EA032772B1 - Способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта - Google Patents

Способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта Download PDF

Info

Publication number
EA032772B1
EA032772B1 EA201500701A EA201500701A EA032772B1 EA 032772 B1 EA032772 B1 EA 032772B1 EA 201500701 A EA201500701 A EA 201500701A EA 201500701 A EA201500701 A EA 201500701A EA 032772 B1 EA032772 B1 EA 032772B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mycoplasmic
bacteria
hyorhinis
immunogenic composition
serum
Prior art date
Application number
EA201500701A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201500701A1 (ru
Inventor
Дайана М. Мёрфи Джордан
Брайан Томас Мартинсон
Кристине Маргарет Мьюленталер
Аксель Нойбауер
Арун В. Айер
Original Assignee
Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49917778&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA032772(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх filed Critical Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх
Publication of EA201500701A1 publication Critical patent/EA201500701A1/ru
Publication of EA032772B1 publication Critical patent/EA032772B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/70—Non-animal cells

Abstract

В заявке описан способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта, включающий культивирование микоплазматических бактерий в системе на основе эукариотических клеток, содержащей клеточную линию MDCK или клеточную линию McCoy и до 10% сыворотки, получение антигена микоплазматических бактерий и добавление фармацевтически приемлемого носителя. При этом указанные микоплазматические бактерии выбирают из М. Hyopneumoniae, M. Hyorhinis и М. Hyosynovia.

Description

Предпосылки создания изобретения
Бактерии рода Mycoplasma принадлежат к классу Mollicutes и представляют собой группу организмов, имеющую происхождение из типа Firmicutes (фирмикуты). Mollicutes представляют собой самые мелкие автономно реплицирующиеся организмы, которые структурно отличаются от других эубактерий отсутствием у них клеточной стенки. Поверхность их однослойной мембраны рассматривается в качестве поверхности раздела, имеющей решающее значение для адаптации и выживания, которые имеют место в обладающем сложным механизмом иммунокомпетентном хозяине. Кроме того, Mollicutes имеет небольшой геном и ограниченное количество метаболических путей. По этой причине представители рода Mycoplasma описаны также в качестве минимальных самореплицирующихся организмов. Однако несмотря на эту кажущуюся простоту, большое количество микоплазматических бактерий являются патогенами человека и широкого спектра животных. В отличие от других патогенных бактерий, вирулентность которых главным образом определяется токсинами, инвазинами и цитолизинами, патогенные микоплазматические бактерии, по-видимому, не имеют указанных типичных первичных факторов вирулентности (Chambaud I. и др., Nucleic Acids Res. 29, 2001, сс. 2145-2153, Fraser и др., Science 270, 1995, сс. 397-403). В настоящее время доступно лишь небольшое количество данных о молекулярных механизмах и факторах, которые обеспечивают патогенным микоплазмам возможность повреждать клеткихозяева, вызывать воспаление и заболевание.
Патогенные микоплазматические бактерии являются, прежде всего, возбудителями атипичной пневмонии, мочеполовых инфекций и артритов у человека и животных (Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control, под ред. Blanchard А. и G.F. Browning, изд-во Horizon Bioscience, Wymondham U.K., 2005; Kobisch M. и Friis N.F. Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1996, сс. 1569-1605). Известно, что реактивация или обострение симптомов повторяется и постепенно переходит в хроническую стадию заболевания, и по этой причине наряду с ранним диагностированием и ранним лечением важными являются предупреждение или лечение обострения или реактивации. М. Hyopneumoniae является этиологическим агентом энзоотической пневмонии. У свиней это является одной из наиболее распространенных и экономически важных болезней, с которой связаны пониженный прирост массы и плохая эффективность использования корма. Болезнь вызывает повреждение в легких, хронический кашель, тусклый волосяной покров, задержку роста и внешние признаки плохого развития, проявляющиеся в течение нескольких недель. Повреждения легких, прежде всего в вентральной верхушечной и сердечной долях, характеризуются гиперплазией эпителиальных клеток и повышенным накоплением мононуклеарных клеток в периваскулярном и перибронхиолярном пространстве. М. Hyorhinis, другой вид микоплазм, часто встречающийся в дыхательных путях свиней, может вызывать полисерозит и артрит у поросят. М. Hyosynoviae, как правило, локализованы в миндалинах и могут вызывать артрит, что приводит к экономическим потерям. М. Hyosynoviae выделяют из образцов, полученных из суставов и из гортани/миндалин, и этот вид может индуцировать образование антител в крови и синовиальной жидкости. М. Bovis рассматривается как один или наиболее патогенных видов микоплазматических бактерий, и он наносит серьезный экономический ущерб во всем мире. Микоплазматические бактерии вызывают серьезные клинические признаки у крупного рогатого скота всех возрастов. М. Bovis представляет собой наиболее часто встречающийся патоген Mycoplasma, который, как установлено, вызывает пневмонию, мастит и артрит у крупного рогатого скота, и его этиологическая роль также связана с отитом, кератоконъюнктивитом, синовитом и репродуктивными нарушениями у коров и быков.
Поскольку у микоплазм отсутствует клеточная стенка, на них не оказывают воздействие многие общепринятые антибиотики, такие как пенициллин или другие бета-лактамные антибиотики, мишенью которых является синтез клеточной стенки. Терапевтические средства, применяемые при заражении микоплазмами, которые нашли применение на практике, представляют собой некоторые антибиотики, например, на основе макролидов, или новые антибиотики на основе хинолонов или антибиотики на основе тетрациклинов, но для таких антибиотиков характерны вредные воздействия, такие как возникновение устойчивых к лекарственным средствам штаммов, что приводит к тому, что связанная с микоплазмами инфекция становится более серьезной, поскольку при этом не достигаются требуемые терапевтические воздействия, и это является предпосылкой для превращения в хроническую стадию заболевания. Кроме того, эффективным методом контроля вызываемой микоплазмами инфекции является вакцинация. Однако требуемые высокие выходы микоплазм, необходимые для приготовления вакцин, получают путем культивирования, как правило, только в комплексных средах (Kobisch M. и Friis N.F., Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1996, сс. 1569-1605; Gabridge M.G. и др., Cultivation of mycoplasma in a modified tissue culture medium, Applied and Environmental microbiology. 31,1976, сс. 986-989; Sotoodehnia А. и др., Preparation of agalactia vaccine in fermentor, Archieves of razi institute, 62, 207, сс. 45-48; Dahlia и др., Isolation of Mycoplasma hyosynoviae from penumonic lung of swine, Tropical Biomedicine 26, 2009, сс. 341-345). В зависимости от подлежащих культивированию микоплазматических бактерий комплексные среды дополняют 10-30% сыворотки и иногда дрожжевым экстрактом. Таким образом, из-за высокой стоимости сыворотки культивирование микоплазматических бактерий является дорогостоящим. Кроме того, снижение сыворотки в комплексных средах должно являться также благоприятным с позиций общего состояния здоровья животных. Таким образом, существует необходимость в культивирова
- 1 032772 нии с получением требуемых высоких выходов микоплазм в системе культивирования с пониженным содержанием сыворотки для получения иммуногенных композиций, эффективных в отношении предупреждения вызываемой микоплазмами инфекции. Кроме того, специфические для свиней микоплазматические бактерии, как правило, культивируют в комплексных средах, содержащих специфическую для свиней сыворотку (Kobisch M. и Friis N.F., Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1996, сс. 1569-1605). Однако специфическая для свиней сыворотка может содержать другие специфические для свиней патогены или может содержать антитела против специфических для свиней патогенов, что может приводить к пониженной иммуногенности полученной иммуногенной композиции. Таким образом, существует необходимость в культивировании с получением требуемых высоких уровней микоплазм в системе культивирования, не содержащей свиную сыворотку для получения иммуногенных композиций, эффективных в отношении предупреждения вызываемой микоплазмами инфекции.
Описание изобретения
Перед описанием объекта настоящего изобретения следует отметить, что в контексте настоящего описания и в прилагаемой формуле изобретения употребление понятия в единственном числе подразумевает также его упоминание во множественном числе, если из контекста точно не следует иное. Так, например, ссылка на антиген включает также множество антигенов, ссылка на клетку относится к одной или нескольким клеткам и их эквивалентам, известным специалистам в данной области, и т.д. Если не указано иное, то все технические и научные понятия, применяемые в контексте настоящего описания, имеют значения, хорошо известные обычному специалисту в области, к которой относится изобретение. Хотя для воплощения на практике или при тестировании настоящего изобретения можно применять любые методы и материалы, сходные или эквивалентные представленным в настоящем описании, ниже описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Все упомянутые в контексте настоящего описания публикации включены в него в качестве ссылки для целей описания и обсуждения клеточных линий, векторов и методологий, указанных в публикациях, которые можно применять в связи с изобретением. Ничто из указанного в настоящем описании не следует рассматривать как признание того, что в свете существующего уровня техники настоящее изобретение не может претендовать на объем, представленный в указанном описании.
Настоящее изобретение решает проблемы, имеющиеся в существующем уровне техники, и имеет выраженное преимущество в данной области техники.
В целом, в настоящем изобретении предложен способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта, включающий:
а) культивирование микоплазматических бактерий в культуральной среде, содержащей клеточную линию MDCK или клеточную линию McCoy и до 10% сыворотки;
б) получение инактивированного бактерина;
в) добавление фармацевтически приемлемого носителя, где указанные микоплазматические бактерии выбирают из М. Hyopneumoniae, M. Hyorhinis и М. Hyosynovia.
В предпочтительном варианте осуществления сыворотка в этом способе не содержит свиную сыворотку.
При этом инактивированный бактерин может представлять собой инактивированный формалином бактерин.
В предпочтительном варианте осуществления заявленного способа указанный субъект представляет собой свинью, корову, кошку или собаку. При этом указанный фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой эмульсию вода-в-масле-в воде или карбомер.
Указанную иммуногенную композицию можно приготовить в виде формы для однодозового введения.
Понятие иммуногенная композиция относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один антиген, который вызывает иммунологический ответ у хозяина, которому вводят иммуногенную композицию. Указанный иммунологический ответ может представлять собой клеточный и/или антителообусловленный (гуморальный) иммунный ответ на иммуногенную композицию, предлагаемую в изобретении. Хозяина обозначают также как субъект.
Как правило, иммунологический ответ включает (но, не ограничиваясь только ими) одно или несколько из следующих действий: производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Тклеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток и/или гамма-дельта-Т-клеток, направленных конкретно к антигену или антигенам, включенному(ым) в иммуногенную композицию. Предпочтительно у хозяина должен иметь место либо защитный иммунологический ответ, либо терапевтический ответ.
Защитный иммунологический ответ может проявляться либо в снижении, либо отсутствии клинических признаков, в норме характерных для инфицированного хозяина, более быстром времени восстановления, и/или меньшей продолжительности инвазионной способности, или более низким титром патогена в тканях или общей воде организма или экскрементах инфицированного хозяина.
В случае, когда у хозяина проявляется защитный иммунологический ответ, такой как устойчивость
- 2 032772 к новой инфекции, и/или у него снижается клиническая серьезность болезни, то иммуногенную композицию называют вакциной.
В контексте настоящего описания понятие антиген относится (но, не ограничиваясь только ими) к компонентам, которые вызывают иммунологический ответ у хозяина на представляющую интерес иммуногенную композицию или вакцину, содержащую указанный антиген или его иммунологически активный компонент. Антиген или его иммунологически активный компонент может представлять собой цельный микроорганизм (в инактивированной или модифицированной живой форме) или любой его фрагмент или фракцию, который/которая, если его/ее вводят хозяину, может вызывать иммунологический ответ у хозяина. Антиген может представлять собой или может содержать цельные живые организмы либо в их исходной форме, либо в виде ослабленных организмов в так называемой модифицированной живой вакцине (MLV). Антиген может дополнительно содержать элементы, присущие указанным организмам (субъединичные вакцины), при этом указанные элементы получают либо путем расщепления цельного организма или растущих культур указанных организмов и последующих стадий очистки с получением требуемых(ой) структур(ы), либо путем процессов синтеза с помощью соответствующей манипуляции в приемлемой системе, например (но, не ограничиваясь только ими) в бактериях, насекомых, млекопитающих и других видах, и необязательно путем последующих процедур выделения и очистки, либо путем индукции указанных процессов синтеза в животном, которое нуждается в вакцине, путем непосредственного включения генетического материала с использованием приемлемых фармацевтических композиций (вакцинация полинуклеотидом). Антиген может содержать цельные организмы, инактивированные соответствующими методами, в так называемой убитой вакцине (KV). Если организм представляет собой бактерию, то убитую вакцину называют бактерином.
Понятие лечение и/или профилактика относится к уменьшению заболеваемости инфекцией, вызываемой микоплазмами, стада или снижению серьезности клинических признаков, которые вызываются или ассоциированы с конкретной микоплазматической инфекцией. Так понятие лечение и/или профилактика относится также к уменьшению количества животных в стаде, которые становятся инфицированными конкретными микоплазматическими бактериями (т.е. к уменьшению заболеваемости конкретной инфекцией, вызываемой микоплазмой) или к снижению серьезности клинических признаков, которые, как правило, вызываются или ассоциированы с микоплазматической инфекцией в группе животных, в которой животных обрабатывали применяемой в эффективном количестве иммуногенной композицией, представленной в настоящем описании, по сравнению с группой животных, которых не обрабатывали указанной иммуногенной композицией.
Лечение и/или профилактика, как правило, предусматривает введение в эффективном количестве иммуногенной композиции животному или стаду животных, которые нуждаются в этом или на которых может оказывать благоприятное воздействие указанное лечение/указанная профилактика. Понятие лечение относится к введению в эффективном количестве иммуногенной композиции, когда особь или, по меньшей мере, несколько животных в стаде уже инфицированы указанной микоплазмой и когда у указанных животных уже обнаружены некоторые клинические признаки, которые вызываются или ассоциированы с микоплазматической инфекцией. Понятие профилактика относится к обработке особи до заражения указанной особи микоплазмой или, по меньшей мере, когда у указанного животного или ни у одного из животных в группе животных не обнаружены какие-либо клинические признаки, которые вызываются или ассоциированы с заражением указанной микоплазмой.
В контексте настоящего описания эффективное количество обозначает (но, не ограничиваясь только указанным) количество антигена, которое вызывает или может вызывать иммунный ответ у субъекта. Указанное эффективное количество может уменьшать заболеваемость конкретной микоплазматической инфекцией в стаде или снижать серьезность клинических признаков, связанных с конкретной микоплазматической инфекцией.
Предпочтительно частоту встречаемости или серьезность клинических признаков снижают по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% по сравнению с субъектами, которых либо не обрабатывали иммуногенной композицией, либо обрабатывали известной из существующего уровня техники иммуногенной композицией, но которые впоследствии были инфицированы конкретными микоплазматическими бактериями.
Понятие клинические признаки в контексте настоящего описания относится к признакам инфекции у субъекта, вызываемой микоплазматическими бактериями. Клинические признаки инфекции зависят от конкретного патогена. Примеры указанных клинических признаков включают (но, не ограничиваясь только ими) респираторный дистресс-синдром, полисерозит (такой как перитонит, плеврит, перикардит), артрит (хромота и опухание суставов), отит, огрубение волосяного покрова, небольшая лихорадка, депрессия, пониженный аппетит и бактериемия. При этом клинические признаки включают также (но, не ограничиваясь только ими) клинические признаки, которые поддаются непосредственному обнаружению
- 3 032772 у живого животного. Примеры клинических признаков, которые поддаются непосредственному обнаружению у живого животного, включают выделения из носа и глаза, апатичность, кашель, стерторозное дыхание, склонность к падению, повышенную температуру, прирост или потерю массы, обезвоживание, диарею, опухание суставов, хромоту, кахексию, бледность кожи, плохой рост и т.п.
Снижение частоты встречаемости или серьезности клинических признаков, вызываемых или ассоциированных с инфекцией конкретной микоплазмой, у субъекта можно достигать путем введения одной или нескольких доз иммуногенной композиции субъекту, который нуждается в этом. Как продемонстрировано в примерах 2 и 3, иммуногенная композиция, представленная в настоящем описании, обладала эффективностью после введения однократной дозы субъекту, нуждавшемуся в этом.
Понятие инфекция или инфицированный относится к заражению субъекта патогеном, т.е. М. Hyorhinis или М. Hyorhinis и М. Hyosynoviae или М. Hyorhinis, M. Hyopneumoniae и М. Hyosynoviae.
Понятие микоплазмы известно специалисту в данной области. Mycoplasma относится к роду бактерий, например, описанному в: Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control, под ред. Blanchard А. и G.F. Browning, изд-во Horizon Bioscience, Wymondham U.K., 2005; Kobisch M. и у Friis N.F., Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1996, сс. 1569-1605. Бактерии можно классифицировать на основе их биохимических и микробиологических свойств, а также их морфологии. Такие критерии классификации хорошо известны в данной области. Как правило, заражение микоплазмами ассоциируется с клиническими признаками, указанными в настоящем описании.
В контексте настоящего описания понятие микоплазмы относится к М. Hyorhinis или М. Hyorhinis и М. Hyosynoviae или М. Hyorhinis, M. Hyopneumoniae и М. Hyosynoviae. Пример полной геномной последовательности М. Hyorhinis представлен у Liu W. и др., J. Bacteriol. Т. 192 (21), 2010, сс. 5844-5845 doi: 10.1128/JB.00946-10, Epub от 27 августа 2010 г или у Calcutt M.J. и др., J. Bacteriol. т. 194 (7), 2012, с. 1848 doi: 10.1128/JB.00033-12. Например, изоляты М. Hyosynoviae депонированы в Американской коллекции тканевых культур под регистрационными номерами АТСС 25591 или АТСС 27095. Например, изоляты Mycoplasma hyopneumoniae депонированы в Американской коллекции тканевых культур под регистрационными номерами АТСС 25095, АтСС 25617 и АТСС 25934. Геномная ДНК J-штамма Mycoplasma hyopneumoniae депонирована в Американской коллекции тканевых культур под регистрационным номером АТСС 25934D. Изоляты Mycoplasma bovis хорошо известны специалисту в данной области, и некоторые изоляты депонированы, например, в Американской коллекции тканевых культур под регистрационными номерами АТСС 25025, АТСС 25523 и АТСС 27368.
Понятие культивирование известно специалисту в данной области. Понятие относится к размножению клеток в культуре вне организма. В частности, понятие культивирование относится к размножению клеток вне организма в клеточной системе.
Понятие клеточная система известно специалисту в данной области. В частности, клеточная система представляет собой клеточную систему in vitro для культивирования микроорганизма, такого, например, как микоплазматическая бактерия. Указанная клеточная система содержит клетки-хозяева и среду для культуры клеток, пригодную для размножения указанных клеток вне организма. В частности, клетки-хозяева могут быть чувствительными или нечувствительными к заражению микоплазматическими бактериями. Указанные клетки-хозяева могут присутствовать в виде живых клеток, в инактивированной форме или в виде клеточных фрагментов. Указанные клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки или систему на основе эукариотических клеток.
Под понятие система на основе эукариотических клеток подпадает система, содержащая первичные эукариотические клетки и эукариотические клетки, выведенные из многоклеточных организмов, таких как растения или животные. Кроме того, система на основе эукариотических клеток включает эукариотические одноклеточные организмы (которые называют также микроорганизмами), например бактерии или грибы, включая дрожжи. Однако эукариотические клетки отличаются от микоплазматических бактерий. Эукариотические клетки-хозяева, которые можно применять для воплощения на практике способа, представленного в настоящем описании, включают клетки Мадин-Дарби эпителия почки собаки (MDCK) (например, клетки Мадин-Дарби эпителия почки собаки, депонированные в Американской коллекции тканевых культур под регистрационным номером АТСС CCL-34 или АТСС CRL-2285) или клетки McCoy (например, депонированные в Американской коллекции тканевых культур под регистрационным номером АТСС CRL-1696).
Понятие бесклеточная система культивирования в контексте настоящего описания относится к системе культивирования, которая не содержит никакие клетки, кроме микоплазматических бактерий.
Понятие низкое содержание сыворотки относится к пониженному количеству сыворотки, добавляемому для культивирования микоплазматических бактерий в систему на основе эукариотических клеток по сравнению с количеством сыворотки, которое используют для культивирования микоплазматических бактерий этих же видов в бесклеточной системе культивирования. Количество сыворотки для культивирования микоплазматических бактерий в системе на основе эукариотических клеток по сравнению с количеством сыворотки для культивирования микоплазматических бактерий в бесклеточной системе культивирования может составлять до 10%. Согласно настоящему изобретению следует понимать, что эукариотические клетки или система на основе эукариотических клеток должны инфицироваться мико
- 4 032772 плазматическими бактериями. Заражение эукариотических клеток микоплазматическими бактериями и условия постинкубационного периода хорошо известны специалисту в данной области. Однако предпочтительно после трансфекции клетки инкубируют в течение периода времени, составляющего вплоть до 21 дня, более предпочтительно от примерно 2 дней до примерно 14 дней, более предпочтительно от примерно 2 дней до примерно 8 дней, еще более предпочтительно от примерно 3 до 5 дней. Предпочтительные условия инкубации включают температуру примерно от 32 до 42°С, более предпочтительно примерно от 34 до 40°С, еще более предпочтительно примерно от 35 до 39°С, еще более предпочтительно примерно от 36 до 38°С и наиболее предпочтительно примерно 37°С. Предпочтительные условия инкубации включают также концентрацию CO2, составляющую примерно от 2 до 8%, более предпочтительно примерно от 3 до 7%, еще более предпочтительно примерно от 4 до 6% и наиболее предпочтительно примерно 5%. Предпочтительно эукариотические клетки обследуют после трансфекции в отношении таких характеристик, таких как тенденции в отношении клеточной плотности, снижение жизнеспособности, включая цитопатические действия во время постинкубационного периода, и изменение цвета среды из-за изменений рН.
Понятие получение включает сбор, выделение, очистку и/или составление композиции (например, инактивацию и/или приготовление смеси) антигена.
Понятие сбор относится к сбору или извлечению антигена микоплазматических бактерий из трансфицированной системы на основе эукариотических клеток. Для извлечения указанного микоплазматического антигена можно применять любой общепринятый метод, известный в данной области, например любой метод разделения. Методы, хорошо известные в данной области, включают центрифугирование или фильтрацию, например, с использованием полупроницаемой мембраны, имеющей определенный размер пор.
Понятие выделение включает стадию выделения микоплазматического антигена. Методы выделения антигенов микоплазматических бактерий из инфицированной системы на основе эукариотических клеток известны специалисту в данной области. Указанные методы представляют собой физические и/или химические методы, включая (но, не ограничиваясь только ими) циклы замораживанияоттаивания, обработку ультразвуком и т.п.
Методы очистки антигенов из изолята хорошо известны специалистам в данной области, например представляют собой методы, описанные в Protein purification methods - a practical approach, под ред. E.L.V. Harris и S. Angal, изд-во IRL Press at Oxford University Press. Указанные методы включают (но, не ограничиваясь только ими) разделение путем центрифугирования и/или фильтрации, осаждение, вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), аффинную хроматографию, металл-хелатную хроматографию, ионообменную хроматографию, ковалентную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий и т.п. Антиген можно получать в очищенной (чистой) форме или в форме, свободной или практически свободной от других клеточных материалов или культуральной среды и т.д. После указанного выделения и/или очистки антиген имеет чистоту, составляющую по меньшей мере 80%, предпочтительно 80-90%, более предпочтительно 90-97%, наиболее предпочтительно более 97% вплоть до абсолютно чистотой формы без какого-либо загрязнения.
Понятие получение в контексте настоящего описания может включать также дополнительные стадии окончательной обработки типа стадий добавления буфера, инактивации, нейтрализации и т.п.
Для целей настоящего изобретения можно использовать любой общепринятый метод инактивации. Так инактивацию можно осуществлять путем химических и/или физических обработок, известных специалисту в данной области. Предпочтительные методы инактивации включают добавление циклизованного бинарного этиленимина (BEI), включая добавление раствора гидробромида 2-бромэтиленамина (ВЕА), циклизованного с образованием бинарного этиленимина (BEI). Другие предпочтительные химические инактивирующие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) Тритон X-100, дезоксихолат натрия, бромид цетилтриметиламмония, β-пропиолактон, тимеросал, фенол и формальдегид (формалин). Однако инактивация может включать также стадию нейтрализации. Предпочтительные нейтрализующие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) тиосульфат натрия, бисульфит натрия и т.п.
Предпочтительные условия инактивации формалином включают применение формалина в концентрации примерно от 0,02 до 2,0 об.%, более предпочтительно примерно от 0,1 до 1,0 об.%, еще более предпочтительно примерно от 0,15 до 0,8 об.%, еще более предпочтительно примерно от 0,16 до 0,6 об.% и наиболее предпочтительно примерно от 0,2 до 0,4 об.%. Продолжительность инкубации зависит от устойчивости видов микоплазм. Как правило, процесс инактивации осуществляют до тех пор, пока рост микоплазм не перестает поддаваться обнаружению в приемлемой системе культивирования.
При этом компонент, представляющий собой инактивированный бактерин, можно включать в липосомы, используя известную технологию, например, описанную в Nature, 252, 1974, сс. 252-254 или в Journal of Immunology, 120, 1978, сс. 1109-1113, или же его можно конъюгировать с приемлемыми биологическими соединениями, такими как полисахариды, пептиды, белки или т.п. или с их комбинацией.
Кроме того, культивирование микоплазматических бактерий можно осуществлять без сыворотки. Антигены микоплазм могут представлять собой цельный инактивированный микоплазматический бактерин. Следует понимать, что только один, несколько или все антигены микоплазм может(гут) представ
- 5 032772 лять собой полностью инактивированный микоплазматический бактерии.
Причем все микоплазматические антигены в иммуногенной композиции могут представлять собой цельные инактивированные бактерины. Цельный инактивированный бактерин можно получать путем инактивации полных микоплазматических бактерий с помощью описанных выше методов.
Предпочтительно микоплазматические бактерии инактивируют формалином согласно описанному выше методу. Предпочтительно формалин применяют в указанных выше концентрациях.
Клеточная линия MDCK (например, клетки Мадин-Дарби эпителия почки собаки) получена из почечной ткани взрослой самки кокер-спаниеля. В целом, клетки линии MDCK известны специалисту в данной области. Клеточная линия McCoy тоже известна специалисту в данной области.
Микоплазматические бактерии выбирают из группы, состоящей из М. Hyopneumoniae, M. Hyorhinis, M. Hyosynoviae и М. Bovis.
Важно отметить, что экспериментальные данные, представленные в описании настоящего изобретения, продемонстрировали, что введение одной дозы иммуногенной композиции достоверно и эффективно стимулировало защитный иммунный ответ. В частности, поддающийся измерению гуморальный иммунный ответ продемонстрирован для М. Hyorhinis и М. Hyopneumoniae.
Понятие субъект в контексте настоящего описания относится к животным, а именно к свиньям собакам, кошкам и коровам.
Понятие фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, агенты для нанесения покрытий, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты, придающие изотоничность, замедляющие адсорбцию агенты, адъюванты, средства, стимулирующие иммунную систему, и их комбинации.
В контексте настоящего описания адъюванты могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кэмбридж, шт. Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт. Алабама), эмульсию вода-в-масле, масло-в-воде, эмульсию вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии могут быть, в частности, легкое жидкое парафиновое масло (типа соответствующего Европейской фармакопеи); изопреноидное масло, такое как сквалан или сквален; масло, образующееся при олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, более конкретно растительные масла, этилолеат, пропиленгликоля ди(каприлат/капрат), глицерина три(каприлат/капрат) или пропиленгликоля диолеат; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности эфиры изостеариновой кислоты. Масла применяют в сочетании с эмульгаторами с получением эмульсии. Предпочтительными эмульгаторами являются неионогенные поверхностно-активные вещества, в частности эфиры сорбитана, маннида (например, ангидроманнитолеат), глицерина, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа Pluronic, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D.E.S., изд-во JohnWiley and Sons, NY, 1995, сс. 51-94 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, сс. 564-570). Например, можно применять эмульсию SPT, описанную на с. 147 в Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, под ред. M. Powell и М. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с. 183 в этой же книге. Другие пригодные адъюванты включают (но, не ограничиваясь только ими) адъювантную систему RIBI (фирма Ribi Inc.), блок-сополимер (фирма CytRx, Атланта, шт. Джорджия), SAF-M (фирма Chiron, Эмеривилл, шт. Калифорния), монофосфорил-липид А, адъювант авридин липид-амин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид (но изобретение не ограничено указанными адъювантами). Из сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного применяют сополимеры ЕМА (фирма Monsanto), представляющие собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. Растворение указанных полимеров в воде приводит к получению кислого раствора, который должен быть нейтрализован предпочтительно до физиологического значения рН, для получению раствора адъюванта, в который может быть включена иммуногенная, иммунологическая композиция или композиция вакцины.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, сшитые прежде всего с простыми полиалкениловыми эфирами сахаров или полиспиртов. Такие соединения обозначают как карбомер (Phameuropa, т. 8, № 2, июнь 1996 г.). Специалист в данной области может также почерпнуть из US № 2909462 описание указанных акриловых полимеров, сшитых с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода по меньшей мере в трех гидроксилах замещен ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например винилы, аллилы и другие ненасыщенные группы этиленового ряда. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее пригодными являются продукты, которые продаются под названием CARBOPOL® (фирма BF Goodrich, шт. Огайо, США). Они представляют собой полимеры акриловой кислоты, сшитые с простыми
- 6 032772 полиалкениловыми эфирами или дивинилгликолем или сшитые с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Из них можно отметить CARBOPOL® 974Р, 934Р и 971P. Наиболее предпочтительным является применение CARBOPOL® 971P.
Предпочтительно адъювант добавляют в количестве, составляющем от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.
Итак адъювант можно выбрать из группы, состоящей из гидроксида алюминия, фосфата алюминия, сапонинов, эмульсии вода-в-масле, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле-в- воде, полимеров акриловой или метакриловой кислоты, сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного, адъювантной системы RIBI, блок-сополимера, SAF-M, монофосфорил-липида А, авридин липидамина, термолабильного энтеротоксина из Е. coli (рекомбинантного или иного), холерного токсина, IMS 1314, мурамилдипептида и их комбинаций.
Эмульсия вода-в-масле-в-воде может представлять собой Монтанид ISA207 VG. Монтанид ISA207 VG является адъювантом, который состоит из сложных олеиновых эфиров безводного маннита в растворе неминерального масла и его создают для получения вакцин в виде эмульсий типа вода-в-масле-в-воде. Адъювант Монтанид IS A207 VG хорошо известен специалисту в данной области и его можно применять без дополнительных исследований.
Согласно представленным в описании настоящего изобретения экспериментальным данным антигены микоплазматических бактерий, полученные описанным выше способом, обладают повышенной иммуногенностью по сравнению с антигенами, полученными из микоплазматических бактерий, которые культивировали в бесклеточной системе культивирования.
В контексте настоящего описания понятие повышенная иммуногенность означает, что иммунологический ответ, вызываемый иммуногенной композицией, содержащей представляющий интерес антиген, повышается по сравнению с применяемой в качестве контроля иммуногенной композицией, содержащей такой же антиген, где антиген применяемой в качестве контроля иммуногенной композиции получают из микоплазматических бактерий, культивируемых в бесклеточной системе культивирования.
Понятие повышенный означает, что клеточный и/или гуморальный иммунный ответ повышают по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 75%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% по сравнению с клеточным и/или гуморальным иммунным ответом, вызываемым применяемой в качестве контроля иммуногенной композицией, содержащей такой же антиген, где антиген применяемой в качестве контроля иммуногенной композиции получают из микоплазматических бактерий, культивируемых в бесклеточной системе культивирования. Специалисту в данной области должно быть очевидно, как оценивать клеточный и/или гуморальный иммунный ответ. В частности, такому специалисту в данной области должно быть очевидно, что необходимо либо сравнивать клеточный иммунный ответ представляющей интерес иммуногенной композиции с клеточным ответом контрольной композиции, либо гуморальный иммунный ответ представляющей интерес иммуногенной композиции с гуморальным иммунным ответом контрольной композиции, но не клеточный иммунный ответ представляющей интерес иммуногенной композиции с гуморальным иммунным ответом контрольной композиции и наоборот. Кроме того, клеточный иммунный ответ можно измерять, например, путем оценки активации цитотоксических Т-клеток представляющей/представляющим интерес иммуногенной композицией/антигеном. Гуморальный иммунный ответ можно измерять, например, путем оценки количества антигенспецифических антител, выработавшихся в процессе введения иммуногенной композиции, содержащей указанный антиген, животному. Клеточный и/или гуморальный иммунный ответ можно измерять, например, путем применения мышиной модели, кошачьей модели, созданной на корове модели или созданной на свиньях модели. При этом анализы, описанные в примерах 4 и 5, можно применять в качестве референс-анализов для обнаружения иммунного ответа против М. Hyorhinis и М. Hyopneumoniae.
Понятие такой же (тот же самый) антиген означает что природа антигенов является идентичной. Так, если антиген микоплазм, входящий в иммуногенную композицию, полученную в системе на основе эукариотических клеток с пониженным содержанием сыворотки, представляет собой полный инактивированный бактерин М. Hyorhinis, то понятие такой же антиген означает, что антиген микоплазм, полученный в бесклеточной системе, представляет собой также полный инактивированный бактерин М. Hyorhinis. Кроме того, если антиген микоплазм, входящий в иммуногенную композицию, полученную в системе на основе эукариотических клеток с пониженным содержанием сыворотки, получают или очищают с помощью конкретного метода, то понятие такой же антиген означает, что антиген микоплазм из бесклеточной системы получают или очищают с помощью такого же метода.
Понятие контрольная (референс) иммуногенная композиция относится к иммуногенной компози
- 7 032772 ции, не полученной путем культивирования микоплазматических бактерий в системе на основе эукариотических клеток с пониженным содержанием сыворотки или без свиной сыворотки. Более строго понятие контрольная (референс) иммуногенная композиция относится к иммуногенной композиции, полученной путем культивированная микоплазматических бактерий в бесклеточной системе культивирования, дополненной сывороткой, с использованием такого же антигена. Культивирование микоплазматических бактерий в бесклеточной системе культивирования, дополненной сывороткой, хорошо известно специалисту в данной области. Источник сыворотки и концентрация сыворотки зависит от подлежащих культивированию микоплазматических бактерий и требуемых выходов микоплазматических бактерий. М. Hyorhinis, M. Hyopneumoniae и М. Hyosynoviae, как правило, культивируют в бесклеточной системе культивирования, дополненной 10-20 об.% свиной сыворотки и 5-10 об.% дрожжевого экстракта с получением высоких выходов. Однако, как должно быть очевидно, концентрации сыворотки можно варьировать, дрожжевой экстракт можно не применять и сыворотку можно получать из другого источника, например применять сыворотку плода коровы или т.п.
Понятие компоненты эукариотических клеток включает как цельные клетки, так и фрагменты указанных эукариотических клеток. Понятие фрагмент относится к любым частям эукариотической клетки, таким как части клеточной мембраны или внутриклеточные органеллы, в том числе цельные органеллы или их компоненты. Однако понятие фрагмент относится также к любому компоненту указанной эукариотической клетки, такому как липиды, белки, сахара, ДНК, РНК и т.п., а также их комбинации. Кроме того, компоненты эукариотических клеток и антигена микоплазм в иммуногенной композиции могут либо находиться отдельно друг от друга, либо быть присоединены друг к другу, либо находиться в виде комбинации указанных положений.
Понятие присоединен относится к любому взаимодействию, ассоциации, связыванию, прикреплению или сшиванию указанных компонентов эукариотических клеток с антигеном микоплазм. Таким образом, понятие присоединен включает любые взаимодействия, включая косвенные и прямые, необратимые или обратимые, физические и химические, электростатические и/или ковалентные связи. Так должно быть очевидно, что компоненты эукариотических клеток, например, могут быть связаны с антигеном микоплазм. Однако следует понимать, что компоненты эукариотических клеток могут также быть сшиты с антигеном(ами) микоплазм. Указанное сшивание можно получать несколькими методами, хорошо известными специалисту в данной области, например путем обработки формальдегидом и т.п.
Как правило, когда применяют бактериальный антиген, такой как микоплазматический бактерин, иммуногенная композиция содержит от примерно 103 до примерно 1010 колониестимулирующих единиц (КОЕ) бактериального антигена на дозу, предпочтительно от примерно 104 до примерно 109 КОЕ бактериального антигена на дозу, более предпочтительно от примерно 105 до примерно 106 КОЕ бактериального антигена на дозу. Если в иммуногенной композиции применяют инактивированный бактерин, то величина КОЕ относится к количеству микоплазматических бактерий до инактивации. Например, иммуногенную композицию, которая содержит антигены М. Hyopneumoniae, предпочтительно применяют в количествах, составляющих от примерно 102 до примерно 1010 КОЕ на дозу, предпочтительно от примерно 103 до примерно 109 КОЕ на дозу, еще более предпочтительно в количестве от примерно 104 до примерно 108 КОЕ на дозу, наиболее предпочтительно в количества от примерно 105 до примерно 107 КОЕ на дозу. Иммуногенную композицию, которая содержит антигены М. Hyorhinis, предпочтительно применяют в количествах, составляющих от примерно 102 до примерно 1010 КОЕ на дозу, предпочтительно от примерно 103 до примерно 109 КОЕ на дозу, еще более предпочтительно в количестве от примерно 104 до примерно 108 КОЕ на дозу, наиболее предпочтительно в количества от примерно 105 до примерно 107 КОЕ на дозу. Иммуногенную композицию, которая содержит антигены М. Hyosynoviae, предпочтительно применяют в количествах, составляющих от примерно 102 до примерно 1010 КОЕ на дозу, предпочтительно от примерно 103 до примерно 109 КОЕ на дозу, еще более предпочтительно в количестве от примерно 104 до примерно 108 КОЕ на дозу, наиболее предпочтительно в количествах от примерно 105 до примерно 107 КОЕ на дозу.
Специалисту в данной области должно быть очевидно, что различные стадии процессов, входящих в способы получения иммунногенной композиции, представленной в настоящем описании, можно объединять при воплощении на практике изобретения, представленного в настоящем описании.
Примеры
Приведенные ниже примеры даны только с целью иллюстрации настоящего изобретения. Они не должны рассматриваться, как ограничивающие каким-либо образом объем формулы изобретения.
Пример 1. Культивирование микоплазматических бактерий в MDCK-клетках или McCoy-клетке соответственно.
А. Культивирование М. Hyorhinis, M. Hyosynoviae и М. Hyopneumoniae в МРСК-клетках.
М. Hyorhinis.
Клетки MDCK, выращенные в Т75-колбе(ах) до достижения конфлюэнтности, обрабатывали трипсином и пересевали в 5 Т150-колб (расщепление 1:10), используя среду MEM+5% FBS. Колбы инкубировали при 37°С+5% CO2 до достижения монослоем конфлюэнтности примерно 95-100%. Среду отбрасывали, колбы промывали дважды 1-кратным ЗФР. Затем в каждую колбу добавляли 4-5 мл М. Hyorhinis
- 8 032772 (MOI=10-100). Давали пройти заражению в колбах в одинаковых условиях инкубации в течение периода времени, составляющего не менее 2 ч. После периода заражения в каждую колбу добавляли среду для инфицирования (MEM+2% FBS), предварительно нагретую примерно до 37°С, в количестве, достаточном до достижения объема в каждой колбе 60 мл. Затем колбам давали пройти инкубацию до достижения >90% ЦПД (примерно 3-7 дней). Затем собирали клеточную суспензию из каждой колбы и объединяли (пассаж n). Затем этот продукт использовали для заражения новых колб MDCK-клетками, достигшими 95-100% конфлюэнтности, используя такую же процедуру, что и для предыдущего заражения (пассаж n+1), увеличивая количество колб, применяемых для достижения необходимого соответствующего конечного объема (пассаж n+2, пассаж n+3 и т.д.).
М. Hyosynoviae.
М. Hyosynoviae культивировали также как М. Hyorhinis с несколькими модификациями: среда для инфицирования содержала DMEM+2% FBS+1% раствора аргинина; М. Hyosynoviae, как правило, не характеризовалась ЦПД, поэтому изменение цвета и мутности среды являлись имеющим решающее значение индикатором для пересева с получением следующего пассажа.
М. Hyopneumoniae.
М. Hyopneumoniae культивировали также как М. Hyorhinis. В зависимости от применяемого для заражения штамма ЦПД могло проявляться или отсутствовать. Поэтому изменение цвета и мутности среды можно использовать в качестве индикатора для пересева с получением следующего пассажа.
Б. Условия культивированиям M. Hyorhinis, M. Hyosynoviae и М. Hyopneumoniae в McCoy-клетках.
М. Hyorhinis.
McCoy-клетки выращивали в суспензионных культурах в перемешиваемых колбах в модифицированной среде ЕМЕМ, дополненной 10% FBS. Клетки пересевали в новые колбы так, чтобы конечная концентрация составляла 105-106 клеток/мл. Для М. Hyorhinis 500 мл клеток с концентрацией 105-106 клеток/мл высевали в 3-литровую колбу из расчета 107-108 КОЕ в 1 мл. Затем колбы инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 на магнитной мешалке в течение 3-7 дней. Мониторинг роста микоплазм осуществляли путем визуального определения изменения кислотности (рН) и повышения мутности. Рост микоплазм оценивали также путем анализа БОЕ для определения их количества.
M. Hyosynoviae.
М. Hyosynoviae культивировали таким же образом, как и М. Hyorhinis. 500 мл клеток с концентрацией 105-106 клеток/мл высевали в 3-литровую колбу из расчета 105-107 КОЕ в 1 мл. Затем колбы инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 на магнитной мешалке в течение примерно 2 недель. Для оценки роста определяли как изменение рН, так и повышение мутности в дополнение к анализам БОЕ для оценки количеств.
М. Hyopneumoniae.
М. Hyopneumoniae культивировали таким же образом, как и М. Hyorhinis и М. Hyosynoviae. 500 мл клеток с концентрацией 105-106 клеток/мл высевали в 3-литровую колбу из расчета 105-107 КОЕ в 1 мл. Затем колбы инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 на магнитной мешалке в течение примерно 2 недель. Для оценки роста можно применять как определение изменения рН, так и оценку повышения мутности в дополнение к анализам БОЕ для оценки количества.
В. Культивирование различных видов микоплазм с различными типами сыворотки.
Для решения вопроса о том, можно ли культивировать виды микоплазм с использованием сыворотки от различных видов, MDCK-клетки заражали М. Hyorhinis и культивировали с использованием сыворотки плода коровы, свиной сыворотки, кроличьей сыворотки, куриной сыворотки или лошадиной сыворотки соответственно. Для каждого типа сыворотки культивировали М. Hyorhinis в MDCK-клетках согласно описанному выше методу (т.е. применяли 5% сыворотки для выращивания клеток и 2% сыворотки для заражения). М. Hhyorhinis собирали через 4 дня после заражения согласно стандартному методу. Анализ CCU (единица изменения цвета) осуществляли для определения титра живых М. Hyorhinis. Кроме того, осуществляли q ПИР (количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени) для определения общего содержания генома (gc) M. Hyorhinis. Результаты приведенного в качестве примера эксперимента представлены в табл. 1.
Таблица 1
Культивирование М. Hyorhinis с использованием различных типов сыворотки
Тип сыворотки С|ПЦР log (gc/мкл) CCU50 (log/мл)
Сыворотка плода коровы 6,15 8,00
Свиная сыворотка 6,06 8,50
Кроличья сыворотка 6,11 8,33
Куриная сыворотки 6,31 8,00
Лошадиная сыворотка 6,49 9,00
В табл. 1 продемонстрировано, что титры, измеренные либо с помощью анализа CCU, либо с помощью q ПЦР, оказались сходными при использовании различных типов сыворотки. Кроме того, данные, полученные методом вестерн-блоттинга (не представлены), подтвердили указанный результат. Та
- 9 032772 ким образом, М. Hyorhinis можно культивировать в MDCK-клетках вне зависимости от типа применяемой для культивирования сыворотки.
Пример 2. Приготовление вакцин.
Когда последний пассаж был готов для сбора (наличие >90% ЦПД), осуществляли один цикл замораживания-оттаивания во всех колбах путем выдерживания их в морозильной камере при температуре <-60°С в течение >2 ч, быстрого оттаивания при 37°С, сбора и объединения лизатов и пипетирования вверх и вниз до гомогенизации. Как правило, затем к этой суспензии добавляли 10-20% глицерина и гомогенизировали. Указанную суспензию разделяли на аликвоты рабочего объема. Маточные растворы хранили при температуре <-60°С до употребления.
Требуемые объемы указанных выше маточных растворов инактивировали с помощью 0,2% формалина. Избыток формалина нейтрализовали бисульфитом натрия в момент смешения вакцины. Вакцины смешивали с адъювантом Montanide™ ISA 207 VG или с адъювантом Carbopol®. Вакцины хранили при 2-7°С.
Пример 3. Оценка эффективности вакцин.
Эффективность вакцин оценивали по их способности вызывать гуморальный иммунный ответ (а также по титру, определенному с помощью ELISA) после введения свиньям.
Уход за животными.
Перед началом эксперимента животные имели хорошее состояние здоровье и фон питания. Перед процедурой рандомизации и оценки осуществляли определение состояния здоровья. Во время эксперимента использовали немедицинский корм. Кормовой рацион соответствовал возрасту, состоянию и виду тестируемого животного согласно стандартной процедуре выращивания в производственных условиях. Во время эксперимента животные имели свободный доступ к воде.
Оценка эффективности вакцин на основе М. Hyorhinis и М. Hyopneumoniae после введения свиньям.
М. Hyorhinis.
Нормальным поросятам возрастом 6 недель±5 дней вводили внутримышечно дозу объемом 2 мл (7,1-7,3 log10 CCU/дозу) в день 0 (D0) и вновь в день 21 (D21) вакцины на основе М. Hyorhinis. M. Hyorhinis культивировали в MDCK-клетках согласно описанному выше методу. В вакцину добавляли адъювант Монтанид ISA207VG или CARBOPOL®. В качестве плацебо использовали ЗФР. Общее состояние здоровья поросят оценивали ежедневно. Образцы крови собирали перед вакцинацией в D0 и в дни 7, 14, 21, 28, 35 и 42. Сыворотку тестировали в отношении специфических в отношении М. Hyorhinis антител с помощью непрямого ELISA фирмы BIVI R&D. При применении ELISA фирмы BIVI R&D соотношение S/P >0,200 рассматривали как положительное.
Как продемонстрировано в табл. 2, по данным ELISA M. Hyorhinis вызывала сильный гуморальный иммунный ответ. 6/6 (100%) животных, вакцинированных М. Hyorhinis-MDCK+Монтанид ISA207VG оказались позитивными через 2 недели после обработки первой дозой (D14). Все животные оставались позитивными вплоть до D42, при этом повышение титров обнаружено после применения второй дозы (D28). У животных, вакцинированных М. Hyorhinis-MDCK+Carbopol®, также обнаружен гуморальный иммунный ответ.
Таблица 2
Полученные с помощью ELISA результаты для М. Hyorhinis
До вакцинации D0 D7 D14 D21 D28 D35 D42
М. hyorhinis MDCK + Монтанид ISA207VG 0,00 0,003 0,043 0,972 1,123 1,340 1,152 1,133
М. hyorhinis MDCK + CARBOPOL® 0,002 0,018 0,059 0,095 0,122 0,354 0,375 0,409
Плацебо (ЗФР) 0,001 0,005 0,011 0,015 0,021 0,031 0,057 0,070
Аналогичные результаты, касающиеся гуморального иммунного ответа после вакцинации, получали при культивировании M. Hyorhinis в McCoy-клетках (данные не представлены). Аналогичные результаты получали после однодозовой обработки (данные не представлены).
М. Hyopneumoniae.
Всем нормальным поросятам возрастом 6 недель±5 дней вводили внутримышечно дозу объемом 2 мл (8,0-8,5 log10 CCU/дозу) в D0 и вновь в D21 вакцину на основе М. Hyopneumoniae. В вакцину добавляли адъювант Монтанид ISA207VG. В качестве плацебо использовали ЗФР. Общее состояние здоровья поросят оценивали ежедневно. Образцы крови собирали перед вакцинацией в D0 и в дни 7, 14, 21, 28, 35 и 42 для тестирования в отношении присутствия антител к М. Hyopneumoniae. В одном из примеров применяли поступающий в продажу набор для ELISA фирмы IDEXX. При применении ELISA фирмы IDEXX соотношение S/P >0,400 рассматривали как положительное.
Как продемонстрировано в табл. 3, по данным ELISA M. Hyopneumoniae вызывал сильный гуморальный иммунный ответ. Из вакцинированных М. Hyopneumoniae MDCK+ISA207 животных 3/6 (50%)
- 10 032772 оказались позитивными в D14 и 5/6 (83,3%) в D21, а 6/6 (100%) оказались позитивными в D28, 35 и 42. Таблица 3
Полученные с помощью ELISA фирмы IDEXX результаты для М. Hyopneumoniae
До вакцинации D0 D7 D14 D21 D28 D35 D42
М. hyopneumoniae MDCK +Монтанид ISA207VG -0,024 -0,022 0,034 0,601 0,949 1,775 1,986 1,895
Плацебо (ЗФР) -0,019 0,011 -0,021 -0,015 -0,025 -0,025 0,016 0,016
Аналогичные результаты получали после однодозовой обработки (данные не представлены). Пример 4.
Эффективность вакцин, полученных из микоплазматических бактерий, которые культивировали в линии эукариотических клеток, в сравнении с вакцинами, полученными из микоплазматических бактерий, которые культивировали в бесклеточной системе 54 животных линии CD/CD возрастом 8 недель±5 дней, разделяли на 6 групп. Каждую из групп V1 и V2 обрабатывали инактивированным изолятом М. Hyorhinis, который культивировали в MDCK-клетках и среде СМ (комплексная среда, например среда на основе протеозного пептона, содержащая свиную сыворотку и дрожжевой экстракт, или среда Фриза) соответственно; группу V3 и V4 обрабатывали инактивированным изолятом М. Hyorhinis, который культивировали в MDCK-среде и СМ соответственно. Во все вакцины в качестве адъюванта добавляли Монтанид ISA207VG; доза и путь соответствовали схеме 2x2 мл, дозы вводили путем внутримышечной инъекции одной дозы в D0, a второй дозы в D21. Группу СС (контрольная группа) обрабатывали плацебо без антигена (ЗФР) согласно такой же схеме. Группу SC (строгий контроль) не обрабатывали в течение эксперимента, эти животные служили в качестве строгого контроля. В D42, 43 и 44 свиней в группах V1-V4 и СС подвергали контрольному заражению вирулентным изолятом М. Hyorhinis. Доза и путь соответствовали схеме: 40 мл внутрибрюшинно, 15 мл внутривенно и 15 мл интраназально соответственно. Образцы крови собирали еженедельно, начиная с D0 и до окончания эксперимента (D58) для тестирования с помощью специфического для М. Hyorhinis ELISA. При применении ELISA фирмы R&D соотношение S/P>0,200 рассматривали как положительное. В приведенном в качестве примера эксперименте, результаты которого представлены в табл. 4, все свиньи в SC-группе оставались негативными в течение эксперимента, что свидетельствовало об отсутствии экспозиции М. Hyorhinis. Группы V I-V4 и СС были негативными в D0 и D7. Однако серологические результаты варьировались в значительной степени между вакцинами на основе СМ и на основе MDCK. По сравнению с вакцинами на основе СМ для вакцин на основе MDCK обнаружено более раннее начало сероконверсии, большее количество серопозитивных свиней и более высокие серологические титры.
Таблица 4 Полученные с помощью ELISA результаты для М. Hyorhinis
М. hyorhinis, ELISA, средние соотношения S/Р в группе
Группа D0 D7 D14 D21 D28 D35 D42 D49 D58
MHRN001- MDCK (VI) -0,002 0,010 0,199 0,482 0,916 0,971 0,929 1,056 0,991
MHRN001- СМ (V2) 0,001 0,009 0,031 0,081 0,395 0,401 0,370 0,793 0,770
MHRN002- MDCK (V3) 0,004 0,014 0,157 0,424 0,981 1,023 0,953 1,097 1,086
MHRN002- СМ (V4) 0,003 0,011 0,017 0,047 0,298 0,299 0,263 0,704 0,608
Плацебо (СС) 0,004 0,004 0,009 0,023 0,021 0,029 0,031 0,262 0,433
Строгий контроль (SC) -0,003 -0,002 -0,003 0,005 0,008 0,015 0,021 0,031 0,060
Кроме того, осуществляли эксперименты по титрованию для сравнения вакцин, полученных с помощью клеточных культур, с вакцинами на основе микоплазматических бактерий, культивируемых в бесклеточной системе.
М. Hyorhinis культивировали в McCoy-клетках согласно описанному выше методу или культивировали в СМ (комплексная среда) соответственно.
Приготавливали вакцины с антигеном, полученным с использованием McCoy, применяя неразведенный антиген (полный), антиген, разведенный в соотношении 1:10, и антиген, разведенный в соотношении 1:100, все смешанные в соотношении 1:1 с применяемым в качестве адъюванта Монтанидом ISA207VG. Аналогичным образом приготавливали вакцины с использованием полученного в СМ антигена.
Свиней (возраст в момент вакцинации составлял 3 недели) вакцинировали, используя одну дозу объемом 2 мл, которую вводили IM в день 0.
Как продемонстрировано в табл. 5, перед контрольным заражением (D0-D21) все группы в среднем рассматривались как негативные, хотя в группе McCoy+ISA полный (антиген) и McCoy+ISA 1:10 обнаружены ответы, имеющие тенденцию к позитивности. Через 1 неделю после контрольного заражения (D28) обнаружен ответ во всех вакцинированных группах, кроме группы СМ+ISA 1:100.
- 11 032772
Из табл. 5 очевидно, что для каждого типа антигена (McCoy, CM) обнаружен стандартный титрационный эффект (полный>1:10>1:100). Кроме того, в табл. 5 продемонстрировано, что животные из группы McCoy+ISA полный и McCoy+ISA 1:10 имели более высокие средние баллы по сравнению с группой, обработанной СМ+ ISA полный, и эта особенность сохранялась до окончания опыта в D42. Группы с позитивными (S/P>0,200) средними значениями после контрольного заражения представляли собой группы МсСоу+полный и МсСоу+1:10. При применении вакцин МсСоу+полный и МсСоу+1:10 получен более высокий серологический ответ по сравнению с вакциной СМ+полный как до контрольного заражения, так и после контрольного заражения. Кроме того, у животных, вакцинированных МсСоу+1:100, также обнаружен ответ, отличающийся от ответа в обработанной плацебо (невакцинированной) группе и группе СМ+1:100 (ответ в группе, обработанной СМ+1:100, или его отсутствие оказались эквивалентными с ответом у невакцинированных животных). Эксперименты по титрованию продемонстрировали, что вакцины на основе клеточных культур обеспечивали лучшие серологические результаты по сравнению с вакцинами из микоплазматических бактерий, культивируемых в бесклеточной системе.
Т аблица 5 Полученные с помощью ELISA результаты для М. Hyorhinis
М. hyorhinis, ELISA, средние соотношения S/Р в группе
Группа DO D7 D14 D21 D28 D35 D42
McCoy + ISA «полный» 0,002 0,012 0,032 0,117 0,312 0,298 0,325
McCoy + ISA 1:10 0,000 0,005 0,065 0,107 0,291 0,193 0,221
McCoy + ISA 1:100 0,001 0,001 -0,001 0,000 0,145 0,118 0,150
CM + ISA «полный» 0,002 0,009 0,011 0,034 0,190 0,163 0,190
CM + ISA 1:10 -0,001 0,017 0,003 0,014 0,114 0,132 0,176
CM + ISA 1:100 -0,002 0,000 -0,002 0,001 0,019 0,043 0,093
Плацебо: ЗФР + ISA -0,001 0,002 -0,002 -0,002 0,021 0,039 0,081
Строгий контроль -0,002 -0,001 -0,002 -0,002 -0,002 0,008 0,024
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (6)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта, включающий:
    а) культивирование микоплазматических бактерий в культуральной среде, содержащей клеточную линию MDCK или клеточную линию McCoy и до 10% сыворотки;
    б) получение инактивированного бактерина;
    в) добавление фармацевтически приемлемого носителя, где указанные микоплазматические бактерии выбирают из М. Hyopneumoniae, M. Hyorhinis и М. Hyosynoviae.
  2. 2. Способ по п.1, в котором сыворотка не содержит свиную сыворотку.
  3. 3. Способ по пп.1 и 2, в котором инактивированный бактерин представляет собой инактивированный формалином бактерин.
  4. 4. Способ по одному из пп.1 и 2, в котором указанный субъект представляет собой свинью, корову, кошку или собаку.
  5. 5. Способ по одному из пп.1-4, в котором указанный фармацевтически приемлемый носитель представляет собой эмульсию вода-в-масле-в воде или карбомер.
  6. 6. Способ по одному из пп.1-5, в котором указанную иммуногенную композицию приготавливают в виде формы для однодозового введения.
    О Евразийская патентная организация, ЕАПВ
    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA201500701A 2012-12-28 2013-12-20 Способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта EA032772B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261746997P 2012-12-28 2012-12-28
PCT/US2013/076807 WO2014105672A1 (en) 2012-12-28 2013-12-20 Method of making a mycoplasma vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201500701A1 EA201500701A1 (ru) 2015-12-30
EA032772B1 true EA032772B1 (ru) 2019-07-31

Family

ID=49917778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500701A EA032772B1 (ru) 2012-12-28 2013-12-20 Способ получения иммуногенной композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики вызываемых микоплазмами инфекций у субъекта

Country Status (23)

Country Link
US (2) US9273281B2 (ru)
EP (1) EP2938747B1 (ru)
JP (2) JP6122146B2 (ru)
KR (1) KR102153275B1 (ru)
CN (2) CN104968365B (ru)
AR (1) AR094648A1 (ru)
AU (1) AU2013370983B2 (ru)
BR (1) BR112015012711B1 (ru)
CA (1) CA2896298C (ru)
CL (1) CL2015001562A1 (ru)
DK (1) DK2938747T3 (ru)
EA (1) EA032772B1 (ru)
ES (1) ES2738100T3 (ru)
HU (1) HUE045015T2 (ru)
MX (1) MX361273B (ru)
MY (1) MY173223A (ru)
PH (1) PH12015501333A1 (ru)
PL (1) PL2938747T3 (ru)
PT (1) PT2938747T (ru)
SG (2) SG11201505089YA (ru)
TW (2) TWI618542B (ru)
UA (1) UA121193C2 (ru)
WO (1) WO2014105672A1 (ru)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8546149B2 (en) 2010-08-27 2013-10-01 Intervet Inc. Potency test for vaccine formulations
EP2938356B1 (en) * 2012-12-28 2020-05-13 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens
CN104968365B (zh) * 2012-12-28 2018-04-03 勃林格殷格翰动物保健有限公司 支原体疫苗的制备方法
CN105441368B (zh) * 2016-01-19 2019-01-01 福清市默克兽医院 一株牛支原体及其应用
WO2017132578A1 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Advanced Animal Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting mycoplasma exposure
EP3778626A1 (en) * 2016-08-09 2021-02-17 Agricultural Technology Research Institute Composition for preventing and treating mycoplasma hyorhinis infection, and method for producing said composition
EP3576799A4 (en) * 2017-02-03 2020-12-30 The Administrators of The Tulane Educational Fund OPHTHALMIC COMPOSITIONS FOR THERAPY AND PROPHYLAXIS
CN110650989B (zh) 2017-05-24 2023-03-31 三菱化学株式会社 成型材料、及纤维增强复合材料
MX2021015170A (es) 2019-06-10 2022-03-22 Elanco Us Inc Formulaciones de medios de micoplasma.
CN113201050B (zh) * 2020-08-06 2022-07-22 青岛诺安百特生物技术有限公司 一种金黄色葡萄球菌噬菌体穿孔素及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1074920A (en) * 1965-04-21 1967-07-05 Pfizer & Co C Growth medium for mycoplasma pneumoniae and vaccine production
GB1137306A (en) * 1966-07-11 1968-12-18 Research Corp Inoculum for poultry
EP1260581A1 (en) * 2000-03-03 2002-11-27 Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Cell usable in serum-free culture and suspension culture and process for producing virus for vaccine by using the cell
EP1862537A1 (en) * 2005-03-10 2007-12-05 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
JPS5540568B2 (ru) 1972-10-05 1980-10-18
US5338543A (en) 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
US5885823A (en) 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
JP3402304B2 (ja) * 2000-03-30 2003-05-06 株式会社微生物化学研究所 猫クラミジアワクチンの製造方法
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY129765A (en) 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
CA2452666A1 (en) 2001-07-02 2003-01-16 Pfizer Products Inc. Mycoplasma hyopneumoniae vaccine and methods for reducing mycoplasma bovis pneumonia in cattle
US20030147914A1 (en) 2001-07-02 2003-08-07 Pfizer Inc. Mycoplasma bovis vaccine and methods of reducing pneumonia in animals
ATE412426T2 (de) 2001-07-02 2008-11-15 Pfizer Prod Inc Vakzination in einer dosis mit i mycoplasma hyopneumoniae /i
PL368826A1 (en) 2001-08-28 2005-04-04 Pfizer Products Inc. Mycoplasma bovis challenge model, methods for administering m. bovis and methods for inducing pneumonic lung lesions
TWI238721B (en) * 2003-06-20 2005-09-01 Animal Technology Inst Taiwan Swine enzootic vaccine, its producing method and usage
WO2006084364A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Magna International Inc. Method of manufacturing a semi-structural panel
WO2007042827A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Ivan Petyaev Treatment and diagnosis of obligate intracellular pathogens
EP2615167A1 (en) 2006-09-15 2013-07-17 MedImmune, LLC Method for eliminating DNA contaminants from viral preparations
US20090068231A1 (en) 2007-09-11 2009-03-12 Wyeth Live attenuated mycoplasma strains
AR069087A1 (es) 2007-10-29 2009-12-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Cepa bacteriana de m. bovis atenuada avirulenta obtenida por pases, vacuna de micoplasma boris y metodos de uso de la misma
MX2010005014A (es) 2007-11-06 2010-06-30 Wyeth Llc Vacuna viva avirulenta de mycoplasma hyopneumoniae con adyuvante.
US20090317423A1 (en) 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8444989B1 (en) 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
WO2009142086A1 (ja) 2008-05-23 2009-11-26 学校法人久留米大学 マイコプラズマ感染症用ワクチン組成物
DK2310046T3 (da) 2008-06-27 2016-04-25 Zoetis Services Llc Hidtil ukendte adjuvanssammensætninger
WO2010051210A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of various antigens including antigens from mycoplasma bovis in multivalent vaccine composition
MX2011012362A (es) 2009-05-19 2012-04-19 Bioproperties Pty Ltd Cepa de vacuna de mycoplasma hyopneumoniae sensible a la temperatura y usoz de la misma.
US20110150770A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent vaccine against porcine teschovirus and other disease causing organisms in swine
US8112663B2 (en) 2010-03-26 2012-02-07 Lsi Corporation Method to establish redundancy and fault tolerance better than RAID level 6 without using parity
CN102258776B (zh) 2011-07-07 2013-07-10 普莱柯生物工程股份有限公司 猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗及其制备方法
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
EP2938356B1 (en) 2012-12-28 2020-05-13 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens
CN104968365B (zh) 2012-12-28 2018-04-03 勃林格殷格翰动物保健有限公司 支原体疫苗的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1074920A (en) * 1965-04-21 1967-07-05 Pfizer & Co C Growth medium for mycoplasma pneumoniae and vaccine production
GB1137306A (en) * 1966-07-11 1968-12-18 Research Corp Inoculum for poultry
EP1260581A1 (en) * 2000-03-03 2002-11-27 Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Cell usable in serum-free culture and suspension culture and process for producing virus for vaccine by using the cell
EP1862537A1 (en) * 2005-03-10 2007-12-05 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. V. VOLOKHOV, H. KONG, J. GEORGE, C. ANDERSON, V. E. CHIZHIKOV: "Biological Enrichment of Mycoplasma Agents by Cocultivation with Permissive Cell Cultures", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 74, no. 17, 1 September 2008 (2008-09-01), pages 5383 - 5391, XP055105261, ISSN: 00992240, DOI: 10.1128/AEM.00720-08 *
GAUSH C R, HARD W L, SMITH T F: "CHARACTERIZATION OF AN ESTABLISHED LINE OF CANINE KIDNEY CELLS (MDCK)", PROCEEDINGS OF THE SOCIETY FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, SAGE PUBLICATIONS LTD., GB, vol. 122, no. 03, 1 July 1966 (1966-07-01), GB, pages 931 - 935, XP009052852, ISSN: 0037-9727 *
MOCHIZUKI, M.: "Growth characteristics of canine pathogenic viruses in MDCK cells cultured in RPMI 1640 medium without animal protein", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 24, no. 11, 10 March 2006 (2006-03-10), AMSTERDAM, NL, pages 1744 - 1748, XP028011217, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.07.114 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2896298A1 (en) 2014-07-03
MX361273B (es) 2018-12-03
KR102153275B1 (ko) 2020-09-09
ES2738100T3 (es) 2020-01-20
EP2938747B1 (en) 2019-05-01
BR112015012711A2 (pt) 2017-07-11
TWI660736B (zh) 2019-06-01
US10512680B2 (en) 2019-12-24
PL2938747T3 (pl) 2019-11-29
JP6449364B2 (ja) 2019-01-09
MX2015007730A (es) 2015-09-07
PT2938747T (pt) 2019-08-01
US20160136254A1 (en) 2016-05-19
BR112015012711B1 (pt) 2022-08-16
EA201500701A1 (ru) 2015-12-30
US9273281B2 (en) 2016-03-01
US20140186394A1 (en) 2014-07-03
PH12015501333A1 (en) 2015-09-02
HUE045015T2 (hu) 2019-11-28
AU2013370983B2 (en) 2019-09-26
UA121193C2 (uk) 2020-04-27
CL2015001562A1 (es) 2016-06-24
CN104968365A (zh) 2015-10-07
SG11201505089YA (en) 2015-07-30
CA2896298C (en) 2024-01-16
CN104968365B (zh) 2018-04-03
DK2938747T3 (da) 2019-08-05
KR20150100920A (ko) 2015-09-02
WO2014105672A1 (en) 2014-07-03
EP2938747A1 (en) 2015-11-04
CN108379571A (zh) 2018-08-10
TW201832777A (zh) 2018-09-16
TWI618542B (zh) 2018-03-21
TW201438732A (zh) 2014-10-16
JP6122146B2 (ja) 2017-04-26
AU2013370983A1 (en) 2015-05-21
JP2017145253A (ja) 2017-08-24
JP2016508983A (ja) 2016-03-24
MY173223A (en) 2020-01-07
SG10201708028VA (en) 2017-10-30
AR094648A1 (es) 2015-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6449364B2 (ja) マイコプラズマワクチン作製方法
US10758602B2 (en) Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM