，最佳以约105至约107CFU/剂量之量使用。本发明之包含猪鼻支原体抗原之免疫原性组合物较佳以约102至约1010CFU/剂量、较佳约103至约109CFU/剂量之量使用，甚至更佳以约104至约108CFU/剂量之量使用，最佳以约105至约107CFU/剂量之量使用。本发明之包含猪滑液支原体抗原之免疫原性组合物较佳以约102至约1010CFU/剂量、较佳约103至约109CFU/剂量之量使用，甚至更佳以约104至约108CFU/剂量之量使用，最佳以约105至约107CFU/剂量之量使用。
因此，根据一方面，本申请提供用于提供免疫原性组合物之方法，其包含a)在低血清或不含猪血清之真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该等支原体菌之抗原；及c)添加医药上可接受之载体，其中该免疫原性组合物含有约103至约1010菌落形成单位(CFU)之菌抗原/剂量之量。较佳地，至少一种支原体抗原系完整灭活支原体死菌苗，较佳为经福尔马林灭活之完整灭活支原体死菌苗。应理解，仅一种、一些或所有支原体抗原可为完整灭活死菌苗。
本领域技术人员理解，可组合用于提供如本文所述之免疫原性组合物之方法之各个过程步骤以实践如本文所述之本发明。
具体实施方式
实施例
以下实施例仅意欲阐释本发明。其决不应限制申请专利范围之范畴。
实施例1分别在MDCK细胞或McCoy细胞中之支原体菌之培养。
A.在MDCK细胞中之猪鼻支原体、猪滑液支原体及猪肺炎支原体之培养
猪鼻支原体：
将汇合T75烧瓶之MDCK细胞用胰蛋白酶处理，并使用MEM+5％FBS继代培养至5个T150烧瓶(1:10分开)中。将烧瓶在37℃+5％CO2下温育直至观察到约95-100％汇合单层为止。倒出培养基并将烧瓶用1×PBS冲洗两次。然后将4-5ml猪鼻支原体添加至每一烧瓶(MOI＝10-100)。在与上文相同之温育条件下将烧瓶感染不超过2小时。在感染期后，将升温至约37℃之足量感染培养基(MEM+2％FBS)添加至每一烧瓶中至每一烧瓶中60ml之总体积。然后温育烧瓶直至CPE>90％(约3-7天)。然后自每一烧瓶收集细胞悬浮液并汇集在一起(传代n次)。然后使用此汇集材料以与先前感染相同之方式感染95-100％汇合MDCK细胞之新烧瓶(传代n+1次)，增加所用烧瓶数以获得认为需要之足够最终体积(传代n+2次，传代n+3次等)。
猪滑液支原体：
猪滑液支原体系以与猪鼻支原体相同之方式培养，但略有不同：感染培养基含有DMEM+2％FBS+1％精氨酸溶液；猪滑液支原体通常不展现CPE，故培养基之颜色变化及浊度系继代培养至下一代之关键指示剂。
猪肺炎支原体：
猪肺炎支原体系以与猪鼻支原体相同之方式培养。取决于用于感染之菌株，CPE可存在或可不存在。因此，可使用培养基之颜色变化及浊度作为继代培养至下一代之指示剂。
B.在McCoy细胞中用于猪鼻支原体、猪滑液支原体及猪肺炎支原体之培养条件
猪鼻支原体：
McCoy细胞系以悬浮培养物形式在搅拌烧瓶中在补充有10％FBS之改良EMEM中生长。通过接种新烧瓶以具有105-106细胞/ml浓度之最终计数来对细胞进行继代培养。对于猪鼻支原体，在3L烧瓶中以1ml 107-108CFU接种105-106细胞/ml浓度的500ml细胞悬液。将烧瓶在37℃及5％CO2存在下在磁性搅拌板上温育3-7天。支原体生长系通过明显酸性pH变化及浊度之增加来确定。亦通过PFU分析测定计数来评估支原体生长。
猪滑液支原体：
猪滑液支原体系以与猪鼻支原体类似之方式来培养。在3L烧瓶中以1ml 105-107CFU接种105-106细胞/ml浓度的500ml细胞悬液。然后将烧瓶在37℃及5％CO2下在磁性搅拌板上温育约2周。除了使用PFU分析测定计数以外，使用pH变化及浊度之增加二者来测定生长。
猪肺炎支原体：
猪肺炎支原体系以与猪鼻支原体及猪滑液支原体相同之方式来培养。在3L烧瓶中以1ml 105-107CFU接种105-106细胞/ml浓度的500ml细胞悬液。然后将烧瓶在37℃及5％CO2下在磁性搅拌板上温育约2周。除了使用PFU分析测定计数以外，可使用pH变化及浊度之增加二者来测定生长。
C.使用各种血清型之支原体之培养
为评估是否可在不同来源之不同血清型中培养支原体，用猪鼻支原体感染MDCK细胞且分别在胎牛血清、猪血清、兔血清、鸡血清或马血清中培养。对于每种血清类型，猪鼻支原体在MDCK细胞中之培养系如上文所述来实施(5％血清用于细胞生长且2％血清用于感染)。根据标准方法在感染后4天采集猪鼻支原体。实施CCU(颜色变化单位)分析以测定猪鼻支原体之活效价。此外，实施qPCR(定量实时聚合酶链式反应)以测定猪鼻支原体之总基因组含量。示例性实验如表1所示。
表1：使用各种血清型之猪鼻支原体之培养
表1显示，通过CCU分析或qPCR测量之各种血清型之效价类似。此外，西方墨点法(western blot)数据(未显示)支持此数据。因此，不管使用何种血清型进行培养，皆可在MDCK细胞中培养猪鼻支原体。
实施例2疫苗之制备
在最终代备妥以采集(存在>90％CPE)时，通过以下方式对所有烧瓶实施单一冷冻-解冻循环：将其置入<-60℃冷冻器中保持>2小时，在37℃下快速解冻，收集并汇集裂解物，并上下抽吸若干次以匀浆。概言之，然后将10-20％甘油添加至此悬浮液中并使其匀浆。然后将此悬浮液备妥以等分为工作体积。将母液保持在<-60℃下直至需要。
用0.2％福尔马林将适当体积之上述母液灭活。在疫苗混合时用亚硫酸氢钠中和过量福尔马林。将疫苗与MontanideTM ISA207VG佐剂或与佐剂掺和。将疫苗储存在2-7℃下。
实施例3对疫苗有效性之评价
在猪中之施用后，基于诱导抗体反应之能力(以及通过ELISA之效价)评估疫苗效能。
动物照护
在开始研究之前，动物处于良好健康及营养状态。在随机化程序之前实施健康检查。在整个研究期间使用不加药饲料。根据设施标准操作程序，饲量适合于测试动物之年龄、情况及物种。在整个研究期间随意提供水。
在猪中之施用后对猪鼻支原体及猪肺炎支原体疫苗之有效性之评价。
猪鼻支原体：
在D0以及在D21向6周±5日龄常规仔猪之所有动物肌内施用2ml剂量(7.1-7.3log10CCU/剂量)之猪鼻支原体疫苗。如上文所述在MDCK细胞中培养猪鼻支原体。疫苗加有Montanide ISA207VG或佐剂。使用PBS作为安慰剂。每天观察猪之一般健康。在疫苗接种之前在D0、7、14、21、28、35及42收集血液。通过BIVI R&D间接ELISA测试血清之猪鼻支原体特异性抗体。对于BIVI R&D ELISA，认为>0.200之S/P比率为阳性。
如表2中实施例所示，猪鼻支原体ELISA指示强抗体反应。在第一剂量后两周(D14)，6/6只(100％)猪鼻支原体-MDCK+Montanide ISA207VG疫苗接种动物为阳性。至D42所有动物皆保持阳性，且在第二剂量后一周(D28)记录到效价加强。经猪鼻支原体-MDCK+疫苗接种之动物亦显示抗体反应。
表2：猪鼻支原体ELISA结果
使用在McCoy细胞中培养猪鼻支原体获得类似的疫苗接种后抗体反应结果，数据未显示。在施用单一剂量后获得类似结果，数据未显示。
猪肺炎支原体：
在D0以及在D21向6周±5日龄常规仔猪之所有动物肌内施用2ml剂量(8.0-8.5log10CCU/剂量)之猪肺炎支原体疫苗。疫苗加有Montanide ISA207VG佐剂。使用PBS作为安慰剂。每天观察猪之一般健康。在疫苗接种前在D0、7、14、21、28、35及42收集血液，以用于测试猪肺炎支原体抗体之存在。在一个实施例中，使用市售IDEXX ELISA。对于IDEXXELISA，认为S/P比率>0.400为阳性。
如表3所示，猪肺炎支原体ELISA指示强抗体反应。对于猪肺炎支原体MDCK+ISA207疫苗接种动物，在D14有3/6只(50％)动物为阳性，且在D21有5/6只(83.3％)为阳性，且在D28、35及42有6/6只(100％)为阳性。
表3：猪肺炎支原体IDEXX ELISA结果
在施用单一剂量后获得类似结果，数据未显示。
实施例4自在真核细胞系中培养之支原体菌获得之疫苗对比自在无细胞系统中培 养之支原体菌获得之疫苗之有效性
将54只8周±5日龄之CD/CD动物分为六组。组V1及V2各自分别接受在MDCK细胞及CM(复合培养基；例如含有猪血清及酵母提取物之基于朊间质蛋白胨之培养基，或弗瑞斯(Friis)基培养基)中培养之猪鼻支原体之灭活MHRN001分离物；组V3及V4分别接受在MDCK细胞及CM中培养之猪鼻支原体之灭活MHRN002分离物。所有疫苗皆加有MontanideISA207VG佐剂；剂量及途径为肌内注射2×2ml剂量，在D0给予一个剂量，且在D21给予第二剂量。组CC(对照组)以相同方式接受无抗原安慰剂(PBS)。组SC(严格对照)在整个研究中不接受处理，用作严格对照动物。在D42、43及44，用有毒力猪鼻支原体激发组V1-V4及CC中之猪。施用剂量及途径分别为40ml腹膜内、15ml静脉内及15ml鼻内。自D0至研究结束时(D58)每周收集血液用于猪鼻支原体特异性ELISA测试。对于R&D猪鼻支原体ELISA，认为S/P比率>0.200为阳性。在表4所示的示例性研究中，组SC中之所有猪在整个研究中皆保持阴性，表明其未暴露于猪鼻支原体。组V1-V4及CC在D0及7为阴性。然而，在基于CM之疫苗与基于MDCK之疫苗之间，血清学结果显著变化。在与基于CM之疫苗相比时，基于MDCK之疫苗显示较早开始血清转化、较大血清阳性猪数目及较高血清学效价。
表4：猪鼻支原体ELISA结果
进行滴定实验以将基于细胞培养物之疫苗与来自无细胞系统中培养之支原体菌之疫苗比较。
猪鼻支原体分别系如上文所述在McCoy细胞中培养，或在CM(复合培养基)中培养。
用McCoy抗原使用皆1:1掺和Montanide ISA207VG佐剂之未稀释抗原(完全)、1:10抗原及1:100抗原制备疫苗。以相同方式制备使用CM源抗原之疫苗。
在第0天用IM施用之单一2mL剂量对猪(在疫苗接种时三周龄)进行疫苗接种。
如表5所示，组平均值在激发前(D0-D21)皆为“阴性”，但“McCoy+ISA完全”和“McCoy+ISA1:10”显示趋向于阳性的反应。在激发后一周(D28)，除了CM 1:100以外所有疫苗接种组皆有反应。
自表5可了解，每一抗原类型(McCoy、CM)展现标准滴定效应(完全>1:10>1:100)。此外，自表5可知，“McCoy+ISA完全”和“McCoy+ISA1:10”疫苗接种物平均分高于“CM+ISA完全”抗原，且在D42之结束前始终如此。具有激发后阳性(S/P≥0.200)平均值之组系“McCoy+ISA完全”和“McCoy+ISA 1:10”组。因此McCoy完全疫苗及1:10稀释液显示血清反应在激发前及激发后皆高于CM完全疫苗。此外，McCoy 1:100接种的动物也在显示与安慰剂(非疫苗接种物)及CM 1:100组(CM 1:100反应或其缺乏等效于非疫苗接种物)不同之反应。滴定实验表明基于细胞培养物之疫苗相比于在无细胞系统中培养之支原体菌之疫苗具有更好的血清学结果。
表5：猪鼻支原体ELISA结果

Claims (22)

1.一种制备用于治疗及/或预防对象中支原体感染的免疫原性组合物的方法，其包括：
a.)在低血清真核细胞系统中培养支原体菌；
b.)获得所述支原体菌的抗原；及
c.)添加医药上可接受的载体。
2.如权利要求1的方法，其中所述血清不含猪血清。
3.如权利要求1的方法，其中所述支原体菌在不存在血清下培养。
4.如权利要求1至3中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物为支原体免疫原性组合物。
5.如权利要求1至4中任一项的方法，其中所述抗原相比于自无细胞培养系统中培养的支原体菌获得的抗原具有增强的免疫原性。
6.如权利要求1至5中任一项的方法，其中所述抗原为完整灭活死菌苗。
7.如权利要求6的方法，其中所述完整灭活死菌苗为福尔马林灭活死菌苗。
8.如权利要求1至7中任一项的方法，其中所述真核细胞系统包含MDCK细胞系。
9.如权利要求1至7中任一项的方法，其中所述真核细胞系统包含McCoy细胞系。
10.如权利要求1至9中任一项的方法，其中所述支原体菌选自由以下组成的列表：猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、猪滑液支原体(M.hyosynoviae)、其任何组合、及牛支原体(M.bovis)。
11.如权利要求1至9中任一项的方法，其中所述支原体菌为选自含有以下的列表：猪肺炎支原体、猪鼻支原体及猪滑液支原体。
12.如权利要求1至11中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物经配制用于单一剂量施用。
13.如权利要求1至12中任一项的方法，其中所述对象为猪。
14.如权利要求1至12中任一项的方法，其中所述对象为牛。
15.如权利要求1至12中任一项的方法，其中所述对象为猫。
16.如权利要求1至12中任一项的方法，其中所述对象为狗。
17.如权利要求1至16中任一项的方法，其中所述医药上可接受的载体选自以下：溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。
18.如权利要求1至17中任一项的方法，其中所述医药上可接受的载体选自由以下组成的佐剂：氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐与烯基衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、嵌段共聚物、SAF-M、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺、来自大肠杆菌(重组或其它)的不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽及其组合。
19.如权利要求1至18中任一项的方法，其中所述医药上可接受的载体为水包油包水乳液或卡波姆。
20.如权利要求1至19中任一项的方法，其用于提高抗原的免疫原性。
21.如权利要求20的方法，其中所述抗原相比于自无细胞培养系统中培养的支原体菌获得的抗原具有增强的免疫原性。
22.一种免疫原性组合物，其可通过如权利要求1至21中任一项的方法获得。
CN201810161003.1A 2012-12-28 2013-12-20 支原体疫苗的制备方法 Pending CN108379571A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261746997P 2012-12-28 2012-12-28
US61/746,997 2012-12-28
CN201380066001.XA CN104968365B (zh) 2012-12-28 2013-12-20 支原体疫苗的制备方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380066001.XA Division CN104968365B (zh) 2012-12-28 2013-12-20 支原体疫苗的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108379571A true CN108379571A (zh) 2018-08-10

Family

ID=49917778

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380066001.XA Active CN104968365B (zh) 2012-12-28 2013-12-20 支原体疫苗的制备方法
CN201810161003.1A Pending CN108379571A (zh) 2012-12-28 2013-12-20 支原体疫苗的制备方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380066001.XA Active CN104968365B (zh) 2012-12-28 2013-12-20 支原体疫苗的制备方法

Country Status (23)

Country Link
US (2) US9273281B2 (zh)
EP (1) EP2938747B1 (zh)
JP (2) JP6122146B2 (zh)
KR (1) KR102153275B1 (zh)
CN (2) CN104968365B (zh)
AR (1) AR094648A1 (zh)
AU (1) AU2013370983B2 (zh)
BR (1) BR112015012711B1 (zh)
CA (1) CA2896298C (zh)
CL (1) CL2015001562A1 (zh)
DK (1) DK2938747T3 (zh)
EA (1) EA032772B1 (zh)
ES (1) ES2738100T3 (zh)
HU (1) HUE045015T2 (zh)
MX (1) MX361273B (zh)
MY (1) MY173223A (zh)
PH (1) PH12015501333A1 (zh)
PL (1) PL2938747T3 (zh)
PT (1) PT2938747T (zh)
SG (2) SG11201505089YA (zh)
TW (2) TWI660736B (zh)
UA (1) UA121193C2 (zh)
WO (1) WO2014105672A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201050A (zh) * 2020-08-06 2021-08-03 青岛诺安百特生物技术有限公司 一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8546149B2 (en) 2010-08-27 2013-10-01 Intervet Inc. Potency test for vaccine formulations
EP2938747B1 (en) * 2012-12-28 2019-05-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Method of making a mycoplasma vaccine
MX2015007729A (es) * 2012-12-28 2015-09-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Composicion inmunogenica que comprende antigenos de mycoplasma.
CN105441368B (zh) * 2016-01-19 2019-01-01 福清市默克兽医院 一株牛支原体及其应用
US10222383B2 (en) 2016-01-29 2019-03-05 Advanced Animal Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting mycoplasma exposure
CA3033143C (en) * 2016-08-09 2021-05-25 Agricultural Technology Research Institute Composition for preventing and treating mycoplasma hyorhinis infection, and method for producing said composition
EP3576799A4 (en) * 2017-02-03 2020-12-30 The Administrators of The Tulane Educational Fund OPHTHALMIC COMPOSITIONS FOR THERAPY AND PROPHYLAXIS
WO2018216524A1 (ja) 2017-05-24 2018-11-29 三菱ケミカル株式会社 成形材料、および繊維強化複合材料
KR20220018508A (ko) 2019-06-10 2022-02-15 엘랑코 유에스 인코포레이티드 마이코플라즈마 배지 제형

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050037027A1 (en) * 2003-06-20 2005-02-17 Animal Technology Institute Taiwan Mycoplasma vaccine, method of making, and application thereof
CN101883581A (zh) * 2007-11-06 2010-11-10 惠氏有限责任公司 猪肺炎支原体无毒力佐剂化活疫苗

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
GB1074920A (en) * 1965-04-21 1967-07-05 Pfizer & Co C Growth medium for mycoplasma pneumoniae and vaccine production
GB1137306A (en) * 1966-07-11 1968-12-18 Research Corp Inoculum for poultry
JPS5540568B2 (zh) 1972-10-05 1980-10-18
US5338543A (en) 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
US5885823A (en) 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
DE60142506D1 (de) * 2000-03-03 2010-08-19 Chemo Sero Therapeut Res Inst In serumfreier kultur verwendbare zelle, kultursuspension und verfahren zur virusproduktion als impfstoff unter verwendung der zelle
JP3402304B2 (ja) * 2000-03-30 2003-05-06 株式会社微生物化学研究所 猫クラミジアワクチンの製造方法
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY129765A (en) 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
BR0211049A (pt) 2001-07-02 2004-07-20 Pfizer Prod Inc Método de tratamento ou prevenção de doenças ou disfunções e uso de mycoplasma hyopneumoniae
EA009901B1 (ru) 2001-07-02 2008-04-28 Пфайзер Продактс Инк. Способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения у животного, вызванного mycoplasma hyopneumoniae
US20030147914A1 (en) 2001-07-02 2003-08-07 Pfizer Inc. Mycoplasma bovis vaccine and methods of reducing pneumonia in animals
JP2005500845A (ja) 2001-08-28 2005-01-13 ファイザー・プロダクツ・インク マイコプラズマ・ボビスチャレンジモデル並びにマイコプラズマ・ボビスの投与方法及び肺炎性肺病変の誘発方法
US20080185755A1 (en) 2005-02-09 2008-08-07 Todd Deaville Method of Manufacturing a semi-Structural Panel
ES2424365T3 (es) * 2005-03-10 2013-10-01 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cepa de células que pueden cultivarse sin componentes de origen animal, procedimiento para su producción, procedimiento de producción de virus usando dicha cepa y procedimiento de producción de una vacuna
WO2007042827A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Ivan Petyaev Treatment and diagnosis of obligate intracellular pathogens
ES2473275T3 (es) 2006-09-15 2014-07-04 Medimmune, Llc Líneas de células MDCK que soportan el crecimiento viral hasta altos títulos y proceso de biorreactor que las usa.
US20090068231A1 (en) 2007-09-11 2009-03-12 Wyeth Live attenuated mycoplasma strains
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
KR20100113582A (ko) 2008-01-23 2010-10-21 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법
US8444989B1 (en) 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
JPWO2009142086A1 (ja) 2008-05-23 2011-09-29 学校法人 久留米大学 マイコプラズマ感染症用ワクチン組成物
ES2569907T3 (es) 2008-06-27 2016-05-13 Zoetis Services Llc Composiciones adyuvantes novedosas
EP2362780B1 (en) 2008-10-31 2019-12-25 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Use of various antigens including antigens from mycoplasma bovis in multivalent vaccine composition
CN102458462B (zh) 2009-05-19 2014-03-19 澳大利亚生物资源公司 一种温度敏感的猪肺炎支原体疫苗株及其应用
WO2011075379A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent vaccine against porcine teschovirus and other disease causing organisms in swine
US8112663B2 (en) 2010-03-26 2012-02-07 Lsi Corporation Method to establish redundancy and fault tolerance better than RAID level 6 without using parity
CN102258776B (zh) 2011-07-07 2013-07-10 普莱柯生物工程股份有限公司 猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗及其制备方法
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
MX2015007729A (es) 2012-12-28 2015-09-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Composicion inmunogenica que comprende antigenos de mycoplasma.
EP2938747B1 (en) 2012-12-28 2019-05-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Method of making a mycoplasma vaccine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050037027A1 (en) * 2003-06-20 2005-02-17 Animal Technology Institute Taiwan Mycoplasma vaccine, method of making, and application thereof
CN101883581A (zh) * 2007-11-06 2010-11-10 惠氏有限责任公司 猪肺炎支原体无毒力佐剂化活疫苗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VOLOKHOV DV ET AL.: "Biological Enrichment of Mycoplasma Agents by Cocultivation with Permissive Cell Cultures", 《APPL ENVIRON MICROBIOL.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201050A (zh) * 2020-08-06 2021-08-03 青岛诺安百特生物技术有限公司 一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用
CN113201050B (zh) * 2020-08-06 2022-07-22 青岛诺安百特生物技术有限公司 一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
MX361273B (es) 2018-12-03
PL2938747T3 (pl) 2019-11-29
TW201832777A (zh) 2018-09-16
UA121193C2 (uk) 2020-04-27
AU2013370983A1 (en) 2015-05-21
CL2015001562A1 (es) 2016-06-24
JP2016508983A (ja) 2016-03-24
PH12015501333A1 (en) 2015-09-02
WO2014105672A1 (en) 2014-07-03
EA201500701A1 (ru) 2015-12-30
AR094648A1 (es) 2015-08-19
SG10201708028VA (en) 2017-10-30
BR112015012711B1 (pt) 2022-08-16
TW201438732A (zh) 2014-10-16
US20140186394A1 (en) 2014-07-03
CA2896298A1 (en) 2014-07-03
CN104968365B (zh) 2018-04-03
HUE045015T2 (hu) 2019-11-28
CN104968365A (zh) 2015-10-07
MY173223A (en) 2020-01-07
KR20150100920A (ko) 2015-09-02
EP2938747A1 (en) 2015-11-04
US20160136254A1 (en) 2016-05-19
US10512680B2 (en) 2019-12-24
JP6449364B2 (ja) 2019-01-09
PT2938747T (pt) 2019-08-01
TWI660736B (zh) 2019-06-01
TWI618542B (zh) 2018-03-21
ES2738100T3 (es) 2020-01-20
SG11201505089YA (en) 2015-07-30
MX2015007730A (es) 2015-09-07
DK2938747T3 (da) 2019-08-05
KR102153275B1 (ko) 2020-09-09
JP2017145253A (ja) 2017-08-24
EP2938747B1 (en) 2019-05-01
AU2013370983B2 (en) 2019-09-26
EA032772B1 (ru) 2019-07-31
JP6122146B2 (ja) 2017-04-26
BR112015012711A2 (pt) 2017-07-11
US9273281B2 (en) 2016-03-01
CA2896298C (en) 2024-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104968365B (zh) 支原体疫苗的制备方法
AU2018202698B2 (en) Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180810

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication