WO2009142086A1 - マイコプラズマ感染症用ワクチン組成物 - Google Patents

マイコプラズマ感染症用ワクチン組成物 Download PDF

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WO2009142086A1
WO2009142086A1 PCT/JP2009/057935 JP2009057935W WO2009142086A1 WO 2009142086 A1 WO2009142086 A1 WO 2009142086A1 JP 2009057935 W JP2009057935 W JP 2009057935W WO 2009142086 A1 WO2009142086 A1 WO 2009142086A1
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剛一 桑野
隆 清水
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学校法人久留米大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition for mycoplasma infection and a preventive or therapeutic agent for mycoplasma infection.
  • Mycoplasma pneumoniae is a causative bacterium of Mycoplasma pneumonia.
  • the causative bacteria induce various host immune responses including cytokines after adhering to bronchial epithelial cells, but the mechanism is not clear.
  • the bacterium is a small pathogen with a diameter of about 125 to 153 nm and a virus level, but unlike a virus, it does not require live cells to grow (obligate ectoparasite), and some antibiotics. Since the substance was effective, it was classified as a bacterium in some periods, but recently it has been classified into another class.
  • Mycoplasma bacteria do not have the cell walls that are characteristic of bacteria.
  • ⁇ -Lactam antibiotics penicillin, cephem, etc.
  • Effective antibiotics are protein synthesis inhibitors, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, or new quinolone antibiotics that suppress DNA replication.
  • TLR Toll Like Receptor
  • Non-Patent Document 2 a subunit b of F 0 F type 1 ATPase derived from Mycoplasma pneumoniae, has a transcription factor NF- ⁇ B dependent on TLR1, TLR2, and TLR6. It was reported that it was activated (see Non-Patent Document 3), and a patent application (Patent Document 1) was filed.
  • the lipoprotein can contribute to the elucidation of the host response in mycoplasma infection and the pathogenesis of mycoplasma pneumonia, and the progress of research on transcription induction involving NF- ⁇ B via TLR. Therefore, a vaccine composition comprising this can prevent, treat or alleviate the symptoms of mycoplasma infections for which there has been no effective preventive or ameliorating means. Expected.
  • the present inventors also aimed to maximize and optimize the effect of subunit b (lipoprotein) of F 0 F 1 type ATPase, which is a fraction component derived from Mycoplasma pneumoniae cells. Part of the protein was synthesized, and the obtained lipopeptides were found to exhibit an activity equal to or higher than that of the original lipoprotein, and a patent application was filed (see Patent Document 2).
  • These lipopeptides can also be safe and effective preventive, therapeutic or alleviating drugs against mycoplasma infection as vaccine preparations like the above lipoproteins. However, these lipoproteins and synthetic lipopeptides are still insufficient in terms of producing effective antibodies.
  • An object of the present invention is to provide a safer and more effective vaccine composition and the like against mycoplasma infections that currently lack effective preventive measures. Moreover, it is providing the preventive agent or therapeutic agent with respect to mycoplasma infection. In addition, it is an object of the present invention to provide a diagnostic agent for mycoplasma infection, a test method for mycoplasma pneumoniae, and the like.
  • the present inventors have found the maximum effect of subunit b (lipoprotein) of F 0 F type 1 ATPase, which is a fraction component derived from Mycoplasma pneumoniae cells found in Non-Patent Document 3 and Patent Document 1 described above.
  • subunit b lipoprotein
  • F 0 F type 1 ATPase a fraction component derived from Mycoplasma pneumoniae cells found in Non-Patent Document 3 and Patent Document 1 described above.
  • the synthetic lipopeptides found in Patent Document 2 for the purpose of optimization and optimization, the entire amino acid sequence of the lipoprotein was examined and its activity was investigated. The site was estimated. Furthermore, in view of the lack of sufficient activity in the above-mentioned lipoproteins and synthetic lipopeptides, they have intensively studied their structural problems.
  • oligopeptides composed of about 20 amino acids selected from a special part of the amino acid sequence that the lipoprotein constitutes have the lipoprotein or the FAM-20 described above. It has been found that it exhibits marked activity compared to the synthesized lipopeptides. In addition, it has been found that the antibodies produced from these oligopeptides show significantly higher antibody activity than the antibodies produced from the above-described lipoproteins and synthetic lipopeptides. As a result, the present inventors have found that the novel oligopeptides can be safe, highly active and effective vaccines / preventive drugs against mycoplasma pneumonia as vaccine preparations, and are further produced from these oligopeptides. The present inventors have found that antibodies can be a therapeutic / relieving drug for mycoplasma pneumonia and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following: [1] (1) A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (2) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (3) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, (4) In the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and (5) in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 4, one or two amino acid residues are substituted, deleted or deleted Mycoplasma infectious disease comprising at least one peptide selected from the group consisting of a peptide having an added amino acid sequence and an immunogenicity equivalent to the peptide before mutation, and a pharmaceutically acceptable carrier Vaccine composition; [2] The composition according to [1], further comprising an adjuvant; [3] A prophylactic or therapeutic agent for mycoplasma infection, comprising as an active ingredient an antibody that recognizes at least one of the peptides according to [1]; [4] The agent according to [
  • the peptide of the present invention which is an active ingredient of the vaccine composition of the present invention, was selected by examining and optimizing the active site of lipoprotein derived from Mycoplasma pneumoniae. Therefore, the vaccine composition of the present invention comprising the peptide of the present invention can be a safe, highly active and effective vaccine formulation against mycoplasma infection. According to the vaccine composition of the present invention, it becomes possible to prevent and treat mycoplasma infections for which there has been no effective preventive and ameliorating means, and to reduce the symptoms.
  • the antibody produced by using the peptide of the present invention as an epitope is contained as an active ingredient, mycoplasma infection can be effectively prevented or treated.
  • the antibody of the present invention can detect causative bacteria of mycoplasma infection. Therefore, by using the antibody, it can be diagnosed whether or not the patient suffers from mycoplasma infection, and a method for detecting the causative agent of mycoplasma infection can also be provided.
  • FIG. 1 shows that F 0 F type 1 ATPase subunit b (21 kDa) present in Mycoplasma pneumoniae (Mp) and LAMPs was detected by Western blot using anti-FAM123 serum.
  • FIG. 2 shows that anti-FAM123 serum suppresses the production of TNF- ⁇ by LAMPs and F 0 F type 1 ATPase subunit b (21 kDa) extracted from the gel.
  • the vertical axis represents the production amount of TNF- ⁇
  • the horizontal axis “cont” represents the control mouse peritoneal cells without addition
  • “+” represents the addition of anti-FAM123 serum
  • “ ⁇ ” the addition of anti-FAM123 serum. Indicates no.
  • FIG. 1 shows that F 0 F type 1 ATPase subunit b (21 kDa) present in Mycoplasma pneumoniae (Mp) and LAMPs was detected by Western blot using anti-FAM123 serum.
  • FIG. 2 shows that anti
  • FIG. 3 is a diagram showing the detection result of subunit b of F 0 F type 1 ATPase derived from Mycoplasma pneumoniae by sandwich ELISA using anti-FAM123 serum and anti-FAM162 serum.
  • Control represents PBS (phosphate buffered saline).
  • Mycoplasma pneumoniae is a causative bacterium of human mycoplasma infection (especially Mycoplasma pneumonia), not only a strain isolated and identified so far, As long as it is involved in the development of mycoplasma infection, all these bacteria are included.
  • the mycoplasma may be an antibiotic resistant strain.
  • the peptide of the present invention which is an active ingredient of the vaccine composition of the present invention, (1) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (3) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (4) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; and (5) one or two amino acid residues in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4 are substituted, deleted or deleted A mutated peptide consisting of an added amino acid sequence, the peptide having immunogenicity equivalent to the peptide before mutation; At least one peptide selected from the group consisting of
  • peptides (1) and (2) were newly selected by examining in detail the amino acid sequence of subunit b of F 0 F type 1 ATPase, a lipoprotein derived from Mycoplasma pneumoniae cells. It is a peptide consisting of an amino acid sequence.
  • the peptides (3) and (4) above were newly selected by examining the amino acid sequences of N-ALP-1 and N-ALP-2, which are other lipoproteins derived from Mycoplasma pneumoniae cells, respectively. It is a peptide consisting of an amino acid sequence.
  • a variant peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 (preferably 1 or 2) amino acid residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • “having equivalent immunogenicity” means that an antibody obtained by immunization with a mutant peptide recognizes the same substance as an antibody obtained by immunization with a peptide before mutation, that is, This means that an antibody capable of recognizing a peptide before mutation can be induced even when a mutant peptide is used as an immunogen.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are substituted, deleted or added in “(1) peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1” (hereinafter referred to as “mutation of peptide (1)”) Peptide ”) is described in J. Org. Biol. Chem. , Vol. 273 (3), no. 38, pp. As long as it can induce an antibody that recognizes a lipoprotein called FAM described in 24792-24796 (1998) and WO 2007/049805, it is included in the peptide of the present invention.
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are substituted, deleted or added in “(2) peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” (hereinafter referred to as “mutation of peptide (2)” Peptide ”) is described in J. Org. Biol. Chem. , Vol. 273 (3), no. 38, pp. As long as it can induce an antibody that recognizes a lipoprotein called FAM described in 24792-24796 (1998) and WO 2007/049805, it is included in the peptide of the present invention.
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are substituted, deleted or added in “(3) peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3” (hereinafter referred to as “mutation of peptide (3)”
  • mutation of peptide (3) As long as it can induce an antibody recognizing a lipoprotein called N-ALP-1 described in Immunology 121: 473-4833, 2007 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-024619, the present invention Of peptides.
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are substituted, deleted or added in “(4) peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4” (hereinafter referred to as “mutation of peptide (4)”)
  • mutation of peptide (4) As long as it can induce an antibody that recognizes a lipoprotein called N-ALP-2 described in Immunology 121: 473-4833, 2007 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-024619, the present invention Of peptides.
  • the peptide of the present invention is (1) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (2) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (3) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (4) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; A mutant peptide of peptide (1); A mutant peptide of peptide (2); It means at least one peptide selected from the group consisting of a mutant peptide of peptide (3); and a mutant peptide of peptide (4).
  • amino acid residue substitution examples include conservative amino acid substitution.
  • Conservative amino acid substitution refers to substitution of a specific amino acid with an amino acid having a side chain having the same properties as the side chain of the amino acid. Specifically, in a conservative amino acid substitution, a particular amino acid is replaced with another amino acid belonging to the same group as the amino acid.
  • Groups of amino acids having side chains of similar nature are known in the art. For example, such amino acid groups include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having neutral side chains.
  • the amino acid having a neutral side chain further includes an amino acid having a polar side chain (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), and an amino acid having a nonpolar side chain (for example, alanine, Valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan).
  • an amino acid having a polar side chain for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • an amino acid having a nonpolar side chain for example, alanine, Valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan.
  • amino acids having aromatic side chains for example, phenylalanine, tryptophan, tyrosine
  • amino acids having side chains including hydroxyl groups for example, alcoholic hydroxyl groups, phenolic hydroxyl groups) (for example, serine, threonine, Tyrosine).
  • Examples of the “deletion of amino acid residue” include selecting and deleting an arbitrary amino acid residue from the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO.
  • “Addition of amino acid residue” includes adding, for example, an amino acid residue consisting of Leu, Leu-Trp, or Leu-Trp-Val to the C-terminal side of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. It is done. In order to enhance the water solubility of the peptide, one or two residues of arginine (Arg) or lysine (Lys), which are basic amino acids, may be added to the C-terminal side of the amino acid sequence.
  • Arg arginine
  • Lys lysine
  • These amino acids include L-form, D-form and DL-form, but usually L-form is preferred.
  • These peptides can be synthesized by a normal peptide synthesis method and used in the present invention, but the production method, synthesis method, procurement method, and the like are not particularly limited in the present invention.
  • the peptide of the present invention can be easily synthesized by those skilled in the art by using a normal peptide synthesizer.
  • the vaccine composition of the present invention may contain only one selected from the above peptides, but may contain two or more peptides as appropriate.
  • the vaccine composition of the present invention containing various types of peptides as antigens can elicit acquired immunity against mycoplasma infection in various inoculation subjects.
  • the vaccine composition of the present invention is a lipoprotein which is a subunit b of F 0 F type 1 ATPase derived from Mycoplasma pneumoniae described in International Publication No. 2007/049805, JP 2008-024619 A, and the like.
  • it may contain a lipopeptide represented by FAM-20.
  • a carrier that is usually used for the production of a vaccine can be used without limitation.
  • Specific examples include saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, isotonic aqueous buffers, and combinations thereof.
  • the carrier is preferably sterilized.
  • an emulsifier, a preservative (eg, thimerosal), an isotonic agent, a pH adjuster, an inactivating agent (eg, formalin) and the like are appropriately blended therein.
  • composition of the present invention preferably has a form suitable for the mode of administration of the vaccine.
  • injectable form examples include solutions, suspensions and emulsions.
  • composition of the present invention preferably further contains an adjuvant that is pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient.
  • adjuvants are generally substances that non-specifically enhance the host immune response, and a number of different adjuvants are known in the art. Examples of adjuvants include, but are not limited to, aluminum hydroxide, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L- Alanyl-D-isoglutamine (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl Oxy) -ethylamine (MTP-PE), Quill A (registered trademark), lysolecithin, saponin derivatives, pluronic polyol, Montanide
  • the vaccine composition of the present invention can be produced by a conventional method using the peptide of the present invention as an active ingredient together with the carrier and preferably an adjuvant.
  • the peptide as the active ingredient may be contained in the vaccine composition of the present invention in an amount of 0.001 to 99.999% by weight.
  • the ratio of active ingredients in the vaccine composition is not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose. .
  • the vaccine composition of the present invention can prevent mycoplasma infection by inoculation by various routes.
  • administration routes include, but are not limited to, intradermal, subcutaneous, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, and oral routes.
  • the subject to which the vaccine composition of the present invention is administered is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a human.
  • the dosage is determined in consideration of the age, sex, body weight, drug tolerability, etc. of the subject, but usually 0.001 mg to 1,000 mg can be administered once or twice or more.
  • the administration is preferably performed a plurality of times, and in this case, administration is preferably performed at intervals of 2 to 4 weeks.
  • the present invention also provides a kit comprising one or more containers including one or more components of the vaccine composition of the present invention. Also by using the kit of the present invention, mycoplasma infection can be prevented, or its symptoms can be treated or alleviated.
  • antibodies of the present invention natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, chimeric mice that can be produced using transgenic mice and gene recombination techniques, humanized and single chain antibodies, and human antibody production genes are introduced.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that recognizes at least one of the peptides of the present invention, but is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of specificity to Mycoplasma pneumoniae.
  • the antibody of the present invention is preferably a humanized antibody or a human antibody.
  • the above antibody fragment means a partial region of the above-described antibody, specifically, for example, an antibody fragment containing F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fc region, Fv (variable fragment of antibody), sFv, dsFv (disulphide stabilized Fv), dAb (single domain antibody), etc. (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, p. 441-456, 1996).
  • the above-mentioned humanized antibody refers to an antibody produced using a gene recombination technique in which only the antigen recognition site is derived from a non-human gene and the remaining site is derived from a human gene.
  • the above human antibody refers to a human antibody produced by a transgenic mouse into which a human antibody-producing gene has been introduced (eg, TransChromo Mouse (trademark)), human B lymphocyte mRNA, genome-derived VH gene and VL gene, An antibody produced from a library constructed by randomly combining the antibodies, based on a human antibody library in which an antibody variable region is expressed by a display technique such as a phage display method.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and the antibody of the present invention includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification of the antibody and the like.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be produced by a method known per se. That is, for example, an immunogen (such as a peptide of the present invention) is optionally combined with Freund's Adjuvant, in the case of mammals such as polyclonal antibodies, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, cat, dog Immunize mice, rats, hamsters, guinea pigs, goats, horses or rabbits, preferably pigs, goats, horses or cows.
  • mice, rats, hamsters, etc. are immunized by the same method.
  • the peptide of the present invention can be used as an immunogen as it is, but it is desirable to immunize as a complex with a polymer compound having a molecular weight of 10,000 or more. Therefore, when used as an immunogen, the peptide of the present invention may be a complex with a polymer compound (eg, protein (hereinafter sometimes referred to as carrier protein)) by a method known per se.
  • a polymer compound eg, protein (hereinafter sometimes referred to as carrier protein)
  • a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was synthesized according to the method described above, and bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin (RSA), ovalbumin (OVA), squash hemocyanin (KLH), A complex with a carrier protein such as thyroglobulin (TG) or immunoglobulin is formed.
  • BSA bovine serum albumin
  • RSA rabbit serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • KLH squash hemocyanin
  • a complex with a carrier protein such as thyroglobulin (TG) or immunoglobulin
  • TG thyroglobulin
  • immunoglobulin A complex with a carrier protein such as thyroglobulin (TG) or immunoglobulin is formed.
  • the complex can then be used as a preferred immunogen.
  • a complex with mussel hemocyanin is preferably used as the complex.
  • 1 to 2 preferably 1 amino acid can be added to the peptide of the present invention.
  • the position of the added amino acid may be any position of the peptide and is not particularly limited, but the N-terminal or C-terminal of the peptide is preferable.
  • a cysteine residue can be introduced into the peptide of the present invention and bound to the amino group of the polymer compound (carrier protein) via the SH group that is the side chain of the cysteine (MBS method).
  • amino groups such as ⁇ -amino group and ⁇ -amino group of lysine residues of proteins can be bonded to each other (glutaraldehyde method).
  • the polyclonal antibody can be produced as follows. That is, the immunogen is 1 to 3 in the mouse, rat, hamster, guinea pig, goat, horse or rabbit, preferably goat, horse or rabbit, more preferably rabbit subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a food pad or intraperitoneally. Immunization is given by several injections. Usually, immunization is performed 1 to 5 times about every 1 to 14 days from the initial immunization, and serum is obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the final immunization.
  • serum itself can be used as a polyclonal antibody, ultrafiltration, ammonium sulfate fractionation, Euglobulin precipitation method, caproic acid method, caprylic acid method, ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.), anti-immunoglobulin column
  • affinity column chromatography using a protein A / G column, a column with a cross-linked immunogen, or the like.
  • Examples of methods for producing monoclonal antibodies include the following methods. First, a hybridoma is prepared from the antibody-producing cell obtained from the immunized animal and a myeloma cell (myeloma cell) having no autoantibody-producing ability, and the hybridoma is cloned. That is, using a culture supernatant of a hybridoma as a specimen, a monoclonal antibody that exhibits specific affinity for the peptide of the present invention used for immunization of mammals and does not cross-react with a carrier protein is produced by immunological techniques. Select a clone. Next, the antibody can be produced from the hybridoma culture supernatant and the like by a method known per se.
  • a monoclonal antibody can be produced as follows. That is, the immunogen can be administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously in mice, rats or hamsters (including transgenic animals created to produce antibodies from other animals such as human antibody-producing transgenic mice). Immunization is carried out by injection or transplantation into the food pad or peritoneal cavity one to several times. Usually, immunization is carried out 1 to 4 times about every 1 to 14 days from the initial immunization, and antibody-producing cells are obtained from the spleen of the mammal immunized about 1 to 5 days after the final immunization.
  • a hybridoma (fusion cell) secreting a monoclonal antibody can be prepared according to the method of Köhler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, p. 495-497, 1975) and a modification method according thereto. That is, antibody-producing cells contained in the spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., preferably from the spleen obtained from the immunized mammal as described above, and preferably mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit or human
  • a hybridoma is obtained by cell fusion with a myeloma cell having no autoantibody-producing ability derived from a mammal such as mouse, rat or human.
  • myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8.653 (653; ATCC No. CRL1580), P3 / NSI / 1-Ag4-1 (NS-1), P3 / X63-Ag8 .
  • human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 or CEM-T15 examples of myeloma cells used for cell fusion.
  • the obtained hybridomas are cultured in, for example, a microtiter plate, and the culture supernatants of wells in which proliferation has been observed are against the peptides of the present invention used in the aforementioned immunization.
  • the reactivity and the reactivity of the supernatant to the carrier protein can be measured by, for example, an immunoassay method such as ELISA and compared.
  • the hybridomas cloned by screening are cultured using a medium (for example, DMEM containing 10% fetal calf serum). And the centrifugation supernatant of the culture solution can be used as a monoclonal antibody solution.
  • a medium for example, DMEM containing 10% fetal calf serum
  • the centrifugation supernatant of the culture solution can be used as a monoclonal antibody solution.
  • ascites can be generated in the animal, and the ascites obtained from the animal can be used as a monoclonal antibody solution.
  • the monoclonal antibody is preferably isolated and / or purified in the same manner as the polyclonal antibody described above.
  • Chimeric antibodies are described in, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988”, Japanese Examined Patent Publication No. 3-73280, etc., and humanized antibodies are described in, for example, Japanese Patent Publication No. 4-506458.
  • human antibodies include, for example, “Nature Genetics, Vol. 15, p.146-156, 1997”, “Nature Genetics, Vol. 7, p.13-21, 1994”.
  • Japanese translation of PCT publication No. 4-504365 pamphlet of International Publication No. WO94 / 25585, “Nikkei Science, June, 40 to 50, 1995”, “Nature, Vol. 368, pp. 856-859”.
  • 1994 ", JP-A-6-500263, etc., respectively.
  • Antibody production by phage display can be performed, for example, by collecting and concentrating phage having affinity for an antigen by biopanning from a phage library prepared for human antibody screening. Can be easily obtained. In this case, it is preferable to screen an antibody library using a peptide having at least 5 consecutive amino acids selected from peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 as an antigen.
  • a peptide having at least 5 consecutive amino acids selected from peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 as an antigen.
  • the antibody can be prepared using the antibody fragment obtained by this, or using the DNA of the phage.
  • the peptide of the present invention was obtained by examining and optimizing the active site of the lipoprotein constituting Mycoplasma pneumoniae which is a causative bacterium of Mycoplasma infection. Therefore, since the antibody of the present invention can recognize components of Mycoplasma pneumoniae, the acquired immune mechanism of the living body, for example: (1) Predation (opsonization) by immune cells such as NK cells and macrophages, (2) complement activation (effector action), (3) Neutralizing action of bacteria, (4) Antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) The effect of eliminating the bacteria is expected by such actions. This makes it possible to prevent (prevent) or treat a mycoplasma infection.
  • prevention or treatment of mycoplasma infection refers not only to symptoms caused by infection with Mycoplasma pneumoniae, such as pneumonia (mycoplasma pneumonia (sometimes referred to as atypical pneumonia)), but also, for example, pharyngitis, bronchitis , Prevention, treatment or reduction of complications such as otitis media, encephalitis, hepatitis, pancreatitis, hemolytic anemia, myocarditis, Guillain-Barre syndrome, Stevens-Johnson syndrome. These symptoms can be remedied by eliminating Mycoplasma pneumoniae from the living body.
  • the antibody contained in the preventive or therapeutic agent of the present invention as an active ingredient is as described above.
  • the antibodies of the present invention include LAMPs derived from Mycoplasma pneumoniae and TNF (Tumor Necrosis Factor) - ⁇ by F 0 F type 1 ATPase subunit b (21 kDa). Production of inflammatory cytokines can also be suppressed.
  • An agent comprising the antibody of the present invention as an active ingredient is expected to prevent / treat mycoplasma infection also by suppressing the production of TNF- ⁇ .
  • the compounding amount of the antibody contained in the preventive or therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as the above effects are exhibited, but usually 0.001 to 90% by weight of the entire preventive or therapeutic agent of the present invention. It is preferably 0.005 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 10% by weight.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody as an active ingredient.
  • a carrier usually used in the pharmaceutical field can be used.
  • excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, calcium phosphate, calcium carbonate, sodium benzoate, sulfite Preservatives such as sodium hydrogen, methylparaben, propylparaben, stabilizers such as citric acid, sodium citrate, acetic acid, suspensions such as methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, water, physiological Examples thereof include, but are not limited to, diluents such as saline and base waxes such as glycerin and polyethylene glycol. Therefore, the preventive or therapeutic agent of the present invention is also a pharmaceutical composition for preventing, treating or alleviating mycoplasma infection.
  • Examples of the dosage form of the preventive or therapeutic agent of the present invention include, but are not limited to, liquids and injection preparations.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention may be a controlled-release preparation such as an immediate-release preparation or a sustained-release preparation. Since an antibody is generally soluble in an aqueous solvent, it can be easily absorbed regardless of the dosage form. Furthermore, the solubility of the antibody can be increased by a method known per se.
  • the method for producing the preventive or therapeutic agent of the present invention will be described.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention that can be used for the prevention, treatment or alleviation of mycoplasma infection can be produced by using the antibody as an active ingredient according to a method known per se as a pharmaceutical production method. .
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention suitable for systemic administration can be produced by dissolving an effective amount of the antibody of the present invention in an aqueous or non-aqueous isotonic sterile injection solution (eg, injection preparation). it can.
  • the antibody of the present invention may be produced by lyophilizing (eg, lyophilized preparation) and dissolving it in an aqueous or non-aqueous isotonic sterile diluent.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention suitable for local administration can be produced by dissolving the antibody of the present invention in a diluent such as water or physiological saline (eg, liquid).
  • the liquid can also be used by inhalation therapy to the bronchi or lungs using a nebulizer.
  • These agents may contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents and the like.
  • These preventive or therapeutic agents of the present invention can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
  • the dose of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be appropriately determined depending on the activity, type or combination amount of the antibody contained as an active ingredient, administration subject, administration route, age and weight of the administration subject, etc.
  • the dose per day (body weight 60 kg) (effective dose) is 0.1 mg to 1000 mg, preferably 0.1 mg to 500 mg, more preferably 0.1 mg to 300 mg as the amount of antibody.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be administered once or divided into several times per day as necessary, or can be administered in several days.
  • agent X a known antibiotic agent effective for Mycoplasma pneumoniae.
  • Agent X inhibits the protein synthesis of Mycoplasma pneumoniae such as macrolide antibiotics (disulomac, ricamycin, erythrosine, claris, etc.), tetracycline antibiotics (minomycin, etc.), lincomycin antibiotics (dalasin, etc.)
  • Drugs that suppress DNA replication of Mycoplasma pneumoniae such as preparations containing substances as active ingredients, neuroquinone antibiotics (Aquatim, etc.), and the like. These may use together only 1 type and may use multiple types together.
  • “combination” means that the prophylactic or therapeutic agent of the present invention and the agent X are used in combination, and the use form is not particularly limited.
  • it includes administration as a pharmaceutical composition containing both the preventive or therapeutic agent of the present invention and the agent X, or separate formulation without mixing and administration at the same time or with a time difference.
  • the subject of administration of the preventive or therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, and includes any animal that holds or may hold Mycoplasma pneumoniae, including humans, dogs, cats, monkeys, horses, cows, and mice. Mammals such as rats and hamsters are preferred.
  • the present invention provides a method for detecting Mycoplasma pneumoniae, which comprises using the antibody of the present invention.
  • the present invention also provides a method for detecting a mycoplasma infection characterized by using the antibody of the present invention.
  • the sample to be detected may be any sample as long as there is a possibility that Mycoplasma pneumoniae is present in the sample.
  • a method for detecting and / or quantifying Mycoplasma pneumoniae by antigen-antibody reaction using the antibody of the present invention can be mentioned.
  • the method is not particularly limited, but isotope immunoassay (RIA method), enzyme immunoassay (eg, ELISA method), fluorescence or luminescence assay method, agglutination method, immunoblot method, immunochromatography method (Meth. Enzymol., 92, p. 147-523 (1983), Antibodies Vol. II, IRL Press Oxford (1989)) and the like.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for mycoplasma infection comprising the antibody of the present invention. Specifically, for example, by collecting a pharyngeal wiping fluid or sputum of a subject (eg, human) and applying it to the diagnostic agent as a sample and detecting the mycoplasma pneumoniae using the same method as the above detection method, Whether or not the specimen is infected with a mycoplasma infection can be diagnosed.
  • the diagnosis is conventionally used for diagnosis of mycoplasma pneumonia, (1) diagnosis by PCR method, (2) diagnosis by chest X-ray, (3) diagnosis by mycoplasma isolation culture, (4) serum diagnosis, etc. May be.
  • the present invention provides a method for preventing or treating mycoplasma infection, comprising the step of administering an effective amount of the antibody of the present invention to a subject in need thereof.
  • the onset of mycoplasma infection can be prevented by administering the antibody of the present invention to a mycoplasma pneumoniae carrier who has not developed mycoplasma infection based on the above acquired immune mechanism of the living body.
  • the symptoms of the present invention can be alleviated and treated by administering the antibody of the present invention to a patient who has developed a mycoplasma infection.
  • the administration method and effective amount are as described above.
  • Example 1 Synthesis of Peptide A peptide represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as peptide (1)) was synthesized using an automated synthesizer (model 433A; Applied Biosystems) according to the 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) method. . Wang-PHB resin loaded with Fmoc-resin protected by tert-butoxycarbonyl was used as a solid phase support. 0.1 mM amino acid was used for each binding. The protecting groups for the side chains of the amino acids used are shown below. Serine (tert-butyl), lysine (tert-butoxy-carbonyl) and the like.
  • Fmoc-amino acid bound to the resin (resin) was performed using piperidine.
  • 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyllium tetrafluoroborate and hydroxybenzotriazole (HOBt) were used.
  • a peptide consisting of about 20 amino acids bound to the resin and Fmoc-Dhc (Pam2) -OH (Dhc: (2,3-dihydroxypropyloyl) -L-Cysteine) was bound in dimethylformamide / dichloromethane (1: 2). The reaction was carried out for 12 hours.
  • Example 2 Preparation of antibody against peptide
  • An antibody (anti-FAM123 polyclonal antibody) against peptide (1) of the present invention was prepared as follows. First, RQEIEKEKRILIQEQSLKE (SEQ ID NO: 1) derived from the above-mentioned Mycoplasma pneumoniae F 0 F type 1 ATPase subunit b was synthesized (linker C added to the N-terminus), and then KLH (carrier) was linked to the N-terminus. I let you.
  • an antigen-specific antibody (anti-FAM123 serum) was obtained by rough purification using affinity chromatography (HiTrap NHS-activated HP column: GE Healthcare).
  • An antibody against the peptide shown in SEQ ID NO: 2 was prepared in the same manner (anti-FAM162 serum) using peptide (2) DKAFIEFIRELEAEDDDHD with linker C added to the N-terminus.
  • Antibodies against the peptides shown in SEQ ID NOs: 3 to 4 are also prepared in the same manner.
  • Example 3 Measurement of TNF- ⁇ Inhibitory Activity of Antibody The neutralizing activity of the antibody was evaluated by inhibiting TNF- ⁇ produced from mouse peritoneal cells.
  • OK432 (1 unit, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) was injected into the abdominal cavity of C57BL mice. After 48 hours, exudate cells were collected from the peritoneal cavity. Next, pretreatment of stimulants and antibodies will be described.
  • TNF- ⁇ production stimulants LAMPs derived from Mycoplasma pneumoniae (TX-114 soluble fraction) and LAMPs as “21 kDa” were developed by SDS-PAGE. Next, a gel around 21 kDa was cut out to prepare a lipoprotein extracted.
  • Example 2 These and the anti-FAM123 serum obtained in Example 2 (final concentration 40 ⁇ g / ml) were preincubated for 1 hour. Next, 3 ⁇ 10 5 mouse peritoneal exudate cells were added and further cultured for 5 hours. The culture supernatant was collected, and TNF- ⁇ in the supernatant was quantified with an ELISA kit (R & D Systems). As a result, as shown in FIG. 2, the anti-FAM123 serum suppressed TNF- ⁇ production by the LAMPs fraction derived from Mycoplasma pneumoniae to about 71%, and TNF- ⁇ production by the 21 kDa extract was about 28%. Suppressed until. Thus, the activity of the antibody of the present invention was remarkably recognized.
  • Example 4 Detection of lipoprotein antigen by ELISA Anti-FAM123 serum prepared in Example 2 was used as a capture antibody. Further, anti-FAM162 serum prepared in Example 2 was used as a detection antibody.
  • antigens live and heat-inactivated bacteria of Mycoplasma pneumoniae and heat-inactivated bacteria of Mycoplasma penetran were used. These various antigens were prepared as follows. Mycoplasma pneumoniae M129 (ATCC 29432) was cultured for 48-72 hours at 37 ° C. in a flask containing modified Hayflick medium supplemented with 20% horse serum. 10 ml of the culture solution was collected and centrifuged at 4 ° C. and 6000 ⁇ g for 10 minutes to collect the pellet.
  • the collected pellet was suspended in PBS (phosphate buffered saline) to obtain “raw Mp”. Furthermore, heat treatment was performed at 60 ° C. for 30 minutes to obtain “inactivated Mp”. Raw M. p and inactivated M. p. For each p, TX-114 (Sigma) was added to 0.01% to obtain “raw M.p + TX114” and “inactivated M.p + MX114”, respectively. Further, as a control, Mycoplasma penetrans were cultured in the same manner as Mycoplasma pneumoniae, and viable bacteria were collected and prepared by adding TX-114 to 0.01% (“M. penetrans + TX114”).
  • TX114 0.01% TX-114 only
  • PBS phosphate buffered saline
  • control PBS only
  • the capture antibody 0.5 ⁇ g / ml was dispensed in an amount of 100 ⁇ l (PBS (phosphate buffered saline)) per well of a 96-well microplate (Nunc) for ELISA, and incubated overnight at room temperature. On the next day, the plate was washed three times with a washing buffer (T-PBS (PBS supplemented with 0.5% Tween 20)). Next, blocking buffer (Blocking One, Nacalai Tesque) was added at 100 ⁇ l / well and incubated at room temperature for 1 hour. Wash 3 times with wash buffer as before.
  • Example 2 As for Mycoplasma pneumoniae inactivated by heat, it was found that addition of 0.01% TX114 enhances the antigen detection sensitivity (inactivated Mp + TX114). On the other hand, even when 0.01% TX114 was added to heat-inactivated Mycoplasma penetrans, no antigen could be detected (M. penetrans + TX114). Therefore, the antibody produced in Example 2 can specifically detect Mycoplasma pneumoniae and can be used for diagnosis of mycoplasma infection.
  • a composition comprising a peptide consisting of a specific amino acid sequence composed of about 20 amino acids derived from lipoprotein which is subunit b of F 0 F type 1 ATPase derived from Mycoplasma pneumoniae is a vaccine for Mycoplasma infection Useful as a composition.
  • An agent comprising an antibody that recognizes at least one peptide of the present invention as an active ingredient is useful as a prophylactic or therapeutic agent for mycoplasma infection, and the antibody can be used for detection of mycoplasma pneumoniae or mycoplasma. It can be used for diagnosis of infectious diseases.

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Abstract

　本発明は、現在有効な予防手段がないマイコプラズマ肺炎に対し、安全かつ有効なワクチンの開発に資する抗原および当該抗原を用いるワクチンなどを提供する。 　具体的には、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するリポプロテインから設計されるペプチド、当該ペプチドおよび医薬として許容され得る担体を含有するワクチン組成物、ならびに当該ペプチドをエピトープとして認識する抗体を有効成分として含有するマイコプラズマ感染症の予防または治療剤などを提供する。

Description

マイコプラズマ感染症用ワクチン組成物
　本発明は、マイコプラズマ感染症用ワクチン組成物、及びマイコプラズマ感染症の予防または治療剤などに関する。
　マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、マイコプラズマ肺炎の起因菌である。この起因菌は、気管支上皮細胞に付着した後、サイトカインをはじめ、様々な宿主免疫応答を誘導するが、その機序は明らかになっていない。当該菌は、直径１２５～１５３ｎｍ程度でウィルス程度の小さな病原体であるが、増殖するためにはウィルスとは異なり生きた細胞を必要とせず（偏性細胞外寄生菌）、また、一部の抗生物質が有効だったことから、細菌に分類されていた時期もあるが、最近では別の綱に分類されている。
　マイコプラズマ属の菌は、細菌の特徴である細胞壁を持っていない。細菌感染症治療の第一選択として使われるβ－ラクタム系の抗生物質（ペニシリン系、セフェム系など）は細菌の細胞壁を障害して菌を殺す作用を持つが、細胞壁を持たないマイコプラズマには無効である。有効な抗生物質は、タンパク合成阻害剤のマクロライド系抗生剤やテトラサイクリン系抗生物質、またはＤＮＡ複製を抑制するニューキノロン系抗生物質である。
　臨床の現場では、臨床症状から判断してマイコプラズマ感染症が疑われた場合、マクロライドなどのタンパク質合成阻害剤が処方されている。しかし、これら抗生物質の多用により、抗生物質抵抗性のマイコプラズマ・ニューモニエの出現が報告されている。本症の治療において、早期診断・早期治療をすることが病状の遷延化や流行を防止するために必要とされるが、診断が確定するまでの日数がかかる場合が多い。近年、細菌性肺炎が激減した中で、肺炎全体に占めるマイコプラズマ肺炎の比率は高まっている。
　一方、非特許文献１に記載されているように、トールライクレセプター（Ｔｏｌｌ　Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ））と呼ばれる受容体ファミリーが細菌の様々な菌体成分を認識し、最終的に転写因子であるＮＦ－κＢを活性化することにより自然免疫を誘導することが報告されている。
　本発明者らは、既にマイコプラズマ・ニューモニエ由来のＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂであるリポプロテイン（非特許文献２参照）が、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６依存的に転写因子ＮＦ－κＢを活性化させることを報告し（非特許文献３参照）、特許出願（特許文献１）を行った。
　前記リポプロテインは、マイコプラズマ感染における宿主応答およびマイコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、ＴＬＲを介してＮＦ－κＢが関与する転写誘導の研究の進展に寄与することができる。したがってこれを含有してなるワクチン組成物は、従来有効な予防手段や改善手段が存在していなかったマイコプラズマ感染症を予防すること、治療することまたはその症状を軽減することを可能とすることが期待されている。
　また本発明者らは、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体由来の分画成分であるＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂ（リポプロテイン）の効果の最大化、最適化を図ることを目的として当該リポプロテインの一部を合成し、得られたリポペプチド類がもともとのリポプロテインと同等以上の活性を示すことを見出し、特許出願した（特許文献２参照）。これらのリポペプチド類も上記リポプロテインと同様にワクチン製剤としてマイコプラズマ感染症に対し、安全かつ有効な予防、治療または軽減薬となり得る。しかしながら、これらリポプロテインや合成リポペプチド類は、有効な抗体を産生させるという点ではいまだ不十分なものであった。
国際公開２００６／１２６７１９号パンフレット 国際公開２００７／０４９８０５号パンフレット
Ａｋｉｒａ，Ｓ．＆Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４９９－５１１（２００４） Ｇｅｏｒｇｅ　Ｐｙｒｏｗｏｌａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ，Ｔｈｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｂ　ｏｆ　Ｆ０Ｆ１－ｔｙｐｅ　ＡＴＰａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ｉｓ　ａ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７３（３），Ｎｏ．３８，Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１８，ｐｐ．２４７９２－２４７９６（１９９８） Ｔａｋａｓｈｉ　Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙｕｔａｋａ　Ｋｉｄａ　ａｎｄ　Ｋｏｉｃｈｉ　Ｋｕｗａｎｏ，Ａ　Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｅｄ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ＮＦ－κＢ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ＴＬＲ１，ＴＬＲ２　ａｎｄ　ＴＬＲ６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７５：４６４１－４６４６（２００５）
　本発明の目的は、現在有効な予防手段がないマイコプラズマ感染症に対する、さらに安全かつ有効なワクチン組成物等を提供することである。
　また、マイコプラズマ感染症に対する予防剤または治療剤を提供することである。
　加えて、マイコプラズマ感染症の診断薬、マイコプラズマ・ニューモニエの検査方法などを提供することなども本発明の目的である。
　本発明者らは、上記した非特許文献３および特許文献１において見出したマイコプラズマ・ニューモニエ菌体由来の分画成分であるＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂ（リポプロテイン）の効果の最大化、最適化を目的として、更には上記特許文献２にて見出した合成リポペプチド類と比較して更なる高性能化を図ることを目的として、当該リポプロテインの全アミノ酸配列を検討しその活性部位を推定した。さらに上記リポプロテインや、合成リポペプチドにおいて十分な活性がみとめられないことを鑑み、その構造的な問題等について鋭意検討した。その結果、驚くべきことに、上記リポプロテインが構成するアミノ酸配列の特殊な部分から選択された、アミノ酸の数が２０前後から構成されるオリゴペプチド類が当該リポプロテインや、上記したＦＡＭ－２０を含む合成されたリポペプチドに比較して格段の活性を示すことを見出した。加えて、これらのオリゴペプチド類から産生された抗体類は、上記したリポプロテインや合成リポペプチド類から産生される抗体類に比較して格段に高い抗体の活性を示すことを見出した。その結果、本発明者らは、当該新規オリゴペプチド類がワクチン製剤としてマイコプラズマ肺炎に対し、安全・高活性かつ有効なワクチン・予防薬となり得ることを見出し、更には、これらオリゴペプチドから産生される抗体類が、マイコプラズマ肺炎の治療薬・軽減薬となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下のものを提供する：
［１］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（５）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または２個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、変異前のペプチドと同等の免疫原性を有するペプチド
からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドならびに医薬として許容されうる担体を含有するマイコプラズマ感染症用ワクチン組成物；
［２］アジュバントをさらに含有する、［１］に記載の組成物；
［３］［１］記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を有効成分として含有してなる、マイコプラズマ感染症の予防または治療剤；
［４］ＴＮＦ－αの産生を抑制する、［３］に記載の剤；
［５］マイコプラズマ感染症の予防または治療剤を製造するための、［１］記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体の使用；
［６］［１］記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を含有してなる、マイコプラズマ感染症の診断薬；
［７］［１］記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を用いることを特徴とする、マイコプラズマ・ニューモニエの検出方法；
［８］［１］記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を用いることを特徴とする、マイコプラズマ感染症の検出方法；
［９］［１］記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、マイコプラズマ感染症の予防または治療方法；
［１０］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（５）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または２個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、変異前のペプチドと同等の免疫原性を有するペプチド
からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドならびに医薬として許容されうる担体を含有するワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、マイコプラズマ感染症の予防方法。
　本発明のワクチン組成物の有効成分である本発明のペプチドは、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のリポプロテインの活性部位を検討し、最適化することにより選択されたものである。従って本発明のペプチドを含有してなる本発明のワクチン組成物は、マイコプラズマ感染症に対する安全・高活性かつ有効なワクチン製剤となり得る。そして本発明のワクチン組成物によれば、従来有効な予防および改善手段が存在していなかたマイコプラズマ感染症を予防、治療することが可能となり、またその症状を軽減することが可能となる。
　本発明の予防または治療剤によれば、本発明のペプチドをエピトープとして産生した抗体を有効成分として含有するので、マイコプラズマ感染症を有効に予防または治療することができる。
　本発明の抗体はマイコプラズマ感染症の原因菌を検出することができる。よって当該抗体を用いることで、患者がマイコプラズマ感染症に羅患しているか否かを診断することができるし、マイコプラズマ感染症の起因菌を検出する方法を提供することもできる。
図１は、抗ＦＡＭ１２３血清を用いたウエスタンブロットによってマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．ｐ）およびＬＡＭＰｓに存在するＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼ・サブユニットｂ（２１ｋＤａ）を検出したことを示す図である。 図２は、抗ＦＡＭ１２３血清が、ＬＡＭＰｓ、およびゲルから抽出したＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼ・サブユニットｂ（２１ｋＤａ）によるＴＮＦ－αの産生を抑制することを示す図である。縦軸はＴＮＦ－αの産生量を、横軸の「ｃｏｎｔ」は無添加対照のマウス腹腔細胞を、「＋」は抗ＦＡＭ１２３血清を添加したことを、「－」は抗ＦＡＭ１２３血清を添加しなかったことを示す。 図３は、抗ＦＡＭ１２３血清および抗ＦＡＭ１６２血清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂの検出結果を示す図である。コントロールは、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を示す。
　本発明において、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とは、ヒトマイコプラズマ感染症（特にマイコプラズマ肺炎）の起因菌であり、現在までに単離・同定された菌株ばかりでなく、現在未同定であってもマイコプラズマ感染症の発症に関与する限り、これらすべての菌を包含するものである。当該マイコプラズマは、抗生物質耐性菌株であってもよい。
　本発明のワクチン組成物の有効成分である本発明のペプチドとは、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；および
（５）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または２個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、変異前のペプチドと同等の免疫原性を有するペプチド；
からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドである。
　上記ペプチドのうち、（１）および（２）のペプチドは、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体由来のリポプロテインであるＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂのアミノ酸配列を詳細に検討して新たに選択されたアミノ酸配列からなるペプチドである。上記（３）および（４）のペプチドは、それぞれ、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体由来の別のリポプロテインであるＮ－ＡＬＰ－１およびＮ－ＡＬＰ－２のアミノ酸配列を詳細に検討して新たに選択されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
　配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１～３個（好ましくは１または２個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであっても、変異前のペプチドと同等の免疫原性を有する限り本発明のペプチドに含まれる。
　ここで「同等の免疫原性を有する」とは、変異ペプチドで免疫して得られた抗体が、変異前のペプチドで免疫して得られた抗体と同じ物質を認識することをいい、すなわち、免疫原として変異ペプチドを用いた場合であっても、変異前のペプチドを認識できる抗体を誘導できることを意味する。
　具体的には、
「（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」の１～３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ペプチド（１）の変異ペプチド」という）は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７３（３），Ｎｏ．３８，ｐｐ．２４７９２－２４７９６（１９９８）および国際公開２００７／０４９８０５号パンフレットに記載のＦＡＭと称されるリポプロテインを認識する抗体を誘導することができる限り、本発明のペプチドに含まれる。
　「（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」の１～３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ペプチド（２）の変異ペプチド」という）は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７３（３），Ｎｏ．３８，ｐｐ．２４７９２－２４７９６（１９９８）および国際公開２００７／０４９８０５号パンフレットに記載のＦＡＭと称されるリポプロテインを認識する抗体を誘導することができる限り、本発明のペプチドに含まれる。
　「（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」の１～３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ペプチド（３）の変異ペプチド」という）は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２１：４７３－４８３，２００７および特開２００８－０２４６１９号公報に記載のＮ－ＡＬＰ－１と称されるリポプロテインを認識する抗体を誘導することができる限り、本発明のペプチドに含まれる。
　「（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」の１～３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ペプチド（４）の変異ペプチド」という）は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２１：４７３－４８３，２００７および特開２００８－０２４６１９号公報に記載のＮ－ＡＬＰ－２と称されるリポプロテインを認識する抗体を誘導することができる限り、本発明のペプチドに含まれる。
　従って本発明のペプチドとは、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
ペプチド（１）の変異ペプチド；
ペプチド（２）の変異ペプチド；
ペプチド（３）の変異ペプチド；および
ペプチド（４）の変異ペプチド
からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドを意味する。
　「アミノ酸残基の置換」としては、例えば保存的アミノ酸置換があげられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）があげられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）などもあげることができる。
　「アミノ酸残基の欠失」としては、例えば各配列番号で表されるアミノ酸配列の中から、任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることがあげられる。
　「アミノ酸残基の付加」としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列のＣ末端側に、例えば、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｔｒｐ、またはＬｅｕ－Ｔｒｐ－Ｖａｌからなるアミノ酸残基を付加させることがあげられる。また、ペプチドの水溶解性を増強するため、アミノ酸配列のＣ末端側に塩基性アミノ酸であるアルギニン（Ａｒｇ）またはリジン（Ｌｙｓ）を１ないし２残基付加してもよい。
　これらアミノ酸はＬ体、Ｄ体およびＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体であることが好ましい。これらのペプチドは、通常のペプチド合成法によって合成され本発明に供することが出来るが、本発明においては製造方法・合成方法、調達方法等については、特に限定されない。
　本発明のペプチドは、通常のペプチド合成装置を用いることにより、当業者であれば容易に合成することができる。
　本発明のワクチン組成物は、上記のペプチドの中から任意の１種のみを選択して含有してもよいが、２種以上のペプチドを適宜選択して含有してもよい。抗原として多種類のペプチドを含有する本発明のワクチン組成物は、様々な接種対象者においてマイコプラズマ感染症に対する獲得免疫を惹起させることが可能である。
　さらに本発明のワクチン組成物は、国際公開２００７／０４９８０５号パンフレット、特開２００８－０２４６１９号公報などに記載のマイコプラズマ・ニューモニエ由来のＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂであるリポプロテインおよび／またはＦＡＭ－２０に代表されるリポペプチドを含有していてもよい。
　前記医薬として許容され得る担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができる。具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。担体は、好ましくは滅菌されたものである。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
　本発明の組成物は、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液があげられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態があげられる。
　本発明の組成物は、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有することが好ましい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｑｕｉｌｌ　Ａ（登録商標）、リゾレシチン、サポニン誘導体、プルロニックポリオール、モンタニドＩＳＡ－５０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂａｙｏｌ（登録商標）およびＭａｒｋｏｌ（登録商標）。
　本発明のワクチン組成物は、本発明のペプチドを有効成分として、前記担体および好ましくはアジュバントとともに常法により製造することができる。当該有効成分としてのペプチドは、本発明のワクチン組成物中に０．００１～９９．９９９重量％含有されていればよい。また本発明のペプチドや上記リポプロテイン等を有効成分として２種以上含有する場合、ワクチン組成物中における有効成分同士の割合は特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜決定することができる。
　本発明のワクチン組成物は、様々な経路により接種することによってマイコプラズマ感染症を予防することができる。投与経路としては、例えば、皮内、皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、および経口経路等があげられるが、これらに限定されない。また本発明のワクチン組成物を投与する対象としては特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
　投与量は、対象の年齢、性別、体重、薬物への忍容性等を考慮して決められるが、通常０．００１ｍｇ～１，０００ｍｇを１回または２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、２～４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。
　また本発明は、本発明のワクチン組成物の１または２以上の成分を包含する、１または２以上の容器からなるキットを提供する。本発明のキットを用いることによっても、マイコプラズマ感染症を予防することができ、またはその症状を治療もしくは軽減することができる。
　本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、トランスジェニックマウスや遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体、ヒト抗体産生遺伝子を導入したマウスやファージディスプレイなどによって作製したヒト抗体ならびにこれらの断片などが含まれる。本発明の抗体は、それぞれ本発明のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体である限り特に限定されないが、マイコプラズマ・ニューモニエに対する特異性の点からモノクローナル抗体であることが好ましい。あるいはヒトへの臨床応用の点から、本発明の抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であることが好ましい。
　上記抗体断片とは、前述した抗体の一部分の領域を意味し、具体的には、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｃ領域を含む抗体断片、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ　Ｆｖ）、ｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）等が挙げられる（Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐ．４４１－４５６，１９９６）。
　上記ヒト化抗体とは、抗原認識部位のみヒト以外の遺伝子を由来とし、かつ残りの部位をヒト遺伝子由来として、遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体のことをいう。また上記ヒト抗体とは、ヒト抗体産生遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（例、ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ　Ｍｏｕｓｅ（商標））が産生するヒト抗体や、ヒトのＢリンパ球のｍＲＮＡやゲノム由来のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とをランダムに組み合わせて構築したライブラリーから、ファージディスプレイ法などのディスプレイ技術によって抗体可変領域を発現させたヒト抗体ライブラリーを基に作製した抗体のことをいう。
　また抗体のクラスも特に限定されず、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭであり、抗体の精製の容易性等を考慮すると、より好ましくはＩｇＧである。
　次に、抗体の製造方法について説明する。
　ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、自体公知の方法によって製造することができる。すなわち、例えば免疫原（本発明のペプチドなど）を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシなど、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに免疫する。モノクローナル抗体の場合は、同様の方法で、マウス、ラット、ハムスターなどに免疫する。
　本発明のペプチドは、そのまま免疫原として用いることも可能であるが、分子量１万以上の高分子化合物との複合体として免疫することが望ましい。従って、本発明のペプチドは、免疫原として使用するとき、自体公知の方法により高分子化合物（例、タンパク質（以下、キャリアタンパク質と記載する場合がある）など）との複合体としてもよい。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを上記記載の方法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等のキャリアタンパク質との複合体を形成させる。当該複合体は、その後好ましい免疫原として用いることができる。複合体としては、スカシ貝ヘモシアニンとの複合体が好ましく用いられる。
　前記ペプチドとキャリアタンパク質との複合体を形成させるなどの目的で、本発明のペプチドには１～２個、好ましくは１個のアミノ酸を付加することが出来る。付加されるアミノ酸の位置はペプチドのいずれの位置でもよく、特に限定されないが、ペプチドのＮ末端またはＣ末端が好ましい。
　複合体の形成においては、本発明のペプチドの抗原性を維持することができる限り、限定なく公知の方法を適用することができる。例えば、本発明のペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物（キャリアタンパク質）のアミノ基と結合させることもできる（ＭＢＳ法）。また、タンパク質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基などのアミノ基同士を結合させることもできる（グルタルアルデヒド法）。
　ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。すなわち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１～数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１～１４日毎に１～５回免疫を行って、最終免疫より約１～５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清を取得する。
　血清そのものをポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ／Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、該抗体を単離および／または精製し、得られた精製抗体を用いることも可能である。
　モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。まず上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化する。すなわち、ハイブリドーマの培養上清を検体として、免疫学的手法により、哺乳動物の免疫に用いた本発明のペプチドに対する特異的親和性を示しかつキャリアタンパク質と交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。次いで、当該ハイブリドーマの培養上清などから、自体公知の方法によって抗体を製造することができる。
　具体的には、下記のようにしてモノクローナル抗体を製造することができる。すなわち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１～数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１～１４日毎に１～４回免疫を行って、最終免疫より約１～５日後に免疫感作された該哺乳動物の脾臓などから抗体産生細胞を取得する。
　モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６，ｐ．４９５－４９７，１９７５）ならびにそれらに準じる修飾方法に従って行うことができる。すなわち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマを得る。
　細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３－ＡＧ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１－Ａｇ４－１（ＮＳ－１）、Ｐ３／Ｘ６３－Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（Ｓｐ２／０、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０またはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３－Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ－２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００－６ＴＧ－Ａ１－２、ＵＣ７２９－６、ＣＥＭ－ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１またはＣＥＭ－Ｔ１５が挙げられる。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、得られたハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート内で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述の免疫感作で用いた本発明のペプチドに対する反応性および前記上清のキャリアタンパク質に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、比較することによって行うことができる。
　スクリーニングによりクローン化されたハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養される。そして、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、該ハイブリドーマを、該ハイブリドーマに由来する動物の腹腔に注入することにより、動物に腹水を生成させ、該動物から得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様の方法で、単離および／または精製されることが好ましい。
　また、キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３－７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４－５０６４５８号公報、特開昭６２－２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６－１５６，１９９７」、「Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３－２１，１９９４」、特表平４－５０４３６５号公報、国際公開ＷＯ９４／２５５８５号パンフレット、「日経サイエンス、６月号、第４０～第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６－８５９，１９９４」、特表平６－５００２３３号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。
　ファージディスプレイによる抗体作製は、例えばヒト抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより行うことができ、これによりＦａｂ等の抗体等を容易に得ることができる。この場合、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる、連続する少なくとも５アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。好ましい抗体ライブラリーおよび抗体のスクリーニング方法については、「Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：４０７５　ｐ．１３１５－１３１７（１９８５）」、「Ｎａｔｕｒｅ，３４８：ｐ．５５２－５５４（１９９０）」、「Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，Ｓｅｐ；１（２）：１５５－１６９（２０００）」、国際公開ＷＯ０１／０６２９０７号パンフレットなどを参照のこと。これにより得られた抗体断片を用いたり、ファージが有するＤＮＡを利用して抗体を調製することができる。
　次に、上記抗体を含有する、マイコプラズマ感染症の予防または治療剤について説明する。
　本発明のペプチドは、マイコプラズマ感染症の原因菌であるマイコプラズマ・ニューモニエを構成するリポプロテインの活性部位を検討し、これを最適化することによって得られたものである。従って本発明の抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエの成分を認識しうるので、生体の獲得免疫機構、例えば：
（１）ＮＫ細胞やマクロファージなどの免疫細胞による捕食（オプソニン作用）、
（２）補体の活性化（エフェクター作用）、
（３）菌などの中和作用、
（４）抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
などの作用により、当該菌を排除する効果が期待される。これにより、マイコプラズマ感染症を未然に防止（予防）したり、治療することが可能となる。
　本発明において「マイコプラズマ感染症の予防または治療」とは、マイコプラズマ・ニューモニエの感染により発症する症状、例えば肺炎（マイコプラズマ肺炎（非定型肺炎という場合がある））だけでなく、例えば咽頭炎、気管支炎、中耳炎、脳炎、肝炎、膵炎、溶血性貧血、心筋炎、ギラン・バレー症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群などの合併症の予防、治療もしくは軽減をも含む。これらの症状は、生体内からマイコプラズマ・ニューモニエを排除することで改善することができる。
　本発明の予防または治療剤が有効成分として含有する抗体は、前記したとおりである。実施例に示すように、本発明の抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のＬＡＭＰｓおよびＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼ・サブユニットｂ（２１ｋＤａ）によるＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ：腫瘍壊死因子）－αをはじめとした炎症性サイトカインの産生を抑制することもできる。本発明の抗体を有効成分として含有してなる剤は、ＴＮＦ－αの産生を抑制することによってもマイコプラズマ感染症を予防・治療することが期待される。
　本発明の予防または治療剤中に含まれる前記抗体の配合量は、上記効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常、本発明の予防または治療剤全体の０．００１～９０重量％であり、好ましくは０．００５～５０重量％であり、より好ましくは０．０１～１０重量％である。
　本発明の予防または治療剤は、有効成分である前記抗体以外に医薬的に許容される担体を含有していてもよい。かかる担体としては、製剤分野において通常用いられる担体を使用することができ、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、グリセリン、ポリエチレングリコール等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。従って、本発明の予防または治療剤は、マイコプラズマ感染症の予防、治療または軽減用医薬組成物でもある。
　本発明の予防または治療剤の投与剤形としては、例えば液剤、注射製剤などが挙げられるが、それらに限定されない。また本発明の予防または治療剤は、その剤形が速放性製剤または徐放性製剤などの放出制御製剤であってもよい。抗体は一般に水性溶媒に可溶であるため、上記いずれの剤形を採っても容易に吸収される。さらに自体公知の方法により抗体の溶解性を上昇させることも可能である。
　上記本発明の予防または治療剤の製造方法について説明する。
　マイコプラズマ感染症の予防、治療または軽減のために用いることができる本発明の予防または治療剤は、製剤製法として自体公知である手段に従って、上記抗体を有効成分として使用することで製造することができる。
　例えば、全身投与に好適な本発明の予防または治療剤は、水性または非水性の等張な無菌の注射液に有効量の本発明の抗体を溶解させて製造（例、注射製剤）することができる。本発明の抗体を凍結乾燥させ（例、凍結乾燥製剤）これを水性または非水性の等張な無菌の希釈液に溶解させることで製造してもよい。また、局所投与に好適な本発明の予防または治療剤は、水または生理食塩水のような希釈液に本発明の抗体を溶解させて製造することができる（例、液剤）。液剤は、噴霧器を用いた気管支や肺などへの吸入療法によって使用することも可能である。なお、これらの剤には抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。これらの本発明の予防または治療剤は、アンプル及びバイアルのように、単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。
　本発明の予防または治療剤の投与量は、有効成分として含有する抗体の活性、種類もしくは配合量、投与対象、投与ルート、投与対象の年齢及び体重等により適宜設定することができるが、例えば成人（体重６０ｋｇ）１日あたりの投与量（有効量）としては、抗体量として０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～５００ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ～３００ｍｇである。本発明の予防または治療剤は、１日あたり、必要に応じて一度又は数回に分割して投与することができ、また数日に分けて投与することもできる。
　本発明の予防または治療剤は、マイコプラズマ・ニューモニエに有効な公知の抗生剤（以下、剤Ｘと記載）と併用することができる。剤Ｘとしては、マクロライド系抗生剤（ジスロマック、リカマイシン、エリスロシン、クラリスなど）、テトラサイクリン系抗生剤（ミノマイシンなど）、リンコマイシン系抗生剤（ダラシンなど）などのマイコプラズマ・ニューモニエのタンパク質合成を阻害する物質を有効成分とする製剤、ニューロキノン抗生剤（アクアチムなど）などのマイコプラズマ・ニューモニエのＤＮＡ複製を抑制する薬剤などが挙げられる。これらは１種類のみを併用してもよいし、複数の種類を併用してもよい。本明細書中、「併用」とは、本発明の予防または治療剤と剤Ｘとを組み合わせて使用することを意味し、その使用形態は特に限定されない。例えば、本発明の予防または治療剤と剤Ｘとを共に含有した医薬組成物としての投与、または混合することなく別途製剤し、同時若しくは時間差をあけての投与の両方を含む。
　本発明の予防または治療剤の投与対象としては特に限定されず、マイコプラズマ・ニューモニエを保持するまたは保持する可能性があるあらゆる動物が挙げられるが、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシ、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳類などが好ましい。
　本発明は、本発明の抗体を用いることを特徴とする、マイコプラズマ・ニューモニエの検出方法を提供する。また本発明は、本発明の抗体を用いることを特徴とする、マイコプラズマ感染症の検出方法も提供する。検出対象の試料としては、試料中にマイコプラズマ・ニューモニエが存在する可能性のある限りいかなる試料であってもよい。具体的には、本発明の抗体を用いて、抗原抗体反応によりマイコプラズマ・ニューモニエを検出および／または定量する方法が挙げられる。かかる方法としては特に限定されるものではないが、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（例、ＥＬＩＳＡ法）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２，ｐ．１４７－５２３（１９８３），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｏｘｆｏｒｄ（１９８９））などを利用した方法が挙げられる。
　また本発明は、本発明の抗体を含有してなる、マイコプラズマ感染症の診断薬を提供する。具体的には、例えば対象（例、ヒト）の咽頭拭い液や喀痰を採取し、それをサンプルとして当該診断薬とともに上記検出方法と同様の方法を適用してマイコプラズマ・ニューモニエを検出することで、検体がマイコプラズマ感染症に感染しているか否かを診断することができる。当該診断は、従来からマイコプラズマ肺炎の診断に利用されている、（１）ＰＣＲ法による診断、（２）胸部レントゲンによる診断、（３）マイコプラズマの分離培養による診断、（４）血清診断などと共に行ってもよい。
　さらに本発明は、本発明の抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、マイコプラズマ感染症の予防または治療方法を提供する。具体的には、上記した生体の獲得免疫機構に基づき、マイコプラズマ感染症を発症していないマイコプラズマ・ニューモニエ保菌者に対して本発明の抗体を投与することでマイコプラズマ感染症の発症を予防することができるだけでなく、マイコプラズマ感染症を発症した患者に対して本発明の抗体を投与することでその症状を緩和し、治療することもできる。投与方法、有効量は前記した通りである。
　以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
実施例１：ペプチドの合成
　配列番号１で表されるペプチド（以下、ペプチド（１）と記載）は、９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｆｍｏｃ）法に従い、自動化シンセサイザ（モデル４３３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って合成した。ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌによって保護されたＦｍｏｃ－レジンを充填したＷａｎｇ－ＰＨＢ樹脂を固相化の支持体として使った。０．１ｍＭアミノ酸をそれぞれの結合に使用した。使用したアミノ酸の側鎖の保護基を次に示す。セリン（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）、リジン（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙ－ｃａｒｂｏｎｙｌ）等。樹脂（レジン）に結合したＦｍｏｃ－アミノ酸の遊離は、ピペリジンを使用して行った。アミノ酸の結合には２－（１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅおよびｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）を使った。樹脂に結合したアミノ酸２０個前後からなるペプチドとＦｍｏｃ－Ｄｈｃ（Ｐａｍ２）－ＯＨ（Ｄｈｃ：（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）－Ｌ－Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の結合は、ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（１：２）中で、１２時間反応させて行った。５％フェノール含有ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、５％ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ、５％ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌｅ、および７％水を用いて、樹脂からのペプチドの切り出しおよびすべての保護基の除去を行った。合成の進行を、エレクトロスプレーイオン化質量分析機によってモニターした。得られた化合物は、質量分析に加え、核磁気共鳴スペクトル、赤外線吸収データ等によりペプチド（１）であることを確認した。配列番号２～４で示されるペプチドも、同様の方法で合成する。
実施例２：ペプチドに対する抗体の作製
　本発明のペプチド（１）に対する抗体（抗ＦＡＭ１２３ポリクローナル抗体）は以下のようにして作製した。まず、上記のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼ・サブユニットｂ由来のＲＱＥＩＥＫＥＫＲＬＩＱＥＱＳＬＫＥ（配列番号１）を合成（Ｎ末端にリンカーＣを付加）し、次にＫＬＨ（キャリアー）をＮ末端に結合させた。この融合タンパク質を抗原としてウサギを免疫（ｄａｙ０、抗原２００μｇ／ＦＣＡ；ｄａｙ７、抗原１００μｇ／ＦＩＡ；ｄａｙ１４、抗原１００μｇ／ＦＩＡ；ｄａｙ２１、抗原１００μｇ／ＦＩＡ；ｄａｙ２８、抗原１００μｇ／ＦＩＡ；ｄａｙ４２、抗原２００μｇ／ＦＩＡ；ｄａｙ４９、抗原２００μｇ／ＦＩＡ；ｄａｙ５６、抗原２００μｇ／ＦＩＡ）した。初回免疫後、６３日に全採血を行い、血清を得た。さらに抗ＦＡＭ１２３ポリクローナル抗体を得るため、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　ｃｏｌｕｍｎ：ＧＥヘルスケア）を使って粗精製することで、抗原特異的抗体（抗ＦＡＭ１２３血清）を得た。
　配列番号２で示されるペプチドに対する抗体は、Ｎ末端にリンカーＣを付加したペプチド（２）ＤＫＡＦＩＥＥＦＩＲＥＬＥＡＥＤＤＨＤを用い、同様の方法で作製した（抗ＦＡＭ１６２血清）。配列番号３～４で示されるペプチドに対する抗体も、同様の方法で作製する。
実施例３：抗体のＴＮＦ－α抑制活性の測定
　抗体の中和活性は、マウスの腹腔細胞から産生されるＴＮＦ－αの抑制により評価した。まず、Ｃ５７ＢＬマウスの腹腔へＯＫ４３２（１単位、中外製薬社製）を注射した。４８時間後、腹腔より滲出細胞を回収した。
　次に、刺激物と抗体の前処理について述べる。ＴＮＦ－αの産生刺激物として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　由来のＬＡＭＰｓ（ＴＸ－１１４可溶画分）および「２１ｋＤａ」としてのＬＡＭＰｓをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより展開した。次に２１ｋＤａ付近のゲルを切り出し、リポプロテインを抽出したものを調製した。これらと実施例２で得られた抗ＦＡＭ１２３血清（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）を１時間プレインキュベーションした。次に、マウス腹腔滲出細胞３ｘ１０５個を添加して、さらに５時間培養した。培養上清を回収して、上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。
　その結果、図２に示されるように、抗ＦＡＭ１２３血清は、マイコプラズマ・ニューモニエ由来のＬＡＭＰｓ分画によるＴＮＦ－α産生を約７１％まで抑制し、２１ｋＤａの抽出物によるＴＮＦ－α産生を約２８％まで抑制した。このように、本発明の抗体の活性が顕著に認められた。
実施例４：ＥＬＩＳＡによるリポプロテイン抗原の検出
　キャプチャー抗体として、実施例２で作製した抗ＦＡＭ１２３血清を使用した。またディテクション抗体として、実施例２で作製した抗ＦＡＭ１６２血清を使用した。
　抗原として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの生菌および熱不活化菌ならびにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｅｎｅｔｒａｎｓの熱不活化菌を用いた。これらの種々の抗原は、以下のように調製した。
　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　Ｍ１２９（ＡＴＣＣ　２９４３２）を、２０％ウマ血清を補足した改変Ｈａｙｆｌｉｃｋ培地を含むフラスコ中で、３７℃で４８～７２時間培養した。１０ｍｌの培養液を集め、４℃、６０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを回収した。回収したペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、「生Ｍ．ｐ」を得た。さらに、６０℃、３０分間の熱処理を行い、「不活化Ｍ．ｐ」を得た。生Ｍ．ｐおよび不活化Ｍ．ｐのそれぞれに対し、ＴＸ－１１４（Ｓｉｇｍａ）を０．０１％となるように加え、それぞれ「生Ｍ．ｐ＋ＴＸ１１４」および「不活化Ｍ．ｐ＋ＭＸ１１４」を得た。さらに、対照として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｅｎｅｔｒａｎｓをＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと同様に培養して、生菌を回収し、ＴＸ－１１４を０．０１％となるように加えたものを調製した（「Ｍ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ＋ＴＸ１１４」）。また、０．０１％ＴＸ－１１４のみのもの（「ＴＸ１１４」）、および、ＰＢＳのみのもの（「コントロール」）も対照として調製した。
　キャプチャー抗体（０．５μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）１穴あたり１００μｌ（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水））の量で分注し、室温で一晩インキュベーションした。翌日、プレートを洗浄バッファー（Ｔ－ＰＢＳ（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ））で３回洗浄した。次に、ブロッキングバッファー（ブロッキングワン、ナカライテスク）を１００μｌ／穴で添加し、室温で１時間インキュベーションした。洗浄バッファーで前と同様に３回洗浄した。次に、前記した種々の抗原を１００μｌ／穴で添加し、室温で２時間インキュベーションした。また、洗浄バッファーで同様に３回洗浄した。次に、ディテクション抗体（０．５μｇ／ｍｌ）を９６穴マイクロプレートへ１穴あたり１００μｌ（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で分注し、室温で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識した抗モルモットＩｇＧ抗体（０．４μｇ／ｍｌ、Ｃａｐｐｅｌ）を１００μｌ（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）／穴で添加し、室温で２時間インキュベーションした。次に、洗浄バッファーで３回洗浄した。発色は、ＥＬＩＳＡ　ＰＯＤ基質　ＴＭＢキット（ナカライ）を使用し、次のように行った。室温で２時間インキュベーション後、プレートを３回洗浄した。ついでキットのインストラクションに従い、発色＋基質液を１００μｌ／穴添加、１０分後、停止液を１００μｌ／穴で添加した。最後に、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅそれ自体（生Ｍ．ｐ）を直接検出することはできなかったが、生Ｍ．ｐに０．０１％ＴＸ１１４を添加したサンプル（生Ｍ．ｐ＋ＴＸ１１４）では、抗原を検出できた。熱により不活化したＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについても、０．０１％ＴＸ１１４の添加により抗原の検出感度が増強することが分かった（不活化Ｍ．ｐ＋ＴＸ１１４）。一方、熱不活化Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｅｎｅｔｒａｎｓに０．０１％ＴＸ１１４を添加しても抗原は検出できなかった（Ｍ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ＋ＴＸ１１４）。
　したがって実施例２で作製した抗体は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に検出し、マイコプラズマ感染症の診断に利用可能である。
　マイコプラズマ・ニューモニエ由来のＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂであるリポプロテイン由来の、アミノ酸２０前後から構成される特定のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する組成物は、マイコプラズマ感染症用のワクチン組成物として有用である。また、本発明のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を有効成分として含有してなる剤は、マイコプラズマ感染症の予防または治療剤として有用であり、かつ当該抗体はマイコプラズマ・ニューモニエの検出や、マイコプラズマ感染症の診断などに利用することができる。
　以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
　本出願は、日本で出願された特願２００８－１３６０１１（出願日：２００８年５月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
    　（５）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または２個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、変異前のペプチドと同等の免疫原性を有するペプチド
    からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドならびに医薬として許容されうる担体を含有するマイコプラズマ感染症用ワクチン組成物。
  2. 　アジュバントをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を有効成分として含有してなる、マイコプラズマ感染症の予防または治療剤。
  4. 　ＴＮＦ－αの産生を抑制する、請求項３に記載の剤。
  5. 　マイコプラズマ感染症の予防または治療剤を製造するための、請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体の使用。
  6. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を含有してなる、マイコプラズマ感染症の診断薬。
  7. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を用いることを特徴とする、マイコプラズマ・ニューモニエの検出方法。
  8. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体を用いることを特徴とする、マイコプラズマ感染症の検出方法。
  9. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を認識する抗体の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、マイコプラズマ感染症の予防または治療方法。
  10. 　（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
    　（５）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１または２個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、変異前のペプチドと同等の免疫原性を有するペプチド
    からなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドならびに医薬として許容されうる担体を含有するワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、マイコプラズマ感染症の予防方法。
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