KR102439665B1 - 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 백신 및 백신 키트 - Google Patents

돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 백신 및 백신 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 제 1 투여 공정과, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 제 2 투여 공정을 포함하는 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법이다.

Description

돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 백신 및 백신 키트
본 발명은, 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 경구(經口) 또는 경비(經鼻) 투여용 백신, 근육내 투여용 백신 및 백신 키트에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea; PED)는, 감염된 돼지의 분변 중에 포함되는 PED 바이러스(PEDV)의 경구 감염에 의해 야기되고, 수양성 설사 및 식욕 부진을 주된 증상으로 하며, 1주령 이하의 포유돈에 있어서, 매우 높은 치사율을 나타내는 바이러스성 감염증이다(비특허문헌 1 참조). 양돈 농장 내에 PEDV가 한 번 침입하면 청정화가 곤란하고, 막대한 경제적 피해를 초래하는 점에서 문제가 되고 있다. 실제로, 근래 아시아 제국 및 미국을 중심으로 하는 북미 대륙에서 돼지 유행성 설사가 유행하여, 막대한 경제적 피해를 초래했다(비특허문헌 2 참조).
PEDV의 표적 세포는, 소화관, 특히 공장(空腸) 및 회장(回腸)의 상피 세포이다(비특허문헌 3 참조). 일부의 PEDV는, 점막하의 림프 조직을 통하여 혈류로 들어가는 것으로 생각되고 있고, PEDV 유전자가 전신 장기에서 검출되는 시기도 있다. 그러나, PEDV는, 다른 장기에서의 이차적인 증식을 나타내지 않고, 소화관 상피 세포에서 증식한 후, 분변으로부터 배설되어, 새로운 감염원이 된다. 이유기 이후의 돼지에서는, PEDV에 대한 감수성이 저하하여, 강제적으로 PEDV를 경구 투여해도 무증상으로 경과하는 경우도 있다. 그러나, 다른 병원체의 감염, 출산 및 과밀 사육 등의 스트레스 상황하에 있는 돼지가 PEDV에 폭로되면, 식욕 부진 및 설사 등의 증상을 일과성으로 발현해 버리는 경우도 있다(비특허문헌 4 참조).
돼지 유행성 설사에 대한 백신(이하, 「PED 백신」이라고 칭하는 경우가 있다)은, 1990년대 후반부터 일본, 한국, 중국, 필리핀 및 미국에서 시판되고 있다. 이들 종래의 PED 백신은, 모돈(母豚)의 임신 기간 중에 접종되어, 분만 후의 모돈의 유즙 중에 PEDV에 대한 중화 항체를 분비시켜, 포유돈이 이 유즙을 섭취함으로써 해당 포유돈의 소화관내에 침입한 PEDV를 중화시킨다는 메커니즘하에 설계되어 왔다(비특허문헌 5 참조). 포유돈은, 초유에 포함되는 이행 항체만으로는 PEDV 감염에서 벗어날 수 없으며, 포유 기간을 통하여, 상기 PED 백신에 의한 고농도의 PEDV에 대한 중화 항체가 포함되는 유즙을 계속 섭취함으로써 PEDV를 중화할 수 있고, 이것에 의해 돼지 유행성 설사의 발증을 저지하는 것이나, 증상을 경감할 수 있다.
그러나, 어떠한 원인으로 자돈(子豚)이 유즙을 섭취할 수 없는 상황에 빠지면, 해당 자돈은, PEDV에 감염되어 중증화되어 버린다는 문제가 있었다. 또, PEDV 항체 음성의 모돈 및 면역 레벨이 낮은 모돈이 대량의 PEDV에 폭로된 경우는, 비유량(泌乳量)의 감소를 수반하는 전신 증상을 보이며, PED 백신의 효과를 충분히 발휘할 수 없다는 문제도 있었다.
또한, 상기 종래의 PED 백신의 효과는, PEDV에 의해 야기되는 증상의 경감 및 자돈의 사망률의 저하가 한계이고, 액성 면역 응답의 유도가 불충분하여 IgA 항체의 응답을 충분히 유도할 수 없다는 문제도 있었다(비특허문헌 6 참조).
따라서, 유즙 중에 PEDV 특이적인 중화 항체의 산생(産生)을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 모돈 자신에게 감염 방어 가능한 면역 응답을 유도할 수 있는 새로운 돼지 유행성 설사에 대한 백신이나, 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제공이 강하게 요망되고 있는 것이 현상이다.
Zimmerman J.J. et al., Diseases of swine, 10th edition, Wiley-Blackwell 2012 Lee C., Virol J, 2015, Vol.12, p.193 Sueyoshi M. et al., J. Comp. Pathol, 1995, Vol.113(1), pp.59-67 미야자키 아야코, 「근래 유행하고 있는 돼지 유행성 설사(PED)에 대해서」, 수의역학 잡지, 2014년, 18(1), pp.85-89 사토 데츠로, 「돼지 유행성 설사 생백신의 특징과 그 효과」, 월간 피그 저널, 2014년, 2월호, pp.22-25 Song D. et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 2015, Vol.4(2), pp.166-176
본 발명은, 상기 종래의 여러 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은, 돼지 유행성 설사 바이러스에 특이적인 중화 항체의 산생 유도 활성 및 액성 면역 응답의 유도 활성이 뛰어나, 효율 좋게 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 있는 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 백신 키트, 경구 또는 경비 투여용 백신 및 근육내 투여용 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토를 행한 결과, 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여한 후, 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여에 의해 추가 투여하면, 종래의 돼지 유행성 설사에 대한 백신과 비교하여, 돼지 유행성 설사 바이러스에 특이적인 중화 항체의 산생 유도가 증강될 뿐만 아니라, 돼지 유행성 설사 바이러스에 특이적인 IgA 항체도 유도할 수 있는 것을 찾아냈다. 더 나아가, 이들 항체는, 유즙 중에 분비되어, 자돈에 있어서의 감염 방어를 가능하게 할 뿐만 아니라, 모돈 자신의 감염도 방어 가능한 것을 찾아냈다.
본 발명은, 본 발명자들에 의한 상기 지견에 의거한 것이며, 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로는 이하와 같다. 즉,
＜1＞ 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 제 1 투여 공정과,
상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 제 2 투여 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법이다.
＜2＞　경구 또는 경비 투여용의 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신, 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트, 근육내 투여용의 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신, 및 근육내 투여용 아쥬반트를 갖는 것을 특징으로 하는 백신 키트이다.
＜3＞　돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여하여 후에 추가 면역이 부여되는 돼지에 대하여 이용되고,
상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신 및 아쥬반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구 또는 경비 투여용 백신이다.
＜4＞　돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 또는 경비 투여하여 초회 면역이 부여된 돼지에 대하여 이용되고,
상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신 및 아쥬반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육내 투여용 백신이다.
본 발명에 의하면, 종래의 상기 여러 문제를 해결하여, 상기 목적을 달성할 수 있고, 돼지 유행성 설사 바이러스에 특이적인 중화 항체의 산생 유도 활성 및 액성 면역 응답의 유도 활성이 뛰어나, 효율 좋게 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 있는 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 백신 키트, 경구 또는 경비 투여용 백신 및 근육내 투여용 백신을 제공할 수 있다.
도 1은, PEDV 스파이크 유전자의 계통수 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
(돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법)
본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법은, 제 1 투여 공정과, 제 2 투여 공정을 포함하고, 필요에 따라, 추가로 기타 공정을 포함한다.
＜제 1 투여 공정＞
상기 제 1 투여 공정은, 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 공정이다.
＜＜돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 생백신＞＞
상기 PEDV의 생백신은, PEDV의 독성을 약독화한 백신이다.
PEDV는, 코로나바이러스과(Coronaviridae), 알파코로나바이러스속(Alphacoronavirus)에 속하는 바이러스이며, 그룹 Ⅰ 및 그룹 Ⅱ의 2개의 유전학적 그룹으로 분류되어 있다.
상기 PEDV의 생백신에 이용되는 PEDV의 분류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 상기 그룹 Ⅰ 및 상기 그룹 Ⅱ 중 어느 쪽이어도 된다. 이들 PEDV는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 PEDV의 입수 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, PEDV에 감염된 돼지로부터 분리하여 입수하는 방법, 시판품을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 PEDV에 감염된 돼지로부터 분리하여 입수하는 방법의 구체예로는, 이하의 방법 등을 들 수 있다.
돼지 유행성 설사(PED)를 발증한 돼지로부터 소장을 채취하여 조직 유제를 조제한 후, 해당 조직 유제를 PED에 감염되어 있지 않은 돼지에게 경구 투여하고, 수일간 후에 해당 돼지의 소장을 채취해, 이것을 이용하여 조직 유제를 조제한다. 이와 같은 계대(繼代)를 적절히 선택한 횟수 행한 후, 마지막 대에서 얻어진 조직 유제에, 종농도(終濃度)가 5㎍/mL∼10㎍/mL가 되도록 트립신을 첨가하고, 컨플루언트(confluent)로 된 Vero 세포에 접종하여, 5㎍/mL∼10㎍/mL 트립신 첨가 배양액 중에서 배양한다. 광학 현미경으로 세포 변성 효과(CPE)를 매일 확인하고, CPE가 확인된 시점에서 배양을 정지한다. 상기 CPE가 확인된 Vero 세포의 배양 상청으로부터, 상법(常法)에 의해 RNA를 추출하고, 서열번호 1∼16으로 표시되는 프라이머 서열을 이용하여 RT-PCR을 행한다. 이어서, 상법에 의해, 증폭한 RT-PCR 산물을 임의의 벡터에 클로닝하여, 플라스미드를 얻는다. 이 플라스미드 중의 PEDV 스파이크 유전자(이하, 「PEDV S유전자」라고 칭하는 경우가 있다)의 염기 서열을 상법에 의해 해석하고, 해석한 각 서열 단편을 어셈블리하여, 예를 들면, MEGA4.0 소프트웨어(http://www.megasoftware.net)를 이용하여, 근린 접합법에 의한 계통수 해석을 행함으로써, 상기 그룹 Ⅰ 및 상기 그룹 Ⅱ 중 어느 유전적 그룹에 속하는 PEDV인지를 판별할 수 있다.
상기 시판품을 이용하는 방법의 구체예로는, 시판되고 있는 생백신을, Vero 세포에 접종하여 배양하는 방법 등을 들 수 있다. 이 경우에, 트립신 비첨가의 배양액을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 그룹 Ⅰ에 속하는 PEDV로는, 예를 들면, P-5V주(株)(Sato T. et al., Virus Genes, 2011, Vol.43(1), pp.72-78), CV777주(Pensaert M.B. et al., Arch. Virol., 1978, Vol.58(3), pp.243-247), DR13주(Park S.J. et al., Virus Genes, 2007, Vol 35(1), pp.55-64), 96-P4C6주(일반재단법인 화학 및 혈청 요법 연구소 스임젠 등록상표 TGE/PED 백신주), JS-2004-2주(Zhao P.D. et al., Can.J.Vet.Res., 2015, Vol.79(1), 8-15), OH851주(Wang L. et al., Emerg. Infect. Dis., 2014, Vol.20(5), pp.917-919), CH/FJND-1/2011주(Tian Y., et al., Viruses, 2013, Vol.5(8), pp.1991-2004), DX주(Zhao P.D. et al., Can.J.Vet.Res., 2015, Vol.79(1), 8-15) 등을 들 수 있다.
또, 상기 P-5V주는, 닛세이켄 PED 생백신(닛세이켄 가부시키가이샤 제조)으로부터 상기 방법에 의해 용이하게 배양할 수도 있다.
상기 그룹 Ⅱ에 속하는 PEDV로는, 예를 들면, MZ0116-2/2013주(후술의 「시험예 2」 참조), OKN-1/JPN/2013주(Suzuki T. et al., Infect. Genet. Evol.2015, Vol.36, pp.363-368), USA/Colorado/2013주(Marthaler D. et.al., Genome Announce., 2013, Vol.1(4), pp.e00555-13), USA/Minnesota188/2014주(Marthaler D. et al., Emerg. Infect. Dis., 2014, Vol.20(12), pp.2162-2163) 등을 들 수 있다.
상기 PEDV의 독성을 약독화하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 공지의 방법 중에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 PEDV를 이종(異種) 숙주에서 계대 배양하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 이종 숙주로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 배양 세포, 발육 계란 등을 들 수 있다.
상기 제 1 투여 공정에서의 상기 PEDV의 생백신의 투여량으로는, 특별히 제한은 없고, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무 등, 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택할 수 있지만, 1회 투여당의 바이러스 함유량이 107.0 TCID50 이상이 되는 투여량(107.0 TCID50/도스 이상)인 것이 바람직하다. 상기 투여량이 107.0 TCID50/도스 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있다.
＜＜아쥬반트＞＞
상기 아쥬반트의 종류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 알루미늄염, 완전 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant), 불완전 프로인트 아쥬반트, 사포닌, 모노포스포릴 지질A(Monophosphoryl lipid A: MPL), 마이크로에멀전 아쥬반트, 콜레라독소, 대장균 이열성독소, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리이노신-폴리시티딜산(poly(I:C)), 폴리머 아쥬반트, 스쿠알렌, 덱스트린 유도체, 유동 파라핀, 토코페롤 초산(酢酸) 에스테르, 폴리소르베이트 등을 들 수 있다. 상기 아쥬반트는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 중에서도, 마이크로에멀전 아쥬반트, 콜레라독소, 대장균 이열성독소, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리이노신-폴리시티딜산(poly(I:C)), 폴리머 아쥬반트, 스쿠알렌 등이 바람직하고, 마이크로에멀전 아쥬반트가 특히 바람직하다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트는, 수중(水中)에 분산된 미소 유성 입자로 형성되는 것이다. 상기 미소 유성 입자란, 경(輕)광물유와 계면활성제를 혼합하여, 수중에서 유화함으로써 5nm∼500nm의 입자를 형성시킨 것이다.
상기 경광물유로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 유동 파라핀, 에테르화 유동 파라핀, 경질 유동 파라핀(일본약국방) 등을 들 수 있다. 이들 경광물유는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 유동 파라핀으로는, 예를 들면, 상품명으로, MARCOL(상표) 52(상품명, Exxon Mobil사 제조), Penreco(등록상표) Drakeol(등록상표) 6VR(상품명, Penreco사 제조) 등을 들 수 있다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트에 있어서의 상기 경광물유의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 0.001 질량％∼10.0 질량％가 바람직하고, 0.01 질량％∼0.1 질량％가 보다 바람직하다. 상기 경광물유의 함유량이 0.001 질량％ 미만이면, 입자가 불안정해지는 경우가 있고, 10.0 질량％를 넘으면, 접종 대상의 동물에 대하여 접종물의 유잔(遺殘)을 초래하는 경우가 있다.
상기 계면활성제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 만나이드 모노올레인산(mannide monooleic acid), 올레인산 만니탄에스테르(oleic acid mannitan ester)의 에톡실화 유도체, 모노스테아린산 글리세릴, 모노라우린산 데카글리세릴, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트 등을 들 수 있다. 이와 같은 계면활성제는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트에 있어서의 상기 계면활성제의 함유량으로는, 상기 경광물유를 유화하여 마이크로에멀전으로 할 수 있으면, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트는, 추가로 킬레이트화제를 포함하고 있어도 된다. 상기 마이크로에멀전 아쥬반트가 킬레이트화제를 포함하면, 상기 미소 유성 미립자에 결합한 항원(PEDV)을 안정화하는 것이나, 미소 유성 입자의 면역 담당 세포에의 결합을 도와주는 작용을 나타내는 점에서 유리하다.
상기 킬레이트화제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 글루콘산 칼슘, 글루콘산 망간, 살리실산 알루미늄, 가용성 초산 알루미늄 등의 다이온성 산복합체 등을 들 수 있다. 이들 킬레이트화제는, 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트에 있어서의 상기 킬레이트화제의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 0.002 질량％∼30 질량％가 바람직하고, 0.01 질량％∼15 질량％가 보다 바람직하다. 상기 킬레이트화제의 함유량이 0.002 질량％ 미만이면, 면역 응답 활성을 증강할 수 없는 경우가 있고, 30 질량％를 넘으면, 접종 동물에 대하여 부작용이 초래되는 경우가 있다.
상기 킬레이트화제를 함유하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 조제하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 물에, 상기 경광물유, 상기 계면활성제 및 상기 킬레이트화제를 첨가하고, 공지의 유화 수단에 의해 유화하여, 마이크로에멀전 아쥬반트로 하는 방법 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 일본국 특개2004-131417호 공보, 일본국 특개2005-75752호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다. 또, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트는, 시판품을 이용해도 되고, 시판품의 구체예로는, MONTANIDE IMS 시리즈의 IMS 1312 VG, IMS 1313 VG, IMS 251C, IMS 2215 VG, IMS 3012 VG ST(모두 SEPPIC사 제조) 등을 들 수 있다.
상기 제 1 투여 공정에 있어서의 상기 아쥬반트의 투여량으로는, 상기 PEDV의 생백신의 효과를 손상하지 않는 한 특별히 제한은 없고, 아쥬반트의 종류, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상 등의 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 아쥬반트가, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트인 경우의 투여량으로서도, 특별히 제한은 없지만, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트와 상기 PEDV의 생백신을 포함하는 바이러스액의 체적비가 20/80∼80/20이 되는 투여량이 바람직하고, 50/50이 되는 투여량이 특히 바람직하다. 상기 체적비(마이크로에멀전 아쥬반트/PEDV의 생백신을 포함하는 바이러스액)가 20/80 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있고, 80/20을 넘으면, 투여 부위의 종창, 경결, 발적, 발열, 아나필락시스 쇼크 등이 일어나는 경우나, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우 등이 있다.
상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트를 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 시기로는, 상기 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지고, 또한, 상기 제 2 투여 공정 전이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트를 동시에 투여해도 되고, 따로따로 투여해도 되지만, 동시에 투여하는 것이 간편한 점에서 바람직하다.
상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트를 동시에 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트를 혼합한 조성물을 투여하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트를 혼합한 조성물로는, 후술하는 본 발명의 경구 또는 경비 투여용 백신이 적합하게 이용된다.
상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트를 따로따로 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 경우, 상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트의 투여 순서로는, 상기 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또, 상기 PEDV의 생백신과 상기 아쥬반트의 투여 간격으로는, 상기 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 제 1 투여 공정을 행하는 횟수로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명은, 상기 제 1 투여 공정을 1회 행하는 것만으로도 충분한 효과를 얻을 수 있는 점에서 유리하다.
＜제 2 투여 공정＞
상기 제 2 투여 공정은, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여로 상기 제 1 투여 공정 후의 돼지에게 투여하는 공정이다.
＜＜돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 불활화 백신＞＞
PEDV의 불활화 백신은, PEDV의 병원성을 소실 또는 독소를 무독화한 백신이다.
상기 PEDV의 불활화 백신에 이용되는 PEDV의 분류, 입수 방법 등으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 제 1 투여 공정 중의 PEDV의 생백신의 항목에서 기재한 양태 등을 들 수 있다.
상기 PEDV의 감염능을 불활화하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 공지의 방법 중에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 PEDV를 포르말린 등의 약제로 처리하는 방법, 가열하는 방법, pH를 변화시키는 방법, 감마선을 조사하는 방법, 자외선을 조사하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 PEDV의 불활화 백신에 사용하는 PEDV는, 분리한 바이러스를 그대로 불활화해도 되고, 상기 약독화한 PEDV를 불활화해도 된다.
상기 제 2 투여 공정에 있어서의 상기 PEDV의 불활화 백신의 투여량으로는, 특별히 제한은 없고, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무 등, 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택할 수 있지만, 1회 투여당의 바이러스 함유량이 106.5 TCID50 이상이 되는 투여량(106.5 TCID50/도스 이상)이 바람직하고, 107.5 TCID50 이상이 되는 투여량(107.5 TCID50/도스 이상)이 보다 바람직하다. 상기 투여량이 106.5 TCID50/도스 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없고, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있다.
＜＜아쥬반트＞＞
상기 아쥬반트의 종류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 알루미늄염, 마이크로에멀전 아쥬반트, 폴리머 아쥬반트, 덱스트린 유도체, 유동 파라핀, 스쿠알렌, 토코페롤 초산 에스테르, 폴리소르베이트 등이 바람직하고, 마이크로에멀전 아쥬반트가 특히 바람직하다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 양태는, 상기 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것과 마찬가지이다.
상기 제 2 투여 공정에 있어서의 상기 아쥬반트의 투여량으로는, 상기 PEDV의 불활화 백신의 효과를 손상하지 않는 한 특별히 제한은 없고, 아쥬반트의 종류, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상 등의 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 아쥬반트가, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트인 경우의 투여량으로서도 특별히 제한은 없지만, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트와 상기 PEDV의 불활화 백신을 포함하는 바이러스액의 체적비가, 20/80∼80/20이 되는 투여량이 바람직하고, 50/50이 되는 투여량이 특히 바람직하다. 상기 체적비(마이크로에멀전 아쥬반트/PEDV의 불활화 백신을 포함하는 바이러스액)가 20/80 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있고, 80/20을 넘으면, 투여 부위의 종창, 경결, 발적, 발열, 아나필락시스 쇼크 등이 일어나는 경우나, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우 등이 있다.
상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트를 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 시기로는, 상기 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지고, 또한, 상기 제 1 투여 공정 후이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트를 동시에 투여해도 되고, 따로따로 투여해도 되지만, 동시에 투여하는 것이 간편한 점에서 바람직하다.
상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트를 동시에 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트를 혼합한 조성물을 투여하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트를 혼합한 조성물로는, 후술하는 본 발명의 근육내 투여용 백신이 적합하게 이용된다.
상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트를 따로따로 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 경우, 상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트의 투여 순서로는, 상기 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또, 상기 PEDV의 불활화 백신과 상기 아쥬반트의 투여 간격으로는, 상기 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 제 2 투여 공정을 행하는 횟수로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명은, 상기 제 2 투여 공정을 1회 행하는 것만으로도 충분한 효과를 얻을 수 있는 점에서 유리하다.
상기 제 1 투여 공정과, 상기 제 2 투여 공정의 투여 간격으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 1주간∼20주간이 바람직하고, 2주간∼10주간이 보다 바람직하며, 4주간∼10주간이 특히 바람직하다. 상기 투여 간격이 1주간 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있고, 20주간을 넘어도, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있다.
(백신 키트)
본 발명의 백신 키트는, 경구 또는 경비 투여용의 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신, 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트, 근육내 투여용의 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신 및 근육내 투여용 아쥬반트를 갖고, 필요에 따라, 추가로 기타 구성을 갖는다.
＜경구 또는 경비 투여용의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 생백신＞
상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV 생백신에 이용되는 PEDV의 분류, 입수 방법, PEDV의 독성을 약독화하는 방법 등으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 PEDV의 생백신의 항목에서 기재한 것 등을 들 수 있다.
상기 백신 키트에 있어서의 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV 생백신의 바이러스 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 사용 횟수 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV 생백신의 1회 투여당의 바이러스 함유량은, 107.0 TCID50/도스 이상인 것이 바람직하다. 또, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV 생백신은, 상기 백신 키트의 사용 시에, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무 등, 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택하고, 희석 등에 의해 조정할 수 있다.
＜경구 또는 경비 투여용 아쥬반트＞
상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트의 종류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 마이크로에멀전 아쥬반트, 콜레라독소, 대장균 이열성독소, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리이노신-폴리시티딜산(poly(I:C)), 폴리머 아쥬반트, 스쿠알렌 등이 바람직하고, 마이크로에멀전 아쥬반트가 특히 바람직하다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 양태는, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것과 마찬가지이다.
상기 백신 키트에 있어서의 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트의 양으로는, 특별히 제한은 없고, 사용 횟수, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV 생백신을 포함하는 바이러스액의 양 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 백신 키트는, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과, 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트를, 개별 구성으로서 갖고 있어도 되고, 이들을 혼합한 조성물의 상태로 갖고 있어도 된다.
상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트를 혼합한 조성물로는, 후술하는 본 발명의 경구 또는 경비 투여용 백신이 적합하게 이용된다.
＜근육내 투여용의 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 불활화 백신＞
상기 근육내 투여용의 PEDV 불활화 백신에 이용되는 PEDV의 분류, 입수 방법, PEDV의 감염능을 불활화하는 방법 등으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 2 투여 공정 중의 PEDV의 불활화 백신의 항목에서 기재한 양태 등을 들 수 있다.
상기 백신 키트에 있어서의 상기 근육내 투여용의 PEDV 불활화 백신의 바이러스 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 사용 횟수 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 근육내 투여용의 PEDV 불활화 백신의 1회 투여당의 바이러스 함유량은, 106.5 TCID50/도스 이상이 바람직하고, 107.5 TCID50/도스 이상이 보다 바람직하다. 또, 상기 근육내 투여용의 PEDV 불활화 백신은, 상기 백신 키트의 사용 시에, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무 등, 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택하고, 희석 등에 의해 조정할 수 있다.
＜근육내 투여용 아쥬반트＞
상기 근육내 투여용 아쥬반트의 종류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 알루미늄염, 마이크로에멀전 아쥬반트, 폴리머 아쥬반트, 덱스트린 유도체, 유동 파라핀, 스쿠알렌, 토코페롤 초산 에스테르, 폴리소르베이트 등이 바람직하고, 마이크로에멀전 아쥬반트가 특히 바람직하다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 양태는, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것과 마찬가지이다.
상기 백신 키트에 있어서의 상기 근육내 투여용 아쥬반트의 양으로는, 특별히 제한은 없고, 사용 횟수, 상기 근육내 투여용의 PEDV 불활화 백신을 포함하는 바이러스액의 양 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 백신 키트는, 상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과, 상기 근육내 투여용 아쥬반트를, 개별 구성으로서 갖고 있어도 되고, 이들을 혼합한 조성물의 상태로 갖고 있어도 된다.
상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트를 혼합한 조성물로는, 후술하는 본 발명의 근육내 투여용 백신이 적합하게 이용된다.
＜기타 구성＞
상기 기타 구성으로는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 용해액, 희석용 생리식염수, 사용시 조제용 용기, 시린지, 주사 바늘, 첨부 문서(package insert) 등을 들 수 있다.
상기 용해액의 조성으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 후술하는 본 발명의 경구 또는 경비 투여용 백신 중의 기타 성분의 항목에 기재한 것 등을 들 수 있다.
＜사용 방법＞
상기 백신 키트는, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트를 경구 투여 또는 경비 투여한 후, 상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트를 근육내 투여하여 이용한다.
상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트는, 동시에 투여해도 되고, 따로따로 투여해도 되지만, 동시에 투여하는 것이 간편한 점에서 바람직하다.
상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트를 동시에 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 경우는, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트를 혼합한 상기 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트를 따로따로 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 경우, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트의 투여 순서로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또, 상기 경구 또는 경비 투여용의 PEDV의 생백신과 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트의 투여 간격으로는, 상기 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트는, 동시에 투여해도 되고, 따로따로 투여해도 되지만, 동시에 투여하는 것이 간편한 점에서 바람직하다.
상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트를 동시에 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 경우는, 상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트를 혼합한 상기 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트를 따로따로 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 경우, 상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트의 투여 순서로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또, 상기 근육내 투여용의 PEDV의 불활화 백신과 상기 근육내 투여용 아쥬반트의 투여 간격으로는, 상기 근육내 투여용 아쥬반트의 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 백신 키트는, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법에 적합하게 사용할 수 있다.
(경구 또는 경비 투여용 백신)
본 발명의 경구 또는 경비 투여용 백신은, 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신 및 아쥬반트를 포함하고, 필요에 따라, 추가로 기타 성분을 포함한다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신은, 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여하여 후에 추가 면역이 부여되는 돼지에 대하여 이용된다.
＜돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 생백신＞
PEDV의 생백신에 이용되는 PEDV의 분류, 입수 방법, PEDV의 독성을 약독화하는 방법 등으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 PEDV의 생백신의 항목에서 기재한 양태 등을 들 수 있다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신에 있어서의 상기 PEDV의 생백신의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 107.0 TCID50/도스 이상인 것이 바람직하다. 상기 함유량이 107.0 TCID50/도스 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있다.
＜아쥬반트＞
상기 아쥬반트의 종류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 마이크로에멀전 아쥬반트, 콜레라독소, 대장균 이열성독소, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리이노신-폴리시티딜산(poly(I:C)), 폴리머 아쥬반트, 스쿠알렌 등이 바람직하고, 마이크로에멀전 아쥬반트가 특히 바람직하다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 양태는, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것과 마찬가지이다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신에 있어서의 상기 아쥬반트의 함유량으로는, 상기 PEDV의 생백신의 효과를 손상하지 않고, 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 아쥬반트가, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트인 경우, 상기 경구 또는 경비 투여용 백신에 있어서의 상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 함유량으로서도, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 20 체적％∼80 체적％가 바람직하고, 50 체적％가 특히 바람직하다. 상기 마이크로에멀전의 함유량이 20 체적％ 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있고, 80 체적％를 넘으면, 투여 부위의 종창, 경결, 발적, 발열, 아나필락시스 쇼크 등이 일어나는 경우나, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우 등이 있다.
＜기타 성분＞
상기 기타 성분으로는, 특별히 제한은 없고, 약리학적으로 허용될 수 있는 담체 중에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 첨가제, 보조제, 물 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 첨가제 또는 상기 보조제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 살균제, 보존제, 점결제(粘結劑), 증점제(增粘劑), 고착제, 결합제, 착색제, 안정화제, pH 조정제, 완충제, 등장화제(等張化劑), 용제, 산화 방지제, 자외선 방지제, 결정 석출 방지제, 소포제, 물성 향상제, 방부제 등을 들 수 있다.
상기 살균제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄 등의 양이온성 계면활성제 등을 들 수 있다.
상기 보존제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 파라옥시안식향산 에스테르류, 클로로부탄올, 크레졸, 티메로살, 페녹시에탄올 등을 들 수 있다.
상기 점결제, 상기 증점제, 또는 상기 고착제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 전분, 덱스트린, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸 전분, 풀루란, 알긴산나트륨, 알긴산암모늄, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 구아검, 로커스트빈검, 아라비아고무, 크산탄검, 젤라틴, 카제인, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌·프로필렌 블록 폴리머, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
상기 결합제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 물, 에탄올, 프로판올, 심플시럽, 포도당액, 전분액, 젤라틴액, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필 스타치, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셸락, 인산칼슘, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
상기 착색제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 산화티탄, 산화철 등을 들 수 있다.
상기 안정화제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 트라가칸트(tragacanth), 아라비아고무, 젤라틴, 피로아황산나트륨, 에틸렌디아민 사초산(EDTA), 티오글리콜산, 티오유산 등을 들 수 있다.
상기 pH 조정제 또는 상기 완충제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 구연산나트륨, 초산나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
상기 등장화제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 포도당 등을 들 수 있다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신에 있어서의 상기 기타 성분의 함유량으로는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜제형＞
상기 경구 또는 경비 투여용 백신의 제형으로는, 경구 투여 또는 경비 투여할 수 있으면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 고형제, 액제 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 상기 경구 투여용 백신으로는, 상기 고형제, 상기 액제 등이 바람직하고, 상기 경비 투여용 백신으로는, 상기 액제가 바람직하다.
- 고형제 -
상기 고형제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 경캡슐제, 연캡슐제 등을 들 수 있다.
- 액제 -
상기 액제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 경구 투여용 백신으로서 이용되는 경우, 예를 들면, 시럽제, 드링크제, 현탁제, 주정제, 혼이제(混餌劑; dietary agents) 등을 들 수 있다.
상기 액제가 경비 투여용 백신으로서 이용되는 경우, 예를 들면, 액제, 점안제, 에어졸제, 분무제 등을 들 수 있다.
＜제조 방법＞
상기 경구 또는 경비 투여용 백신을 제조하는 방법으로는, 상기 PEDV의 생백신과, 상기 아쥬반트를 혼합할 수 있으면 특별히 제한은 없고, 제형 등에 따라 공지의 방법 중에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜사용＞
상기 경구 또는 경비 투여용 백신은, PEDV의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여하여 후에 추가 면역이 부여되는 돼지에 대하여 이용된다.
상기 돼지에게 추가 면역을 부여하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 상기 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 상기 제 2 공정에 기재한 방법이 적합하게 이용된다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신은, 1종 단독으로 사용해도 되고, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약과 병용되어도 된다. 또, 상기 경구 또는 경비 투여용 백신은, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약, 사료, 음료수 등에 배합된 상태로 사용해도 된다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신은, 후에 PEDV의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여하여 추가 면역이 부여됨으로써, PEDV에 특이적인 중화 항체의 산생을 유도할 수 있고, 또한 액성 면역 응답에 의해 PEDV에 특이적인 IgA의 산생도 유도할 수 있기 때문에, 효율 좋게 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 경구 또는 경비 투여용 백신은, 모돈뿐만 아니라, 자돈에게도 직접 투여할 수 있기 때문에, 어떠한 원인으로 유즙을 섭취할 수 없는 자돈이나, 모돈의 유즙 중의 PEDV에 대한 중화 항체의 농도가 낮은 경우라도, 자돈의 PEDV에의 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 점에서 유리하다.
(근육내 투여용 백신)
본 발명의 근육내 투여용 백신은, 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신 및 아쥬반트를 포함하고, 필요에 따라, 추가로 기타 성분을 포함한다.
상기 근육내 투여용 백신은, 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 또는 경비 투여하여 초회 면역이 부여된 돼지에 대하여 이용된다.
＜돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 불활화 백신＞
PEDV의 불활화 백신에 이용되는 PEDV의 분류, 입수 방법, PEDV의 감염능을 불활화하는 방법 등으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 2 투여 공정 중의 PEDV의 불활화 백신의 항목에서 기재한 양태 등을 들 수 있다.
상기 근육내 투여용 백신에 있어서의 상기 PEDV의 불활화 백신의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 106.5 TCID50/도스 이상이 바람직하고, 107.5 TCID50/도스 이상이 보다 바람직하다. 상기 함유량이 106.5 TCID50/도스 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있다.
＜아쥬반트＞
상기 아쥬반트의 종류로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 알루미늄염, 마이크로에멀전 아쥬반트, 폴리머 아쥬반트, 덱스트린 유도체, 유동 파라핀, 스쿠알렌, 토코페롤 초산 에스테르, 폴리소르베이트 등이 바람직하고, 마이크로에멀전 아쥬반트가 특히 바람직하다.
상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 양태는, 상기한 본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 제 1 투여 공정 중의 아쥬반트의 항목에서 기재한 것과 마찬가지이다.
상기 근육내 투여용 백신에 있어서의 상기 아쥬반트의 함유량으로는, 상기 PEDV의 불활화 백신의 효과를 손상하지 않고, 아쥬반트 효과가 얻어지는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 아쥬반트가, 상기 마이크로에멀전 아쥬반트인 경우, 상기 근육내 투여용 백신에 있어서의 상기 마이크로에멀전 아쥬반트의 함유량으로서도, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 20 체적％∼80 체적％가 바람직하고, 50 체적％가 특히 바람직하다. 상기 마이크로에멀전의 함유량이 20 체적％ 미만이면, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우가 있고, 80 체적％를 넘으면, 투여 부위의 종창, 경결, 발적, 발열, 아나필락시스 쇼크 등이 일어나는 경우나, PEDV 특이적인 중화 항체의 산생이나 액성 면역 응답을 유도할 수 없어, 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 없는 경우 등이 있다.
＜기타 성분＞
상기 기타 성분으로는, 특별히 제한은 없고, 약리학적으로 허용될 수 있는 담체 중에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 경구 또는 경비 투여용 백신의 기타 성분의 항목에서 기재한 것 등을 들 수 있다.
상기 근육내 투여용 백신에 있어서의 상기 기타 성분의 함유량으로는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜제형＞
상기 근육내 투여용 백신의 제형으로는, 근육내 투여할 수 있으면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 주사제 등을 들 수 있다.
- 주사제 -
상기 주사제로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 사용시 용해용 고형제 등을 들 수 있다.
＜제조 방법＞
상기 근육내 투여용 백신을 제조하는 방법으로는, 상기 PEDV의 불활화 백신과, 상기 아쥬반트를 혼합할 수 있으면 특별히 제한은 없고, 제형 등에 따라 공지의 방법 중에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜사용＞
상기 근육내 투여용 백신은, PEDV의 생백신과 아쥬반트를 경구 또는 경비 투여하여 초회 면역이 부여된 돼지에 대하여 이용된다.
상기 돼지에게 초회 면역을 부여하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 상기 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법의 상기 제 1 공정에 기재한 방법이 적합하게 이용된다.
상기 근육내 투여용 백신은, 1종 단독으로 사용해도 되고, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약과 병용되어도 된다. 또, 상기 근육내 투여용 백신은, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약 중에 배합된 상태로 사용해도 된다.
상기 근육내 투여용 백신은, PEDV의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 또는 경비 투여하여 초회 면역이 부여된 돼지에 대하여 이용됨으로써, PEDV에 특이적인 중화 항체의 산생을 유도할 수 있고, 또한 액성 면역 응답에 의해 PEDV에 특이적인 IgA의 산생도 유도할 수 있기 때문에, 효율 좋게 돼지 유행성 설사를 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 근육내 투여용 백신은, 모돈뿐만 아니라, 자돈에게도 직접 투여할 수 있기 때문에, 어떠한 원인으로 유즙을 섭취할 수 없는 자돈이나, 모돈의 유즙 중의 PEDV에 대한 중화 항체의 농도가 낮은 경우라도, 자돈의 PEDV에의 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 점에서 유리하다.
실시예
이하에 실시예 등을 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예 등에 조금도 한정되는 것은 아니다.
(제조예 1)
＜PEDV(P-5V주) 생백신 1의 제조＞
＜＜PEDV의 P-5V주의 분리 및 작출(作出)＞＞
야외에서 돼지 유행성 설사(PED)를 발증한 자돈으로부터 소장을 채취하여, 10 질량％ 조직 유제로 했다. 이 10％ 조직 유제를, PED에 감염되어 있지 않은 자돈에게 경구 투여하고, 2일 후, 소장을 채취하여, 10 질량％ 조직 유제를 제작했다. 마찬가지의 방법으로, PED에 감염되어 있지 않은 자돈에서 3대까지 계대했다. 계대 3대째의 자돈으로부터 얻어진 조직 유제에, 종농도가 10㎍/mL가 되도록 트립신을 첨가하고, 미리 25㎠ 배양 플라스크에서 컨플루언트로 된 Vero 세포에 접종하여, 37℃에서 60분간 배양했다. 그 후, 이하에 기재한 방법으로 조제한 배양액(이하, 「10㎍/mL 트립신 첨가 배양액」이라고 칭하는 경우가 있다) 5mL를 첨가하여, 37℃에서 배양했다. 광학 현미경으로 세포 변성 효과(CPE)를 매일 확인하여, CPE가 확인된 시점에서 배양을 정지하고, 계대했다. 분리한 바이러스의 계대는, 계대가 진행됨에 따라 트립신 첨가량을 서서히 감소시켜, 최종적으로 트립신 비첨가로 하여, 총 계대수 100대까지 계대했다.
- 10㎍/mL 트립신 첨가 배양액 -
500mL의 Minimal Essential Media(MEM)(Thermo Fisher Scientific사 제조)에 종농도 0.02％(w/v)가 되도록 효모 엑기스(Difco Laboratories사 제조) 및 종농도 0.03％(w/v)가 되도록 트립토스 포스페이트 브로스(Tryptose Phosphate Broth)(Difco Laboratories사 제조)를 용해하고, 추가로 페니실린 50,000 유닛, 스트렙토마이신 50mg, 및 종농도 10㎍/mL가 되도록 트립신을 용해했다.
＜＜P-5V주의 동정(同定)＞＞
P-5V주의 배양 상청으로부터 TRIZol(등록상표) 시약(Thermo Fisher Scientific사 제조)을 이용하여, 바이러스 RNA를 추출했다. PEDV RNA를 SuperScript(등록상표) Ⅲ One-Step RT-PCR System(Thermo Fisher Scientific사 제조) 및 하기 표 1에 나타내는 8종류의 PEDV S유전자 특이적 프라이머 세트(프라이머 세트 1∼8)를 이용한 RT-PCR에 의해, 써멀 사이클러(Veriti 96-Well Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific사 제조)로 증폭했다. 증폭한 RT-PCR 산물은, pCR(상표 등록) 2.1-TOPO TA 벡터(Thermo Fisher Scientific사 제조)에 히트 쇼크법을 이용하여 대장균 TOP10(Thermo Fisher Scientific사 제조)으로 형질 전환하여, 클로닝했다. 대장균을 LB 배지(조성: 염화나트륨 10g, Bacto Trypton 10g, 효모 엑기스 5g을 1L의 증류수에 용해)를 이용하여, 37℃에서 하룻밤 배양한 후, QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여 플라스미드를 정제했다. 정제한 플라스미드로부터, BigDye(등록상표) Terminator v3.1 시약 및 3130xl 제네틱 애널라이저(Applied Biosystems사 제조)에 의해, PEDV S유전자 염기 서열을 해독했다. 해독한 각 서열 단편을 어셈블리하여, MEGA 4.0 소프트웨어(http://www.megasoftware.net)를 이용하여, 근린 접합법에 의한 계통수 해석을 행하였다.
그 결과, 상기에서 얻어진 주(株)는, PEDV의 유전학적 그룹 I의 P-5V주로 동정되었다(도 1 참조).
[표 1]
Figure 112019023471809-pct00001
＜＜PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1의 조제＞＞
상기 P-5V주를 Vero 세포에 접종하고, 37℃에서 3일간 배양 후, Vero 세포를 회수하여 동결 융해했다. 이어서, 상기 동결 융해물을 원심분리하고, 얻어진 상청을 「PEDV(P-5V주) 바이러스 항원액 1」로서 회수했다. 상기 PEDV(P-5V주) 바이러스 항원액 1에 대하여, 7.5％(w/v)의 폴리에틸렌글리콜 6000 및 1M의 염화나트륨을 각각 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 원심분리하여 침전을 회수했다. 상기 PEDV(P-5V주) 바이러스 항원액 1의 1/20량(v/v)의 생리식염수로 상기 침전을 용해 후, 재차 원심분리를 행하여, 얻어진 상청을 「PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1」로서 회수했다.
- 바이러스 역가의 측정 -
상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1의 바이러스 역가(바이러스 감염가)를 50％ 조직배양 감염치량(50％ Tissue Culture Infective Dose: TCID50)법에 의해 측정했다.
구체적으로는, Vero 세포를 0.75×106세포/0.5ml/웰로 24웰 세포 배양 플레이트에 파종하고, 37℃에서 3일간 배양했다. 측정 대상의 항원액(여기에서는, 상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1)을 배양액(500mL의 MEM(Thermo Fisher Scientific사 제조)에 종농도 0.02％(w/v)가 되도록 효모 엑기스(Difco Laboratories사 제조) 및 종농도 0.03％(w/v)가 되도록 트립토스 포스페이트 브로스(Difco Laboratories사 제조)를 용해하고, 추가로 페니실린 50,000 유닛, 스트렙토마이신 50mg을 용해했다)으로 10배 계단희석하여, Vero 세포에 접종 후, 37℃에서 90분간 배양했다. 배양액을 교환 후, 37℃에서 7일간 배양했다. 세포 변성 효과(CPE)를 광학 현미경으로 관찰하고, Reed-Muench법에 따라 바이러스 역가(TCID50)를 산출했다.
그 결과, 상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1의 바이러스 역가는, 107.75 TCID50/mL였다.
＜＜PEDV(P-5V주) 생백신 1의 조제＞＞
상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1과, 마이크로에멀전(상품명: MONTANIDE IMS1313 VG, SEPPIC사 제조)을 등량(v/v)으로 혼합하고, 실온(25±5℃)에서 5분간 이상 교반하여, 「PEDV(P-5V주) 생백신 1」로 했다.
(제조예 2)
＜PEDV(P-5V주) 생백신 2의 제조＞
＜＜PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 2의 조제＞＞
제조예 1에서 분리 및 작출한 PEDV의 P-5V주를 Vero 세포에 접종하고, 37℃에서 3일간 배양 후, Vero 세포를 회수하여 동결 융해했다. 이어서, 상기 동결 융해물을 원심분리하고, 얻어진 상청을 「PEDV(P-5V주) 바이러스 항원액 2」로서 회수했다. 상기 PEDV(P-5V주) 바이러스 항원액 2에 대하여, 7.5％(w/v)의 폴리에틸렌글리콜 6000 및 1M의 염화나트륨을 각각 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 원심분리하여 침전을 회수했다. 상기 PEDV(P-5V주) 바이러스 항원액 2의 1/20량(v/v)의 생리식염수로 상기 침전을 용해 후, 재차 원심분리를 행하여, 얻어진 상청을 「PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 2」로서 회수했다.
상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 2의 바이러스 역가를, 상기 제조예 1의 「바이러스 역가의 측정」란에 기재한 TCID50 법에 의해 측정했다. 그 결과, 상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 2의 바이러스 역가는 107.75 TCID50/mL였다.
＜＜PEDV(P-5V주) 생백신 2의 조제＞＞
상기 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 2와, 제조예 1에서 조제한 마이크로에멀전을 등량(v/v)으로 혼합하고, 실온(25±5℃)에서 5분간 이상 교반하여, 「PEDV(P-5V주) 생백신 2」로 했다.
(제조예 3)
＜PEDV(P-5V주) 불활화 백신 1의 제조＞
＜＜PEDV(P-5V주) 불활화 바이러스 항원액 1의 조제＞＞
제조예 1에서 얻어진 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 1에 대하여, 종농도 0.2％(v/v)가 되도록 중성 완충 포르말린(간토 가가쿠 가부시키가이샤 제조)을 첨가하고, 4℃에서 48시간 교반하여 상기 PEDV(P-5V주) 바이러스 항원을 불활화함으로써, 「PEDV(P-5V주) 불활화 바이러스 항원액 1」을 얻었다.
＜＜PEDV(P-5V주) 불활화 백신 1의 조제＞＞
상기 PEDV(P-5V주) 불활화 바이러스 항원액 1과, 제조예 1에서 조제한 마이크로에멀전을 등량(v/v)으로 혼합하고, 실온(25±5℃)에서 5분간 이상 교반하여, 「PEDV(P-5V주) 불활화 백신 1」로 했다.
(제조예 4)
＜PEDV(P-5V주) 불활화 백신 2의 제조＞
＜＜PEDV(P-5V주) 불활화 바이러스 항원액 2의 조제＞＞
제조예 2에서 얻어진 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액 2에 대하여, 종농도 0.2％(v/v)가 되도록 중성 완충 포르말린(간토 가가쿠 가부시키가이샤 제조)을 첨가하고, 4℃에서 48시간 교반하여 상기 PEDV(P-5V주) 바이러스 항원을 불활화함으로써, 「PEDV(P-5V주) 불활화 바이러스 항원액 2」를 얻었다.
＜＜PEDV(P-5V주) 불활화 백신 2의 조제＞＞
상기 PEDV(P-5V주) 불활화 바이러스 항원액 2와, 제조예 1에서 조제한 마이크로에멀전을 등량(v/v)으로 혼합하고, 실온(25±5℃)에서 5분간 이상 교반하여, 「PEDV(P-5V주) 불활화 백신 2」로 했다.
(실시예 1)
＜초회 면역＞
PED 항체 음성의 8주령의 돼지에게, 제조예 1에서 제조한 PEDV(P-5V주) 생백신 1(10mL, 108.0 TCID50/도스)을 1회 경구 투여했다.
＜추가 면역＞
상기 초회 면역으로부터 4주간 후에, 제조예 3에서 제조한 PEDV(P-5V주) 불활화 백신 1(2mL, 107.5 TCID50/도스)을 1회 근육내 투여(주사)했다.
(비교예 1)
＜초회 면역＞
PED 항체 음성의 8주령의 돼지에게, 제조예 1에서 얻은 PEDV(P-5V주) 농축 바이러스 항원액(10mL, 108.0 TCID50/도스)을 1회 경구 투여했다.
＜추가 면역＞
상기 초회 면역으로부터 4주간 후에, 제조예 3에서 제조한 PEDV(P-5V주) 불활화 백신 1(2mL, 107.5 TCID50/도스)을 1회 근육내 투여(주사)했다.
(비교예 2)
＜초회 면역＞
PED 항체 음성의 8주령의 돼지에게, 닛세이켄 PED 생백신(닛세이켄 가부시키가이샤 제조)(2mL)을 1회 근육내 투여(주사)했다.
＜추가 면역＞
상기 초회 면역으로부터 4주간 후에, 닛세이켄 PED 생백신(닛세이켄 가부시키가이샤 제조)(2mL)을 1회 근육내 투여(주사)했다.
[표 2]
Figure 112019023471809-pct00002
(시험예 1)
실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 돼지에 대해, 초회 면역 직전에 및 추가 면역으로부터 1주간 후에, 각각 혈액을 채취했다. 또, 대조로서, 초회 면역 및 추가 면역을 행하지 않은 PED 항체 음성의 8주령의 돼지에 대해서도, 8주령, 12주령 및 13주령의 시점에서 혈액을 채취했다. 이어서, 이하에 나타내는 방법으로, 채취한 혈액 중의 PEDV 중화 항체가의 측정, 및 PEDV에 대한 IgA의 산생 유도를 조사했다.
＜PEDV 중화 항체가의 측정＞
Vero 세포를 0.75×106세포/0.5ml/웰로 24웰 세포 배양 플레이트에 파종하고, 37℃에서 3일간 배양했다. 배양액(500mL의 MEM(Thermo Fisher Scientific사 제조)에 종농도 0.02％(w/v)가 되도록 효모 엑기스(Difco Laboratories사 제조) 및 종농도 0.03％(w/v)가 되도록 트립토스 포스페이트 브로스(Difco Laboratories사 제조)를 용해하고, 추가로 페니실린 50,000 유닛, 스트렙토마이신 50mg을 용해했다)으로 2배 계단희석한 돼지 혈청에, 등량의 P-5V주(200 TCID50)를 함유하는 바이러스액을 혼합하고, 37℃에서 90분간 반응시켰다. 혈청과 P-5V주의 혼합액을, 상기 Vero 세포에 접종하고, 37℃에서 90분간 배양했다. 배양액을 교환 후, 37℃에서 7일간 배양했다. 세포 변성 효과(CPE)를 광학 현미경으로 관찰하여 PEDV 중화 항체가를 측정했다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 또한, 중화 항체가의 단위는, 혈청의 희석 배율(배)로 나타낸다.
＜PEDV에 대한 IgA의 산생 유도＞
＜＜웨스턴블로트법에 의한 PEDV에 대한 IgA의 검출＞＞
실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 추가 면역으로부터 1주간 후에 채취한 혈액을 각각 원심분리하여, 혈청을 분리했다. P-5V주(107.0 TCID50/mL)를 함유하는 바이러스액 200μL를 SDS-PAGE겔에서 영동(泳動)한 후, 폴리불화비닐리덴(PVDF) 필터(Merck Millipore사 제조)에 블로팅했다. 1차 항체로서, 3％(w/v) 스킴 밀크 및 0.05％(w/v) Tween20을 첨가한 PBS(조성: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4/12H2O 2.9g 및 KH2PO4 0.2g, 증류수 1L에 용해. 이하의 시험예에 있어서도 마찬가지의 조성으로 한다)에서 100배 희석한 돼지 혈청을, 2차 항체로서 HRP 표지 항돼지 IgA 폴리클로날 항체(Acris Antibodies사 제조)를 이용하고, 검출 시약(상품명: ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare사 제조)에 의해, PEDV에 대한 IgA를 검출했다.
웨스턴블로트의 결과로부터, 이하의 평가 기준에 의거하여 PEDV에 대한 IgA의 산생 유도의 유무를 평가했다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
- 평가 기준 -
「-」: PEDV에 대한 IgA의 산생 유도 활성 없음(웨스턴블로트의 밴드가 검출되지 않았다)
「+」: PEDV에 대한 IgA의 산생 유도 활성 있음(웨스턴블로트의 밴드가 검출되었다)
[표 3]
Figure 112019023471809-pct00003
초회 면역에서 아쥬반트를 포함하는 PEDV(P-5V주) 생백신을 경구 투여한 경우(실시예 1)는, 아쥬반트를 포함하지 않는 PEDV를 경구 투여한 경우(비교예 1)나, 종래의 근육내 투여용 백신을 2회 투여한 경우(비교예 2)와 비교하여, 현저한 PEDV 특이적 중화 항체의 산생 증강 활성 및 PEDV 특이적 IgA의 산생 유도 활성이 인정되었다.
(시험예 2)
실시예 1 및 비교예 1의 돼지에게, 추가 면역으로부터 2주간 후에, 각각 이하의 방법으로 분리 및 작출한 야외주(野外株)인 MZ0116-2/2013주(이하, 「야외주 MZ」라고 칭하는 경우가 있다)(105.0 TCID50/mL) 5mL를 경구 투여하여 공격했다. 또, 대조로서, 초회 면역 및 추가 면역을 행하지 않은 PED 항체 음성의 14주령의 돼지도, 마찬가지로 하여 야외주 MZ(105.0 TCID50/mL) 5mL를 경구 투여하여 공격했다. 이어서, 이하에 나타내는 방법으로, 임상 증상의 관찰, 분변 중의 PEDV RNA의 검출 및 장기에 있어서의 PEDV RNA의 검출을 행하였다.
＜＜PEDV(MZ0116-2/2013주(야외주 MZ))의 분리 및 작출＞＞
돼지 유행성 설사(PED)로 사망한 자돈으로부터 소장을 채취하고, 이 소장 0.5g을 비즈가 들어있는 파쇄 튜브(Bertin Technologies사 제조)에 넣어, 고속 세포 파쇄기(Precellys, Bertin Technologies사 제조)에서 파쇄 후, 배양액(MEM, Thermo Fisher Scientific사 제조) 5mL에 현탁하여, 원심분리했다. 원심분리 후의 상청을 포아사이즈(구멍 지름) 0.22㎛의 시린지 필터(GE 헬스케어사 제조)에 통과시켜, 10 질량％ 조직 유제로 했다. 이어서, 상기 10 질량％ 조직 유제 300μL와, 10㎍/mL 트립신 첨가 배양액 100μL를 혼합한 혼합액을 조제했다. 미리 6웰의 세포 배양 플레이트에서 컨플루언트로 된 Vero 세포에, 상기 혼합액을 전량 접종하고, 37℃에서 90분간 배양했다. 이어서, 상기 혼합액을 제거하고, 10㎍/mL 트립신 첨가 배양액 4mL를 첨가하여, 37℃에서 배양했다. 광학 현미경으로 세포 변성 효과(CPE)를 매일 확인하고, CPE가 확인된 시점에서 배양을 정지했다. 상청 및 세포를 회수하여, 동결 융해한 후에 원심분리한 상청을 계대했다.
＜＜MZ0116-2/2013주의 동정＞＞
제조예 1의 「P-5V주의 동정」에 있어서, P-5V주의 배양 상청을 대신해서, 야외주 MZ의 배양 상청을 이용한 것 이외에는, 상기 「P-5V주의 동정」과 마찬가지의 방법으로 계통수 해석을 행하였다.
그 결과, 상기에서 얻어진 주는, PEDV의 유전학적 그룹 Ⅱ의 야외주 MZ로 동정되었다(도 1 참조).
＜임상 증상의 관찰＞
실시예 1, 비교예 1 및 대조를 야외주 MZ로 공격 후 0일째∼14일째에, 매일, 분변의 상태 및 식욕을 관찰하고, 이하의 평가 기준에 의거하여 평가했다. 분변의 상태의 결과를 하기 표 4에, 식욕의 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
- 분변의 상태의 평가 기준 -
「0」: 정상변
「1」: 무른변
「2」: 설사변
「3」: 수양성 설사변
- 식욕의 평가 기준 -
「0」: 정상
「1」: 경도의 부진
「2」: 중간 정도의 부진
「3」: 중증의 부진
[표 4]
Figure 112019023471809-pct00004
[표 5]
Figure 112019023471809-pct00005
분변의 상태에 대해서는, 실시예 1, 비교예 1 및 대조의 모두에 있어서 0점이며, 차이가 인정되지 않았다(표 4). 한편, 식욕에 대해서는, 실시예 1에서는 정상이었던 것에 대해, 비교예 1 및 대조에서는 식욕 부진이 인정되었다(표 5).
＜직장 스와브(swab) 중의 PEDV RNA의 검출＞
실시예 1, 비교예 1 및 대조를 야외주 MZ로 공격 후 0일째∼14일째 사이, 매일, 멸균 면봉(오사키메디칼 가부시키가이샤 제조)을 이용하여 직장 스와브를 채취하고, 1mL의 PBS에 현탁했다. 이 현탁액을 원심분리하고, TRIZol(등록상표) 시약(Thermo Fisher Scientific사 제조)을 이용하여, 바이러스 RNA를 추출했다. PEDV RNA를 SuperScript(등록상표) Ⅲ One-Step RT-PCR System(Thermo Fisher Scientific사 제조) 및 PEDV 특이적 프라이머(서열번호 17로 표시되는 프라이머 9-F[5'-GATATGTTTGTAATGGTAACTC-3'] 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 9-R[5'-AGCATAGCTAAAAGGCAATGC-3'])를 이용한 RT-PCR에 의해, 써멀 사이클러(Veriti 96-Well Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific사 제조)로 증폭했다. 증폭한 RT-PCR 산물은, 아가로오스겔 전기 영동으로 분리하고, 에티듐브로마이드를 이용하여 염색한 후, 자외선 조사에 의해 검출했다. 각 군의 모수(母數)에 대한 PEDV RNA가 검출된 양성 개체의 출현율(％)을 산출한 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure 112019023471809-pct00006
＜장기에 있어서의 PEDV RNA의 검출＞
실시예 1, 비교예 1 및 대조를 야외주 MZ로 공격 후 14일째에, 각 개체의 비장, 공회장, 맹장, 결장 및 장간막 림프절을 적출하여, 각각 10 질량％ 조직 유제를 제작했다. 각 10 질량％ 조직 유제로부터, TRIZol(등록상표) 시약(Thermo Fisher Scientific사 제조)을 이용하여, 각 장기에 있어서의 PEDV RNA를 추출했다. 이어서, GoTaq(등록상표) 1-Step RT-qPCR System(Promega사 제조) 및 PEDV 특이적 프라이머(서열번호 19로 표시되는 프라이머 10-F[5'-CGCAAAGACTGAACCCACTAAC-3'] 및 서열번호 20으로 표시되는 프라이머 10-R[5'-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3'])를 이용한 리얼타임 RT-PCR에 의해, StepOnePlus Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific사 제조)에서 RNA량(log10 TCID50/mL 상당)을 정량했다. 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
[표 7]
Figure 112019023471809-pct00007
표 6의 결과로부터, 비교예 1 및 대조에서는, PEDV RNA가 검출된 양성 개체의 출현율이 높았던 것에 대해, 실시예 1에서는, 관찰 기간 중에 PEDV RNA가 검출된 양성 개체는 출현하지 않았다. 또, 표 7의 결과로부터, 장기에 있어서의 PEDV RNA도 마찬가지로, 실시예 1에서는 검출되지 않았다.
이러한 결과로부터, 실시예 1에서는, 장관 점막으로부터 분비된 분비형 IgA에 의해 PEDV가 중화되어, 감염 방어 면역이 성립하고 있는 것이라고 생각된다.
또한, 표 6의 비교예 1 및 대조에서 인정되는 바와 같이, PEDV는, 한번 검출되지 않게 되더라도, 다시 출현하고, 이것이 감염 후 1개월∼2개월 정도 지속하는 것이 알려져 있다.
(실시예 2)
＜초회 면역＞
PED 항체 음성의 8주령의 돼지에게, 제조예 2에서 제조한 PEDV(P-5V주) 생백신 2(1mL, 107.45 TCID50/도스)를 1회 경비 투여했다.
＜추가 면역＞
상기 초회 면역으로부터 6주간 후에, 제조예 4에서 제조한 PEDV(P-5V주) 불활화 백신 2(2mL, 107.75 TCID50/도스)를 1회 근육내 투여(주사)했다.
[표 8]
Figure 112019023471809-pct00008
(시험예 3)
실시예 2의 돼지에 대해, 초회 면역 직전 및 추가 면역으로부터 1주간 후의 혈액을 채취했다. 또, 대조로서, 초회 면역 및 추가 면역을 행하지 않은 PED 항체 음성의 8주령의 돼지에 대해서도, 8주령 및 15주령의 시점에서 혈액을 채취했다. 이어서, 시험예 1의 「PEDV 중화 항체가의 측정」 및 「PEDV에 대한 IgA의 산생 유도」란에 기재한 방법과 마찬가지의 방법으로, 채취한 혈액 중의 PEDV 중화 항체가 및 PEDV에 대한 IgA의 산생 유도를 조사했다. 결과를 하기 표 9에 나타낸다.
[표 9]
Figure 112019023471809-pct00009
초회 면역에서 PEDV(P-5V주) 생백신 경비 투여한 경우도, 경구 투여한 경우와 마찬가지로, 현저한 PEDV 특이적 중화 항체의 산생 증강 활성 및 PEDV 특이적 IgA의 산생 유도 활성이 인정되었다.
종래, PEDV가 호흡기계 기관에 감염된다는 보고는 없고, PEDV의 감염은 소화기관에 국한되어 있기 때문에, 경비 투여에 의해, PEDV 특이적 중화 항체나 PEDV 특이적 IgA의 산생을 유도할 수 있는 것은, 본 발명자들에 의한 예상외의 지견이다.
(시험예 4)
실시예 2의 돼지에게, 추가 면역으로부터 2주간 후에, 야외주 MZ(105.0 TCID50/mL) 5mL를 경구 투여하여 공격했다. 또, 대조로서, 초회 면역 및 추가 면역을 행하지 않은 PED 항체 음성의 16주령의 돼지도, 마찬가지로 하여 야외주 MZ(105.0 TCID50/mL) 5mL를 경구 투여하여 공격했다. 이어서, 시험예 2의 「직장 스와브 중의 PEDV RNA의 검출」란에 기재한 방법과 마찬가지의 방법으로, 직장 스와브 중의 PEDV RNA의 검출 및 장기에 있어서의 PEDV RNA의 검출을 행하였다.
＜직장 스와브 중의 PEDV RNA의 검출＞
각 군의 모수에 대한 PEDV RNA가 검출된 양성 개체의 출현율(％)을 산출한 결과를 하기 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure 112019023471809-pct00010
＜장기에 있어서의 PEDV RNA의 검출＞
실시예 2 및 대조를 야외주 MZ로 공격 후 14일째에, 각 개체의 공회장, 맹장, 결장 및 장간막 림프절을 적출하고, 각 장기에 있어서의 PEDV RNA를 시험예 2의 「장기에 있어서의 PEDV RNA의 검출」란에 기재한 방법과 마찬가지의 방법으로 검출하여, RNA량(log10 TCID50/mL 상당)을 정량했다. 결과를 하기 표 11에 나타낸다.
[표 11]
Figure 112019023471809-pct00011
(실시예 3)
＜초회 면역＞
PED 항체 음성의 임신돈에게, 제조예 2에서 제조한 PEDV(P-5V주) 생백신 2(1mL, 107.45 TCID50/도스)를 1회 경비 투여했다.
＜추가 면역＞
상기 초회 면역으로부터 8주간 후에, 제조예 4에서 제조한 PEDV(P-5V주) 불활화 백신 2(2mL, 107.75 TCID50/도스)를 1회 근육내 투여(주사)했다.
(비교예 3)
＜초회 면역＞
PED 항체 음성의 임신돈에게, 닛세이켄 PED 생백신(닛세이켄 가부시키가이샤 제조) 2mL를 1회 근육내 투여(주사)했다.
＜추가 면역＞
상기 초회 면역으로부터 4주간 후에, 닛세이켄 PED 생백신(닛세이켄 가부시키가이샤 제조) 2mL를 1회 근육내 투여(주사)했다.
[표 12]
Figure 112019023471809-pct00012
(시험예 5)
실시예 3 및 비교예 3의 임신돈으로부터 태어난 자돈(생후 2일째)에게, 각각 야외주 MZ(105.0 TCID50/mL) 5mL를 경구 투여하여 공격했다. 또, 대조로서, 초회 면역 및 추가 면역을 행하지 않은 PED 항체 음성의 임신돈으로부터 태어난 자돈(생후 2일째)에 대해서도 야외주 MZ(105.0 TCID50/mL) 5mL를 경구 투여하여 공격했다. 또한, 자돈의 공격 후에도, 실시예 3 및 비교예 3의 모돈과, 이들의 자돈은 동거시켰다.
＜모돈에 있어서의 PEDV 중화 항체가＞
실시예 3, 비교예 3 및 대조의 임신돈(모돈)에 대해, 초회 투여 직전, 추가 투여로부터 1주 후, 및 자돈에의 공격으로부터 1주간 후의 혈액을 채취했다. 이어서, 시험예 1의 「PEDV 중화 항체가의 측정」란에 기재한 방법과 마찬가지의 방법으로, 채취한 혈액 중의 PEDV 중화 항체가를 조사했다. 결과를 하기 표 13에 나타낸다.
＜모돈의 유즙에 있어서의 PEDV에 대한 IgA의 산생 유도＞
자돈에의 공격 직전에, 실시예 3, 비교예 3 및 대조의 모돈의 유즙을 채취하고, 시험예 1의 「웨스턴블로트법에 의한 PEDV에 대한 IgA의 검출」란에 기재한 방법에 있어서, 혈액을 상기 유즙으로 바꾼 것 이외에는, 시험예 1과 마찬가지의 방법으로, 유즙 중의 PEDV에 대한 IgA를 검출하여, 시험예 1과 마찬가지의 방법으로 PEDV에 대한 IgA의 산생 유도의 유무를 평가했다. 결과를 하기 표 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure 112019023471809-pct00013
＜자돈의 생존율＞
실시예 3, 비교예 3 및 대조의 임신돈으로부터 태어난 자돈을 야외주 MZ로 공격 후 0일째∼7일째에, 매일, 생존율의 확인을 행하였다. 결과를 하기 표 14에 나타낸다.
[표 14]
Figure 112019023471809-pct00014
＜자돈의 소장의 병리조직학적 관찰＞
상기 「자돈의 장기에 있어서의 PEDV RNA의 검출」시에 적출한 각 자돈의 소장을 포르말린 고정 후, 상법(常法)에 의해 파라핀 절편을 제작했다. 이어서, 크실렌을 이용하여 상기 파라핀 절편으로부터 파라핀을 제거했다. 이어서, 절편의 재수화(再水和)를 위해, 농도 구배를 갖게 한 에탄올 수용액에 절편을 침지하여, 절편의 재수화를 행한 후, 증류수를 이용하여 에탄올을 제거했다. 에탄올을 제거한 절편 표본을, 헤마톡실린액에 20분간 침지한 후, 증류수로 세정하고, 에오신액에 2분간 침지하여 염색했다. 이어서, 농도 구배를 갖게 한 에탄올 수용액에 침지하여 탈수한 후, 크실렌에 침지하여 투철(透徹; clearing)하고, 조직 표본으로 했다. 제작한 조직 표본을 광학 현미경으로 관찰하여, 융모의 위축, 융모 세포의 공포화(vacuolation), 융모의 평탄화 및 융모 기저막의 염증에 관한 종합적인 평가를 이하의 평가 기준에 의거하여 행하였다. 또한, 1마리의 모돈으로부터 수마리의 자돈이 태어났기 때문에, 평가 기준의 스코어는, 실시예 3, 비교예 3 및 대조의 각 군의 자돈의 평균치를 산출하고, 스튜던트의 T검정에 의해 유의차의 확인을 행하였다. 결과를 하기 표 15에 나타낸다.
- 평가 기준 -
「0」: 정상
「1」: 경도
「2」: 중등도
「3」: 중증
[표 15]
Figure 112019023471809-pct00015
본 발명의 양태로는, 예를 들면, 이하의 양태 등을 들 수 있다.
＜1＞　돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 및 경비 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 제 1 투여 공정과,
상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 제 2 투여 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법이다.
＜2＞　아쥬반트가, 마이크로에멀전 아쥬반트인 상기 ＜1＞에 기재한 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법이다.
＜3＞　경구 또는 경비 투여용의 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신, 경구 또는 경비 투여용 아쥬반트, 근육내 투여용의 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신, 및 근육내 투여용 아쥬반트를 갖는 것을 특징으로 하는 백신 키트이다.
＜4＞　경구 또는 경비 투여용 아쥬반트 및 근육내 투여용 아쥬반트가, 마이크로에멀전 아쥬반트인 상기 ＜3＞에 기재한 백신 키트이다.
＜5＞　돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신과 아쥬반트를 근육내 투여하여 후에 추가 면역이 부여되는 돼지에 대하여 이용되고,
상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신 및 아쥬반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구 또는 경비 투여용 백신이다.
＜6＞　아쥬반트가, 마이크로에멀전 아쥬반트인 상기 ＜5＞에 기재한 경구 또는 경비 투여용 백신이다.
＜7＞　돼지 유행성 설사 바이러스의 생백신과 아쥬반트를 경구 투여 또는 경비 투여하여 초회 면역이 부여된 돼지에 대하여 이용되고,
상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 불활화 백신 및 아쥬반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육내 투여용 백신이다.
＜8＞　아쥬반트가, 마이크로에멀전 아쥬반트인 상기 ＜7＞에 기재한 근육내 투여용 백신이다.
본 발명의 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법, 백신 키트, 경구 또는 경비 투여용 백신 및 근육내 투여용 백신은, 돼지 유행성 설사 바이러스에 특이적인 중화 항체의 산생 유도 활성, 및 액성 면역 응답의 유도 활성이 뛰어나기 때문에, 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료에 적합하게 이용 가능하다.
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Claims (8)

  1. 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 생백신과, 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 경구(經口) 투여 및 경비(經鼻) 투여 중 어느 하나로 돼지에게 투여하는 제 1 투여 공정과,
    상기 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 불활화 백신과, 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 근육내 투여로 상기 돼지에게 투여하는 제 2 투여 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사의 예방 또는 치료 방법.
  2. 경구 또는 경비 투여용의 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 생백신, 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 경구 또는 경비 투여용 마이크로에멀전 아쥬반트, 근육내 투여용의 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 불활화 백신 및 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 근육내 투여용 마이크로에멀전 아쥬반트를 갖는 것을 특징으로 하는 백신 키트.
  3. 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 불활화 백신과, 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 근육내 투여하여 후에 추가 면역이 부여되는 돼지에 대하여 이용되고,
    상기 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 생백신 및 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구 또는 경비 투여용 백신.
  4. 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 생백신과, 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 경구 투여 또는 경비 투여하여 초회 면역이 부여된 돼지에 대하여 이용되고,
    상기 돼지 유행성 설사 바이러스 P-5V주의 불활화 백신 및 5nm∼500nm의 입자를 포함하는 마이크로에멀전 아쥬반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 근육내 투여용 백신.
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