WO2006126719A1

WO2006126719A1 - Ｔｌｒ活性化剤およびワクチン組成物

Info

Publication number: WO2006126719A1
Application number: PCT/JP2006/310830
Authority: WO
Inventors: Koichi Kuwano; Takashi Shimizu
Original assignee: Kurume University
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2006-11-30

Abstract

本発明は、現在有効な予防手段がないマイコプラズマ肺炎に対し、安全かつ有効なワクチンの開発に資する抗原および当該抗原を用いるワクチンを提供する。具体的には、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)由来のリポプロテイン、好ましくはＦ０Ｆ１型ＡＴＰアーゼのサブユニットｂを含有するトールライクレセプター（ＴＬＲ）の活性化剤、同リポプロテインを含有する転写因子誘導剤、同リポプロテインおよび医薬として許容され得る担体を含有するワクチン組成物を提供する。

Description

明細書

T L R活性化剤およびワクチン組成物

技術分野

本発明は、感染症予防に適用しうる T L Rのシグナル伝達の活性化剤およびその有効成分を含有するワクチン組成物に関する。，背景技術

マイコプラズマ ·ニューモニエ (Mycoplasma pneumoniae;は、マイコフラスマ月市炎の起因菌である。この起因菌は、気管支上皮細胞に付着した後、サイト力インをはじめ、様々な宿主免疫応答を誘導する力 S、その機序は明らかになっていない。当該菌は、直径 125〜153nm程度でウィルス程度の小さな病原体であるが、ウィルスと異なり増殖に生きた細胞を必要とせず（偏性細胞外寄生菌）、一部の抗生物質が有効だったことから、細菌に分類されていた時期もあるが、最近では別の綱に分類されている。 .

マイコプラズマ属の菌は、細菌の特徴である細胞壁を持っていない。細菌感染症治療の第一選択として使われる —ラクタム系の抗生物質（ペニシリン系、セフエム系など）は細菌の細胞壁を障害して菌を殺す作用を持つが、細胞壁を持たないマイコプラズマには無効である。有効な抗生物質は、蛋白合成阻害剤のマク口ライド系抗生剤やテトラサイクリン系抗生物質、および D N A複製を抑制するニューキノ口ン系抗生物質である。

臨床の現場では、臨床症状から判断してマイコプラズマ感染症が疑われた場合、マクロライドなどのタンパク質合成阻害剤が処方されている。しかし、これら抗生物質の多用により、抗生物質抵抗性のマイコプラズマ · ニューモニエの分離が報告されている。本症の治療において、早期診断 .早期治療をすることが病状の遷延化や流行を防止するために必要とされるが、診断が確定するまの S数がかかる場合が多い。近年、細菌性肺炎が激減した中で、肺炎全体に占めるマイコプラズマ肺炎の比率は高まっている。

一方、 Akira, S. & Takeda, K. , "Toll-like receptor signalling" Nature Rev. Immunol. , Vol. 4, pp. 499-511 (2004)に記載されているように、トールラィクレセプター（Toll Like Receptor (T L R)) と呼ばれる受容体ファミリ一が細菌の様々な菌体成分を認識し、最終的に転写因子である N F— _K Bを活性化することにより自然免疫を誘導することが報告されている。

また、従来マイコプラズマ ·ニューモニエ由来の F Q F 型 ΑΤ Ρァーゼのサブュニット bがリポプロテインであることは知られていた（George Pyrowolakis e t al, The subunit b of F 0 F 1 -type ATPase of the Bacterium Mycoplasma pneumoniae is a lipoprotein" The Journal of Biological Chemistry, Vol. 2673, No. 38, Issue of September 18, pp. 24792-24796 (1998))。しかしながら、本文献には、当該物質の生理作用については、何らの示唆も記載もない。発明の開示

本発明の目的は、.現在有効な予防手段がないマイコプラズマ肺炎に対し、安全かつ有効なワクチンの開発に資する抗原および当該抗原を用いるワクチンを提供することにある。

本発明者らは、永年にわたるマイコプラズマ肺炎の研究のなかで、上記宿主免疫応答を誘導する機序を解明すべく研究を行ってきたところ、マイコプラズマ · ュユーモニエ菌体由来の分画成分が免疫応答、特に N F- _K Bを誘導すること、かつ T L Rを活性化することを見出し、当該成分を抗原として調製し得るワクチン製剤がマイコプラズマ肺炎に対し、安全かつ有効な予防または軽減薬となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下のものを提供する：

[ 1 ] マイコプラズマ 'ニュ一モニエ由来のリポプロテインを含有するトールライダレセプター（T L R) の活性化剤、

[ 2 ] 前記 T L Rが T L R 1 、 T L R 2および T L R 6からなる群より選ばれる少なくとも 1種である前記 [1]に記載の活性化剤、

[3] 前記リポプロテインが膜結合リポプロテインである前記 [1]または [2]に記載の活性化剤、 '

[4] 前記膜結合リポプロティンが F₀F 型 AT Pァーゼのサブュニット bである、前記 [3]に記載の活性化剤、

[5] マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロテイン,を含有する転写因子誘導剤、

[6] 前記転写因子が NF— / c Bである、前記 [5]に記載の転写因子誘導剤、 [7] マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロティンおよび医薬として許容され得る担体を含有するヮクチン組成物、

[8] 前記リポプロテインが膜結合リポプロティンである前記 [7]に記載の組成物、

[9] 前記膜結合リポプロティンが F。F i型 AT Pァーゼのサブュニット bを主成分としてなるものである、前記 [8]に記載の組成物、

[1 0] アジュバントをさらに含有する、前記 [7]〜[9]のいずれかに記載の組成物、

[ 1 1] マイコプラズマ ·ニューモニエ由来のリポプロティンおよび医薬として許容され得る担体を包含する 1または 2以上の容器からなるキット、

[1 2] アジュバントをさらに含有する、前記 [1 1]に記載のキット、

[ 1 3] 前記 [7]〜[ 10]いずれかに記載のワクチン組成物の有効免疫感作量を対象に投与することを含む、マイコプラズマ肺炎の予防または軽減方法、

[ 14] マイコプラズマ肺炎の予防または軽減用ワクチン組成物の製造のための、マイコプラズマ .ニューモニエ由来のリポプロテインの使用、

[1 5] トールライクレセプターの活性化剤の製造のための、マイコプラズマ ' ニューモニエ由来のリポプロテインの使用、

[ 1 6] 転写因子誘導剤の製造のための、マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロテインの使用、ならびに [1 7] 前記 [7]〜[ 10]いずれかに記載のワクチン組成物、ならびに当該組成物をマイコプラズマ肺炎の予防または軽減に使用し得ることまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。図面の簡単な説明

図 1は、 LAMPにより NF— κ B誘導能が増強されるこ,.とを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を、横軸は LAMP量（/ig/ml) を示す。図 2は、抗 T LR 2抗体（図では、 antiTLRmAb と表記されている）により L AMPの作用が阻害されたことを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。対照として、無添加群（control) および免疫グロブリン処理群（Ig G)を示す。

図 3は、 TLR 2を強発現させることにより、 NF— κ B誘導能が増強されることを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を、横軸はトランスフェタトした T L R 2発現ベクターの量（ g/_ml) を示す。

図 4は、 LAMPの高速液体クロマトグラフィー（溶離液： 0%から 100%の 2 -プロパノールのリニアグラジェント）により溶出された画分の活性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を、横軸は画分の分画番号を示す。

図 5は、図 4に示す分画番号 62の成分を用いて、丁し1^活性化剤が丁し1^ 1 および 6に依存することを示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ相対活性を示す。

図 6は、本発明により得られた LAMPの SD S— PAGE展開図、およびゲルより抽出した成分のルシフェラ一ゼ活性を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明は、マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロテインを含有するトールライクレセプター（TLR) の活性化剤を提供する。本発明において、トールライクレセプター（TLR) とは、微生物の侵入や感染を防御するため、先天性免疫（自然免疫ともいう）の誘導経路に介在する受容体ファミリーである。ヒト TLRファミリ一は、 T L R 1〜 1 1のメンバーから構成されている。

本発明 tこおレヽて、マイコプラズマ ·ニューモニエ (Mycoplasma pneumoniae)と fま、ヒトマイコプラズマ肺炎の起因菌であり、現在までに単離 ·同定された菌株ばかりでなく、現在未同定であってもマイコプラズマ肺炎の発症に関与する限り、これらすべての菌を包含するものである。当該マイコプラズマ,は、抗生物質耐性菌株であってもよい。

本発明に用いられるマイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプ口ティンとは、当該菌体を構成する成分であって、 T LRを介したシグナル伝達を活性化させるものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは、膜結合リポプロティン（LAMP) であり、より好ましくは F。 F 型 AT Pァーゼであり、特にそのサブユニット b.が好ましい。

リポプロテインは、常法により菌体成分を抽出し、可溶成分を得、ついで分画し、精製することにより得られる。菌体成分の抽出方法としては、通常超音波破碎、各種界面活性剤による溶解などの方法が用いられる。界面活性剤による溶解方法としては、好ましくは、菌体を界面活性剤 T r i t o n— X (登録商標） 1 14で処理する方法である。

T r i t o n— X (登録商標） 1 14 (以下、 TX— 1 14と略する）は、シグマ社（Sigma, St. Louis, M0) から巿販されてぃる。 TX— 1 14は、その水溶物が 37°Cで水層と界面活性剤層に分離することから、菌体のタンパク質を親水性と疎水性のものに分離するのに適している。具体例として、 2%TX— 1 1 4 水溶液にマイコプラズマの菌体を溶解し、約 12, 000 r pm、 37 °Cで約 5分間遠心分離することにより水層と界面活性剤層に分離することができる。界面活性剤層を分取し、これにメタノールを加えることによりタンパク質を析出させ、遠心分離により上清を回収して可溶画分として得ることができる。このようにして得られた可溶画分は、膜結合リポプロテイン（LAMP) を豊富に含有しており、これを分画することにより、活性成分が得られる。分画は通常、高速液体クロマトグラフィー（HP LC) ( / Bondasphere C18 300A (Waters, Milford, MA)、溶出条件： 0%から 100%の 2-プロパノールのリ二アグラジェント、液量は lml/min、溶出時間：好ましくは 60分程度）にて行うのが好ましい。

前記 HPLCにより得られた画分の TLRの活性化は、後述するレポーターべクタ一を用いたレポーターアツセィにより確認することができる。

本発明の活性化剤は、丁！^の中でも丁し1 1、 TLR 2,および TLR 6からなる群より選ばれる少なくとも 1種を活性化させることが好ましく、とりわけ、 TLR 1、 T丄 R 2および T LR 6を活性化させることがより好ましい。

丁し1^ 1、丁し1^ 2ぉょび丁し1¾ 6を活性化させる本発明のリポプロテインは、他のマイコプラズマ（マイコプラズマ ' フアーメンタスおよびマイコプラズマ . サリバリウム）由来のリポプロテインとは異なり、 TLR 2および 6に加えて、 TLR 1も活性化するものである。 TLRを介した自然免疫の誘導は、その後の免疫獲得にも重要な役割を担うことから、本発明により得られる T L R活性化剤は、マイコプラズマ肺炎の予防または症状軽減への開発応用が期待される。

本発明の活性化剤に有効成分として含まれるリポプロテインは、以下のようにして特定することができる。 HP LCにより分画され、 T LRを活性化させる画分を、常法により電気泳動（SDS— PAGE) に付し、ゲルを染色した後、得られたバンドを切り出す。切り出したゲル片を、例えば、 1 % S D S中で破砕し、約 1 8時間攪拌してタンパク質を溶出させ、遠心分離により上澄みを回収して 4 倍量のアセトンを加えてタンパク質等を析出させる。遠心分離により沈殿物を回収し、 0. 1%SDSに溶解した精製物を後述するレポーターアツセィ（好ましくは、ルシフユラーゼ相対活性を測定する）に供し、最も活性の高い精製物を選択する。これを質量分析に付したところ、上記した FoF 型 ATPァーゼのサブユニット bであることが判明した。

質量分析法は、タンパク質解析において汎用されている MALD I—TOF MS法を適用することが好ましい。ここで、 MALD I とは、 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (マトリックス支援レーザ脱離イオン化法）のことである。 MA L D Iにおけるサンプルは、多量のマトリックス（Matrix)と均一に混合された状態にある。マトリックスは、紫外光である窒素レーザ光（波長 = 33 7nm) を吸収し、熱エネルギーに変換し、この時、マトリックスのごく一部（Ana lyte の最表面〜 lOOnm) が急速に（数ナノ秒）加熱され、サンプルとともに気化される。また、 T O F M Sとは、 Time of Fl ight Mass Spectrometry (飛行時間型質量分析法）の略称である。様々の大きさの正イオンがサプルスライド上で発生する。サンプルスライドと接地グラウンドの間には V0の電位差があるので、ィオンが引き出される。引き出し後の各イオン速度 Vは、エネルギー保存の法則より求められる。ここで電位差 V0は、どのイオンに対しても一定であることから、 m/z値が小さいイオン、すなわち質量が軽いイオンほど高速でドリフト空間（Drif t Space)を飛行し、検出器に到着する。このように、質量電荷比 m/z値の違いでイオンの飛行時間が異なることを利用して質量分析を行った結果、当該タンパク質は、 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 2673， No. 38, pp. 24792 - 24796 (1998)の Fig. 5から、ァシル基を 2個有するリポプロテインであると考察される。

F ₀ F 型 A T Pァーゼのサブュニット bのァミノ酸配列は、 Mycoplasma pneura oniae M129由来として、例えば、 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 2673, No. 38， pp. 24792 - 24796 (1998)に記載されており、 Genbank Accession No. NC一 000912の Mycoplasma pneumoniae M129の完全長ゲノムの C D S (protei n_id=NP_ 110291. 1) としても開示されている。

前記 F。 F i型 A T Pァーゼのサブュニット bは、前記開示されたァミノ酸配列それ自体以外に、前記開示されたアミノ酸配列において、 1つまたは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加した配列を有するものであっても、 T L Rを活性化する作用を有する限り、本発明のリポプロテインに包含される。

本発明は、マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロテインを含有する転写因子誘導剤を提供する。

前記誘導剤に有効成分として含まれるリポプ口ティンとしては、前記本発明の活性化剤に含まれるリポプ口ティンと同様のものがあげられる。

本発明の転写因子誘導剤は、 T L Rを介したシグナル伝達により、シグナルの下流に位置する転写因子を誘導する作用を有する。このような転写因子としては、 T L Rのシグナル経路に関与する因子であれば特に限定されるものではないが、 N F - κ Bが好ましい。

本発明の T L R活性化剤および転写因子誘導剤の作用は、 /レポ一ターアツセィにより測定することができる。具体的には、 T L Rおよびドミナントネガティブ T L Rを、腎臓由来の細胞株でベクターの導入効率が高いという特徴をもつ 293T 細胞に発現（ドミナントネガティブ発現ベクターは、 pFLAG-CMVl (Sigma)に T L R 1および T L R 6の T I Rドメインを欠損させたものを導入して作製することができる）させることにより確認することができる。

詳しくは、 4 X 10⁵ 個の 293T細胞に 0.1 gのレポーターベクター（転写因子 NF - κ B結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたベクター等）を FuGENE6 (Roche, Basel, Switzerland)を用いて導入し、すでに T L R 1および T L R 6に依存的に N F— κ Βを誘導することが知られている（S)- [2， 3-Bis(palmi toyloxy) - (2-RS) -propyl] -N-palmi toyト (R) - Cys - (S) -Ser- (S) - Lys4 - 0H， 3HC1 (P am3CSK4, CALBIOし riEM， Darmstadt, Germany)および M. fermentans macrophage - activating lipopeptide 2 (MALP- 2,松本美佐子博士（大阪府立成人病センター）力 ^¾ら分与。 Nishiguchi, M. , M. Matsumoto, T. Takao, M. Hoshino, Y. Shimoni shi, S. Tsuji, N. A. Begum, 0. Takeuchi, S. Akira, K. Toyoshima, and T. S eya. 2001. Mycoplasma fermentans lipoprotein M161Ag - induced cell activat ion is mediated by Toll—丄 ike receptor 2: role of N— terminal hydrophobic portion in its multiple functions. J Immunol 166: 2610)で刺激し、レポータ —の発現量（例えば、ルシフェラーゼ活性）の上昇を測定することにより、 T L R 1および T L R 6の発現を確認することができる。本発明の活性化剤または誘導剤、具体的にはリポプロテインを含有する試料を、 N F— κ B結 >合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクター（たとえば、市販されている p N F— κ Β— l u c (Sigma) )を導入した細胞と接触させ、 T L Rの活性化を介した N F— κ Bの誘導能をルシフェラーゼ活性を測定することにより確認することができる。一例として、 4 X 10⁵ 個の THP- 1細胞（ヒト単球由来、 ATCC : TIB- 202) に 0. 1 μ gのレポーターベクター p N F— κ B— I u c (Sigma)を FuG ENE6 (Roche, Basel, Switzerland)を用いて導入し、 4 8時間後、前記試料を最終濃度 0. 5%になるように添加し、 8時間経過後、ルシフヱ —ゼ活性を Dual-L uciferase Reporter Assay System (Promega)により測定する方法力あげられる。本発明は、マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロテインおよび医薬として許容され得る担体を含有するヮクチン組成物を提供する。

前記リポプロテインは、本発明の活性化剤において定義した通りである。当該リポプロテインは 1種のみを選択してもよいが、ワクチン組成物においては、マィコプラズマ.ニューモニエの 2種以上の株に由来する 1種類のリポプロティン、 1種の株に由来する多種類のリポプ口ティンまたは 2種以上の株に由来する多種類のリポプロティンを適宜選択して含有するワクチン組成物が好ましい。また、抗原としての免疫原性を有する限り、前記リポプロテインは、リポプロテイン断片であってもよい。抗原として多種類のリポプロテインまたはその断片を含有するワクチン組成物は、様々な接種対象者における獲得免疫を惹起させることが可能である。

前記医薬として許容され得る担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体が限定なく使用することができる。具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。担体は、好ましくは滅菌されたものである。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、 _P H調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。

本発明の組成物は、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液があげられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態があげられる。

本発明の組成物は、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有することが好ましい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、 N—ァセチル一ムラミノ L一トレオニル一 D—イソグノレタミン（thr— M D P )、 N—ァセチル一ノル一ムラミル一 Lーァラ二ノレ一 D—ィソグノレタミン、 N—ァセチルムラミノレ一 L—ァラニル一 D—ィソグルタミニル一 L—ァラニン一 2— ( 1 ' - 2 ' ージパルミトイル— sn—グリセ口 — 3—ヒドロキシホスホリルォキシ）—ェチルァミン、 Q u i 1 1 A (登録商標）、リゾレシチン、サポニン誘導体、プル口ニックポリオール、モンタニド ISA- 50 (S eppic, Paris, France)、 B a y o 1 (登録商標）および M a r k o 1 (登録商標）。ワクチン組成物は、記リポプ口ティンを有効成分として、前記担体および好ましくはアジュバントとともに常法により製造することができる。当該リポプロティンは、ヮクチン中に0. 001〜99. 9重量％含有されてぃればょぃ。

本発明のワクチン組成物は、様々な経路により接種することができる。例えば、皮内、皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、および経口経路等があげられるが、これらに限定されない。

また、本発明は、本発明のワクチン組成物の 1または 2以上の成分を包含する 1または 2以上の容器からなるキットを提供する。前記キットは、本発明のワクチン組成物全体を 1つの容器に包含したものであってもよく、当該ワクチンの有効成分と担体とを別々の容器に包含したものであってもよく、当該ワクチンの有効成分を種類毎に別々の容器に収容し、さらに担体を別の容器に収容したものであってもよく、当該ワクチンの有効成分を担体に溶解、懸濁または乳化させたものを有効成分の種類毎に別々の容器に収容したものであってもよい。前記キットには、さらに前記アジュバントを包含したものが好ましく、この場合、当該アジュバントをさらに別の容器に収容したものであってもよく、有効成分または担体を収容する容器中にさらに包含したものであってもよい。したがって、本発明のキット中に含まれる容器の数は、通常、 1〜 5個程度であり、好ましくは 1〜3 個である。

ワクチン組成物およびキットを用いて、マイコプラズマ肺炎を予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチン組成物を対象に投与する.ことを包含するマイコプラズマ肺炎の,予防または軽減方法を提供する。

ワクチンの投与対象としては、マイコプラズマ肺炎に罹患するあらゆる動物があげられるが、ヒト、サルを始めとする霊長類、ゥシ、ブタ、ゥマ、ヒッジ等の家畜、ィヌ、ネコ、マウス、ラット等の実験動物またはぺット等が例示されるが、これらに限定されるものではない。

ワクチンの投与方法としては、前記接種方法に例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重、薬物への忍容性等を考慮して決められるが、通常 0.00 l_mg〜1000mg を 1回または 2回以上投与するこどができる。好ましぐは複数回の投与であり、この場合、 2〜 4週間の間隔をあけて投与することが好ましい。実施例

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。

実施例

(1) LAMP画分の調製

Mycoplasma pneumoniae M129 (ATCC 29432) を、 2 0%ゥマ血清を補足した改変 Hayf lick培地を含むフラスコ中で、 3 7 °Cで 4 8時間培養した。フラスコに付着した細胞を P B S (0. 1 5M N a C l、 l 0 mMリン酸ナトリウム、 p H 7. 4) で 2回洗浄した後、搔き出し、 4°C、 6000X gで 10分間遠心分離することにより回収した。得られた細胞を、 1 OmM T r i s ( p H 7. 5)、 1 5 0 mM N a C lおよび l O u n i t s /m 1ァプロチュンを含む溶液中に、 2 m gタンパク質/ m 1の濃度となるように懸濁し、 TX— 1 14 (Sigma) を 2%となるように加え、 4°Cで 30分インキュベートすることによりマイコプラズマの菌体を溶解した。溶解液を、 12,000 r pm、 37 °Cで 5分間遠心分離することにより水層と界面活性剤層に分離し、界面活性剤層を分取した。得られた界面活性剤層（0. l m 1 ) にメタノール（0. 9m 1 ) を加えることによりタンパク質を析出させ、遠心分離により上清を回収して可溶画分（LAMP) とした,。

(2) レポーターアツセィ

NF- κ B結合領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターべクタ一 pNF— /c B_ 1 u cは、 Sigma社から贈入した。 4 x 10⁵ 個の THP-1細胞 (10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin G および 100 μ g/ml st reptomycinを含有する RP I1640 mediumで培養）に 0.1 gの p NF— κ Β— 1 u cを FuGENE6 (Roche, Basel, Switzerland)を用いて導入した。 48時間培養後、前記（1) で得られた LAMPを種々の濃度（0.1〜2/^_β/ηι1) になるように培地に添加し、さらに 8時間培養後、ルシフェラーゼ活性を Dual-Luciferase Re porter Assay System (Promegaリにより測定した。

その結果、図 1に示すように、 NF— C B誘導によるルシフェラーゼ活性は、 LAMPの濃度依存的に増強した。このルシフェラーゼ活性は、図 2に示すように、抗 T L R 2モノクローナノレ抗体（mA b) (IMG - 416, Cascade Bioscience (W inchester, MA) )を培地に添加することにより阻害されたが、免疫グロブリン（ I g G) の添加によっては阻害されなかった。

(3) TLRを介する転写活性上昇の証明

LAMPによる転写活性の刺激が T LR 2を介しているか確認するため、 293T 細胞に T LR 2を強発現させた。すなわち、 4 X 10⁵ 個の 293T細胞（ATCC: CRL -11268) (10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin Gおよび 100 μ g/ ml streptomycinを含有する！) -固 mediumで培養）に 0.1 / gのレポーターべクター pNF— κ Β— 1 u cおよび 0.01〜0.1 μ gの TLR 2発現ベクター（pFLAG -CMV1 (Sigma, St. Louis, MO)に TLR2の配列を揷入したもの）を FuGENE6 を用いて導入した。 48時間培養後、上記（1) で得られた LAMPを最終濃度 0.5% になるように培地に添加した。さらに 8時間培養後、ルシフユラーゼ活性を Dual -Luciferase Reporter Assay System により測 ¾£しに。

その結果、図 3に示すように、 T LR 2を強発現させた細胞では、発現していない細胞に比べ、有意にルシフェラーゼ活性が上昇しており、 T LR 2を介して NF— κ Bが誘導されることが示された。，

(4) H P L Cによる LAMP活性画分の分離

上記 (3) の結果、上記（1) により得られた LAMPが T L R 2を介して N F— κ Βを誘導することが証明されたことから、その活性成分の分離を行った。上記（1) により得られた LAMPを、 HP LC ( ^ Bondasphere C18 300A (Wa ters, Mil ford, MA)、溶出条件： 0%から 100%の 2-プロパノールのリニアグラジェント、液量は lml/min、溶出時間： 60分）に供し、分画した（分画番号 56〜 80)。

その結果、図 4に示すように、 87%の 2-プロパノールの画分（分画番号 62) に最も強いルシフヱラーゼ相対活性が観察された。

(5) NF_ (c B誘導の T L R依存性

T LR 2を発現させた 293T細胞に、ドミナントネガティブ（DN) T L R 6またはドミナントネガティブ（DN) TLR 1を強発現させ、上記（4) で得られた分画番号 62を用いて、上記（3) に記載の方法に準じて、ルシフェラーゼ活性を測定した。

その結果、図 5に示すように、 DNTLR 6および DNT LR 1で T LR 6および TLR 1の機能を阻害させることにより、ルシフェラーゼ活性が低下することがわかった。これらの結果かち、 NF— Bの誘導能は T L R 1、 TLR 2および T L R 6に依存することが証明された。

(6) LAMPの精製

上記（4)で得られた活性画分（分画番号 62) を SDS— PAGEで展開し、タンパク質を抽出した。具体的には、電気泳動を、標準的な SD S電気泳動法により 10%アクリルアミドゲルを用いて行った。泳動条件は、 1 O OV、 90分であった。泳動後、クマシ一ブルー染色によりゲルを染色した（図 6)。タンパク質の抽出は、次のように行った。すなわち、電気泳動後のゲルを 1 2の切片に分けて切り出し、 1%SD S水溶液中でゲルをそれぞれ破砕し、 1 8時間攪拌した。遠心分離によりゲルの破砕物を除去し、上澄みに 4倍量のアセトンを加え、タンパク質を沈殿させた。遠心分離により沈殿物を回収し、 0.1%S,.D Sに溶解した。零気泳動による画分（分画番号 1〜1 2) について、上記（3) の方法によりルシフェラゼ活性を測定した（図 6)。

その結果、図 6に示すように、約 20kDa (LP20という）および約 2kDa (LP2という）に NF— _κ B誘導活性が認められた。 .

(7) MALD I -TOF

上記（6) で得られた LP20について、 MALD I - TOFによる質量分析を行つた。すなわち、上記（6) において電気泳動で分離したゲル（分画番号 8) を切り出し、トリプシンで 18時間ゲル内消化したのち、 5%ギ酸溶液で断片を抽出した。得られた断片をマトリグスである a -Cyano- 4- hydroxycinnamic Acid (CHC A)と混合し、 MALD I - TOF (Autoflex (Bruker Daltnics, Bremen, German y)) にて分子量を測定した。 ^得られた断片の分子量を、マトリックスサイエンス社の検索エンジンであるアプリコットにより検索した。

その結果、 LP20は、 ATP synthase B chain precursor ( F。 F i型 ATPaseのサブユニット bと同義）であることが判明した。産業上の利用可能性

本発明の T LRの活性化剤によれば、マイコプラズマ ' ニューモニエ由来のリポプ口ティンを含有することから、マイコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、 T LRを介した先天性免疫応答の研究の進展に寄与することができる。本活性化剤は、 T LRを介した免疫賦活剤としても有用である。

本発明の転写因子誘導剤によれば、マイコプラズマ ·ニューモニエ由来のリポプロティンを含有することから、マイコプラズマ感染における宿主応答およびマィコプラズマ肺炎の発症機序の解明、ならびに、 T LRを介して NF- /c Bが関与する転写誘導の研究の進展に寄与することができる。

本発明のヮクチン組成物によれば、従来有効な予防および改善手段が存在していなかったマイコプラズマ肺炎を予防または、その症状を軽減することが可能となる。

本発明によれば、マイコプラズマ 'ニューモニエ菌体由来のリポプロティンは、 TLR活性化剤とレて、まだ、転写因子. （特に、 NF— <c B) 誘導剤として有用である。かかるリポプロテインを有効成分として含有するワクヂン組成物は、マィコプラズマ肺炎の予防または症状の軽減に有用である。

本出願は、日本で出願された特願 2005- 1 52068 (出願日： 2005 年 5月 2 5 B) を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1. マイコプラズマ ·ニューモニエ (Mycoplasma pneumoniae)由来のリポプロティンを含有するトールライクレセプター（T LR) の活性化剤。

2. 前記 T L Rが T LR 1、 T LR 2および T LR 6からなる群より選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲 1に記載の活性化剤。

3. 前記リポプロティンが膜結合リポプロティンである請^の範囲 1または 2に記載の活性化剤。

4. 前記膜結合リポプロテインが F。 F 型 AT Pァーゼのサブュニット bである、請求の範囲 3に記載の活性化剤。 .

5. マイコプラズマ ' ニューモニエ由来のリポプロテインを含有する転写因子誘導剤。

6. 前記転写因子が NF— _κ Bである、請求の範囲 5に記載の転写因子誘導剤。

7. マイコプラズマ .ニューモニエ由来のリポプロティンおよび医薬として許容され得る担体を含有するワクチン組成物。

8. 前記リポプロテインが膜結合リポプロテインである請求の範囲 7に記載の組成物

9. 前記膜結合リポプロテインが F Q F 型 A T Pァーゼのサブュニット bを主成分としてなるものである、請求の範囲 8に記載の組成物。

1 0. アジュバントをさらに含有する、請求の範囲 7〜9のいずれかに記載の組成物。

1 1.マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロティンおよび医薬として許容され得る担体を包含する 1または 2以上の容器からなるキット。

1 2.アジュバントをさらに含有する、請求の範囲 1 1に記載のキット。

1 3.請求の範囲 7〜 1 0いずれかに記載のワクチン組成物の有効免疫感作量を対象に投与することを含む、マイコプラズマ肺炎の予防または軽減方法。

1 4. マイコプラズマ肺炎の予防または軽減用ワクチン組成物の製のための、マイコプラズマ ·ニューモニエ由来のリポプロティンの使用。

1 5. トールライクレセプターの活性化剤の製造のための、マイコプラズマ '二ユーモニエ由来のリポプロテインの使用。

1 6.転写因子誘導剤の製造のための、マイコプラズマ 'ニューモニエ由来のリポプロテインの使用。

1 7. 請求の範囲？〜 10いずれかに記載のワクチン組成物、ならびに当該組成物をマイコプラズマ肺炎の予防または軽減に使用し得ること,または使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。