TWI770041B - 豬流行性下痢之疫苗套組及其用途 - Google Patents

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Abstract

一種豬流行性下痢之預防或治療方法，其包含將豬流行性下痢病毒之活疫苗與佐劑以經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的第一投予步驟；及將前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑以肌肉內投予對前述豬投予的第二投予步驟。

Description

豬流行性下痢之疫苗套組及其用途
本發明係關於豬流行性下痢(porcine epidemic diarrhea)之預防或治療方法、經口或經鼻投予用疫苗、肌肉內投予用疫苗、及疫苗套組。
豬流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea；PED)係藉由經感染的豬之糞便中所含的PED病毒(PEDV)之經口感染所引起，以水樣性下痢及食慾不振為主要徵狀，於1週齡以下的哺乳豬，顯示極高的致死率的病毒性感染症(參照非專利文獻1)。一旦養豬農場內有PEDV入侵，潔淨化為困難，且於帶來巨大的經濟損害的點成為問題。事實上，近年來豬流行性下痢流行於亞洲各國及以美國為中心的北美大陸，帶來巨大的經濟損失(參照非專利文獻2)。
PEDV之標的為消化道細胞，特別是空腸及迴腸之上皮細胞(參照非專利文獻3)。一般認為一部分的PEDV通過黏膜下的淋巴組織進入血流中，亦有PEDV基因於全身臓器中被檢測出的時期。然而，PEDV並未顯示於其他臓器中的二次性增殖，於消化道上皮細胞中增殖後，自糞便被排泄，而成為新的感染源。於離乳期以後的豬，對PEDV的感受性會降低，即使強迫性地將PEDV經口投予，亦有以無症狀經過的情形。然而，於其他病原體的感染、生產及過密飼育等之緊迫狀況下的豬暴露於PEDV時，亦有暫時性表現食慾不振及下痢等之症狀的情形(參照非專利文獻4)。
抗豬流行性下痢的疫苗(以下，有時稱為「PED疫苗」)，自1990年代後半已於日本、韓國、中國、菲律賓、及美國販售。此等歷來之PED疫苗係基於下列機制來設計：於母豬的妊娠期間中接種，使於分娩後的母豬的乳汁中分泌抗PEDV的中和抗體，哺乳豬經由攝取該乳汁，而使中和於該哺乳豬的消化道內入侵的PEDV(參照非專利文獻5)。哺乳豬不能僅藉由於初乳所含的移行抗體而免於PEDV感染，通過哺乳期間，藉由持續攝取含有由於前述PED疫苗所致的高濃度之抗PEDV的中和抗體的乳汁，可將PEDV中和，藉此可阻止豬流行性下痢的發病、減輕症狀。
然而，一旦仔豬由於某種原因陷入無法攝取乳汁的狀況，有該仔豬感染PEDV而為重症化的問題。又，於PEDV抗體陰性的母豬及免疫程度低的母豬暴露於大量PEDV的情形，亦有伴隨泌乳量的減少而呈現全身症狀，無法充分發揮PED疫苗的效果的問題。
再者，前述歷來的PED疫苗的效果，係由PEDV所引起的症狀的減輕及仔豬的死亡率的降低為界限，於體液性免疫反應的誘導為不充足時，有無法充分誘導IgA抗體的反應的問題(參照非專利文獻6)。
因此，現狀係強烈冀望對於不僅可於乳汁中誘導PEDV特異的中和抗體的產生，且可誘導母豬本身可防禦感染的免疫反應之新穎的抗豬流行性下痢的疫苗、及豬流行性下痢之預防或治療方法之提供。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Zimmerman J. J. et al., Diseases of swine, 10th edition, Wiley-Blackwell 2012
[非專利文獻2]Lee C., Virol J, 2015, Vol.12, p.193
[非專利文獻3]Sueyoshi M. et al., J. Comp. Pathol, 1995, Vol.113(1), pp.59-67
[非專利文獻4]宮▲崎▼綾子、「關於近年流行的豬流行性下痢(PED)」、獸醫免疫學雜誌、2014年、18(1)，pp.85-89
[非專利文獻5]佐藤哲朗、「豬流行性下痢活疫苗之特徵及其效果」、豬雜誌月刊、2014年、2月號、pp.22-25
[非專利文獻6]Song D. et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 2015, Vol.4(2), pp.166-176
[發明概要]
本發明係以解決前述歷來的諸問題，達成以下目的為課題。即，本發明之目的係提供對豬流行性下痢病毒之特異的中和抗體的產生誘導活性為優異、及體液性免疫反應的誘導活性為優異，且可效率佳地預防或治療豬流行性下痢的豬流行性下痢之預防或治療方法、疫苗套組、經口或經鼻投予用疫苗、及肌肉內投予用疫苗。
本發明者們為了達成前述目的而進行深入檢討的結果，發現將豬流行性下痢病毒的活疫苗與佐劑，以經口投予及經鼻投予之任一者投予豬後，藉由經由肌肉內投予豬流行性下痢病毒之不活化疫苗及佐劑進行追加投予時，與歷來之抗豬流行性下痢的疫苗作比較，不僅增強對豬流行性下痢病毒之 特異的中和抗體的產生誘導，亦可對豬流行性下痢病毒誘導特異的IgA抗體。再者，發現此等之抗體被分泌於乳汁中，不僅對仔豬的感染防禦成為可能，對母豬本身的感染防禦亦為可能。
本發明係本發明者們基於前述知識見解，作為用以解決前述課題的手段係如以下所述。即，
<1>一種豬流行性下痢之預防或治療方法，其特徵為包含：藉由將豬流行性下痢病毒之活疫苗與佐劑以經口投予及經鼻投予之任一者，對豬投予的第一投予步驟；及將前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑以肌肉內投予，對前述豬投予的第二投予步驟。
<2>一種疫苗套組，其特徵為具有：經口或經鼻投予用之豬流行性下痢病毒之活疫苗、經口或經鼻投予用佐劑、肌肉內投予用之前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗、及肌肉內投予用佐劑。
<3>一種經口或經鼻投予用疫苗，其特徵為包含前述豬流行性下痢病毒的活疫苗及佐劑，其係用於將豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑進行肌肉內投予後，而賦予追加免疫的豬。
<4>一種肌肉內投予用疫苗，其特徵為包含前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗及佐劑，其係用於將豬流行性下痢病毒之活疫苗與佐劑進行經口投予或經鼻投予，而賦予初次免疫的豬。
依據本發明，可解決歷來的前述諸問題，而達成前述目的，可提供對豬流行性下痢病毒為特異的中和抗體之產生誘導活性優異、及體液性免 疫反應的誘導活性優異，可效率佳地預防或治療豬流行性下痢的豬流行性下痢之預防或治療方法、疫苗套組、經口或經鼻投予用疫苗、及肌肉內投予用疫苗。
[圖1]係呈示PEDV刺突基因(Spike gene)之系統樹解析的結果的圖。
(豬流行性下痢之預防或治療方法)
本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法包含第一投予步驟、及第二投予步驟，因應必要，進一步包含其他步驟。
<第一投予步驟>
前述第一投予步驟係將豬流行性下痢病毒的活疫苗與佐劑以經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的步驟。
<<豬流行性下痢病毒(PEDV)之活疫苗>>
前述PEDV之活疫苗係將PEDV的毒性弱毒化的疫苗。
PEDV係屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)、甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的病毒，被分類為第I群及第II群之二組基因上的分組。
就用於前述PEDV的活疫苗的PEDV之分類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可為前述第I組及前述第II組之任一者。此等之PEDV可使用單獨一種，亦可併用二種以上。
就前述PEDV的取得方法而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，自感染PEDV的豬分離而取得的方法、使用市售品的方法等。
就自感染前述PEDV的豬進行分離而取得的方法之具體例而言，可列舉以下之方法等。
自有豬流行性下痢(PED)發病的豬，採取小腸而調製組織乳劑後，將該組織乳劑經口投予未感染PED的豬，數日後採取該豬的小腸，使用該小腸來調製組織乳劑。適當選擇如此繼代進行次數後，於自最後代獲得的組織乳劑，添加胰蛋白酶使終濃度成為5μg/mL~10μg/mL，接種於融合的Vero細胞，於添加5μg/mL~10μg/mL胰蛋白酶的培養液中培養。以光學顯微鏡每日確認細胞變性效果(CPE)，於確認CPE的時點停止培養。自有確認前述CPE的Vero細胞之培養上清液，依通常方法提取RNA，使用序列識別號1~16所表示的引子序列，進行RT-PCR。其次，依通常方法，將經增幅的RT-PCR產物選殖至任意的載體，而獲得質體。依通常方法解析此質體中的PEDV刺突基因(以下，稱為「PEDVS基因」)的鹼基序列，將解析的各序列片段組合，例如，使用MEGA4.0軟體(http：//www.megasoftware.net)，藉由進行近鄰接合法的系統樹解析，可判別屬於前述第I組及前述第II組之任一種之基因分組的PEDV。
就使用前述市售品的方法之具體例而言，可列舉將市售的活疫苗，接種於Vero細胞而培養的方法等。此情形，較佳可使用未添加胰蛋白酶的培養液。
就屬於前述群組的PEDV而言，可列舉例如，P-5V株(Sato T.et al.,Virus Genes,2011,Vol.43(1),pp.72-78)、CV777株(Pensaert M.B.et al.,Arch.Virol.,1978,Vol.58(3),pp.243-247)、DR13株(Park S.J.et al.，Virus Genes,2007,Vol 35(1),pp.55-64)、96-P4C6株(一般財團法人化學及血清療法研究所Suimugen註冊商標TGE/PED疫苗株)、JS-2004-2株(Zhao P.D.et al.,Can.J.Vet.Res.,2015,Vol.79(1),8-15)、OH851株(Wang L.et al.,Emerg.Infect.Dis.,2014,Vol.20(5), pp.917-919)、CH/FJND-1/2011株(Tian Y.,et al.,Viruses,2013,Vol.5(8),pp.1991-2004)、DX株(Zhao P.D.et al.,Can.J.Vet.Res.,2015,Vol.79(1),8-15)等。
又，藉由前述方法亦可自日生研PED活疫苗(日生研股份有限公司製)而容易地培養前述P-5V株。
就屬於前述第II組的PEDV，例如，MZ0116-2/2013株(參照後述之「試驗例2」)、OKN-1/JPN/2013株(Suzuki T.et al.,Infect.Genet.Evol.2015,Vol.36,pp.363-368)、USA/Colorado/2013株(Marthaler D.et.al.,Genome Announce.,2013,Vol.1(4),pp.e00555-13)、USA/Minnesota188/2014株(Marthaler D.et al.,Emerg.Infect.Dis.,2014,Vol.20(12),pp.2162-2163)等。
就將前述PEDV的毒性弱毒化的方法而言，並未特別限制，可自公知方法之中因應目的加以適當選擇，可列舉例如，將前述PEDV於異種宿主中繼代培養的方法等。
就前述異種宿主而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，培養細胞、發育雞胚等。
就前述第一投予步驟中的前述PEDV的活疫苗之投予量而言，並未特別限制，可考慮投予對象個體的年齡、體重、體質、症狀、將其他成分作為有效成分的醫藥、藥劑的投予的有無等之各式各樣的要因進行適當選擇，每1次投予的病毒含量成為107.0 TCID50以上的投予量(107.0 TCID50/劑以上)為較佳。前述投予量低於107.0 TCID50/劑時，無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形。
<<佐劑>>
就前述佐劑之種類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，鋁鹽、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)、皂素、單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid A：MPL)、微乳化佐劑、霍亂毒素、大腸菌易熱性毒素、CpG寡核苷酸、聚肌胞苷酸(polyinosine polycytidic acid)(poly(I：C))、聚合物佐劑、鯊烯、糊精衍生物、流動石蠟、生育酚乙酸酯、聚山梨醇酯等。前述佐劑可單獨使用一種，亦可併用二種以上。
此等之中，微乳化佐劑、霍亂毒素、大腸菌易熱性毒素、CpG寡核苷酸、聚肌胞苷酸(poly(I：C))、聚合物佐劑、鯊烯等為較佳，微乳化佐劑為特佳。
前述微乳化佐劑係由分散於水中的微小油性粒子而成者。前述微小油性粒子係指輕質礦物油與界面活性劑加以混合，於水中藉由乳化而使形成5nm~500nm的粒子。
就前述輕質礦物油而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，流動石蠟、醚化流動石蠟、輕質流動石蠟(日本藥典)等。此等輕質礦物油可單獨使用一種，亦可併用二種以上。
就前述流動石蠟而言，可列舉例如，商品名為MARCOL(商標)52(商品名，Exxon Mobil公司製)、Penreco(註冊商標)Drakeol(註冊商標)6VR(商品名，Penreco公司製)等。
就前述微乳化佐劑中的前述輕質礦物油之含量而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但0.001質量%~10.0質量%為較佳，0.01質量%~0.1質量%為更佳。前述輕質礦物油之含量低於0.001質量%時，粒子變得不安定，超過10.0質量%時，可能對接種對象的動物造成接種物的殘留。
就前述界面活性劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，二縮甘露醇單油酸(mannide monooleic acid)、油酸縮甘露醇酯(oleic acid mannitan ester)之乙氧基化衍生物、甘油單硬脂酸酯(glyceryl monostearate)、十甘油單月桂酸酯(decaglyceryl monolaurate)、脫水山梨醇單油酸酯(sorbitan monooleate)、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯(polyoxyethylene(20)sorbitan monopalmitate)等。此等之界面活性劑可單獨使用一種，亦可併用二種以上。
就前述微乳化佐劑中的前述界面活性劑的含量而言，只要可將前述輕質礦物油加以乳化而進行微乳化即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
前述微乳化佐劑可進一步包含螯合劑。前述微乳化佐劑包含螯合劑時，於將結合於前述微小油性微粒子的抗原(PEDV)加以安定化、或發揮協助微小油性粒子對免疫担當細胞的結合的作用的點為有利。
就前述螯合劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸錳、水楊酸鋁、可溶性乙酸鋁等之多離子性酸複合體等。此等之螯合劑可單獨使用一種，亦可併用二種以上。
就前述微乳化佐劑中的前述螯合劑的含量而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但0.002質量%~30質量%為較佳，0.01質量%~15質量%為更佳。前述螯合劑之含量低於0.002質量%時，有無法增強免疫反應活性的情形，超過30質量%時，有對接種動物帶來副作用的情形。
就調製含有前述螯合劑的微乳化佐劑的方法而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於水中添加前述輕質礦物油、前 述界面活性劑、及前述螯合劑，藉由公知之乳化手段加以乳化，而作成微乳化佐劑的方法等，具體而言，可使用特開2004-131417號公報、特開2005-75752號公報記載的方法等。又，前述微乳化佐劑可使用市售品，就市售品的具體例而言，可列舉MONTANIDE IMS系列之IMS 1312 VG、IMS 1313 VG、IMS 251C、IMS 2215 VG、IMS 3012 VG ST(任一者皆為SEPPIC公司製)等。
就前述第一投予步驟中的前述佐劑的投予量而言，只要無損前述PEDV的活疫苗的效果即可，並未特別限制，可考慮佐劑的種類、有無其他成分作為有效成分的醫藥或藥劑的投予、投予對象個體的年齡、體重、體質、症狀等之各式各樣的要因而加以適當選擇。
前述佐劑為前述微乳化佐劑的情形之投予量亦未特別限制，但含前述微乳化佐劑與前述含PEDV的活疫苗的病毒液之體積比成為20/80~80/20的投予量為較佳，成為50/50的投予量為特佳。前述體積比(微乳化佐劑/含PEDV的活疫苗的病毒液)為低於20/80時，無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形，超過80/20時，有引起投予部位的腫脹、硬結、發紅、發熱、過敏性休克等、或無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，無法預防或治療豬流行性下痢等。
就將前述PEDV之活疫苗與前述佐劑以經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的時期而言，只要可獲得前述佐劑的佐劑效果，且為前述第二投予步驟之前即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，前述PEDV的活疫苗與前述佐劑，可同時投予，亦可各別投予，但於簡便的觀點，同時投予為較佳。
就以前述PEDV之活疫苗與前述佐劑同時經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的方法而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，投予前述PEDV的活疫苗與前述佐劑混合的組成物的方法等。
就混合前述PEDV之活疫苗與前述佐劑的組成物而言，適合使用於後述的本發明之經口或經鼻投予用疫苗。
將前述PEDV之活疫苗與前述佐劑各別以經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的情形，就前述PEDV之活疫苗與前述佐劑之投予順序而言，只要可獲得前述佐劑之佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
又，就前述PEDV之活疫苗與前述佐劑之投予間隔而言，只要可獲得前述佐劑之佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
就進行前述第一投予步驟的次數而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。本發明於即使進行一次前述第一投予步，亦可獲得充分的效果的點為有利的。
<第二投予步驟>
前述第二投予步驟係將前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑，以肌肉內投予，對前述第一投予步驟後之豬進行投予的步驟。
<<豬流行性下痢病毒(PEDV)之不活化疫苗>>
PEDV之不活化疫苗係將PEDV的病原性去除或將毒素無毒化的疫苗。
就用於前述PEDV之不活化疫苗的PEDV的分類、取得方法等，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於前述第一投予步驟中之PEDV的活疫苗的項目中記載的態樣等。
將就前述PEDV之感染能力不活化的方法而言，並未特別限制，可由公知之方法中因應目的加以適當選擇，可列舉例如，將前述PEDV以福馬林等之藥劑進行處理的方法、加熱的方法、使pH變化的方法、照射伽瑪射線的方法、照射紫外線的方法等。
於前述PEDV之不活化疫苗所使用的PEDV，可將經分離的病毒直接不活化，亦可將前述弱毒化的PEDV不活化。
就前述第二投予步驟中的前述PEDV的不活化疫苗之投予量而言，並未特別限制，可考慮投予對象個體之年齡、體重、體質、症狀、有無將其他成分作為有效成分的醫藥或藥劑等之各式各樣要因而加以適宜選擇，但每1次的投予的病毒含量成為106.5 TCID50以上的投予量(106.5 TCID50/劑以上)為較佳，成為107.5 TCID50以上的投予量(107.5 TCID50/劑以上)為更佳。前述投予量低於106.5 TCID50/劑時，無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形。
<<佐劑>>
就前述佐劑之種類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於前述第一投予步驟中之佐劑項目中記載者等。
其中，鋁鹽、微乳化佐劑、聚合物佐劑、糊精衍生物、流動石蠟、鯊烯、生育酚乙酸酯、聚山梨醇酯等為較佳，微乳化佐劑為特佳。
前述微乳化佐劑之態樣與於前述第一投予步驟之中的佐劑項目中記載者相同。
就前述第二投予步驟中的前述佐劑的投予量而言，只要無損前述PEDV之不活化疫苗的效果即可，並未特別限制，可考慮佐劑的種類、有無 將其他成分作為有效成分的醫藥或藥劑的投予、投予對象個體之年齡、體重、體質、症狀等之各式各樣的要因而加以適當選擇。
前述佐劑為前述微乳化佐劑的情形之投予量亦為特別限制，但前述微乳化佐劑與前述含PEDV之不活化疫苗的病毒液之體積比成為20/80~80/20的投予量為較佳，成為50/50的投予量為特佳。前述體積比(微乳化佐劑/含PEDV之不活化疫苗的病毒液)為低於20/80時，無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形，超過80/20時，有引起投予部位之腫脹、硬結、發紅、發熱、過敏性休克等、或無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，而無法預防或治療豬流行性下痢等。
就將前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑以肌肉內投予，對前述豬投予的時期而言，有獲得前述佐劑之佐劑效果，且只要為前述第一投予步驟之後即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑，可同時投予，亦可各別投予，但於簡便的觀點，同時投予為較佳。
就將前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑同時以肌肉內投予，對前述豬投予的方法而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，投予將前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑混合的組成物的方法等。
就將前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑混合的組成物而言，適合使用後述的本發明之肌肉內投予用疫苗。
將前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑以各別肌肉內投予，對前述豬投予的情形，就前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑之投予順序而言， 只要可獲得前述佐劑的佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
又，就前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑之投予間隔而言，只要可獲得前述佐劑之佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
就進行前述第二投予步驟的次數而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。本發明即使僅進行一次前述第二投予步驟，亦可獲得充分的效果的點為有利的。
就前述第一投予步驟與前述第二投予步驟之投予間隔而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但1週~20週為較佳，2週~10週為更佳，4週~10週為特佳。前述投予間隔低於1週時，無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形，超過20週時，亦有無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形。
(疫苗套組)
本發明之疫苗套組具有經口或經鼻投予用之豬流行性下痢病毒的活疫苗、經口或經鼻投予用佐劑、肌肉內投予用之前述豬流行性下痢病毒的不活化疫苗、及肌肉內投予用佐劑，因應必要，進一步具有其他的構成。
<經口或經鼻投予用之豬流行性下痢病毒(PEDV)的活疫苗>
就用於前述經口或經鼻投予用之PEDV活疫苗的PEDV的分類、取得方法、將PEDV的毒性弱毒化的方法等，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，上述的本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第一投予步驟中的PEDV之活疫苗項目中所記載者等。
就前述疫苗套組中的前述經口或經鼻投予用之PEDV活疫苗的病毒含量而言，並未特別限制，可因應使用次數等加以適當選擇。前述經口或經鼻投予用之PEDV活疫苗的每一次投予的病毒含量，較佳107.0 TCID50/劑以上。又，前述經口或經鼻投予用之PEDV活疫苗，於前述疫苗套組之使用時，可考慮投予對象個體之年齡、體重、體質、症狀、有無將其他成分作為有效成分的醫藥或藥劑之投予等之各式各樣的要因而加以適當選擇，藉由稀釋等加以調整。
<經口或經鼻投予用佐劑>
就前述經口或經鼻投予用佐劑之種類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第一投予步驟中的佐劑項目中記載者等。
其中，微乳化佐劑、霍亂毒素、大腸菌易熱性毒素、CpG寡核苷酸、聚肌胞苷酸(poly(I：C))、聚合物佐劑、鯊烯等為較佳，微乳化佐劑為特佳。
前述微乳化佐劑之態樣，係與上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第一投予步驟中的佐劑項目中記載者相同。
就前述疫苗套組中的前述經口或經鼻投予用佐劑之量而言，並未特別限制，可因應使用次數、前述含經口或經鼻投予用之PEDV活疫苗的病毒液的量等加以適當選擇。
前述疫苗套組可具有將前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗、與前述經口或經鼻投予用佐劑作為個別的構成，亦可具有混合此等的組成物之狀態。
就混合前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑的組成物而言，可適合使用後述的本發明之經口或經鼻投予用疫苗。
<肌肉內投予用之豬流行性下痢病毒(PEDV)的不活化疫苗>
就前述肌肉內投予用之PEDV不活化疫苗所使用的PEDV的分類、取得方法、將PEDV的感染能力不活化的方法等而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第二投予步驟中的PEDV之不活化疫苗項目中記載的態樣等。
就前述疫苗套組中的前述肌肉內投予用之PEDV不活化疫苗的病毒含量而言，並未特別限制，可因應使用次數等加以適當選擇。前述肌肉內投予用之PEDV不活化疫苗的每一次的投予的病毒含量係106.5 TCID50/劑以上為較佳，107.5 TCID50/劑以上為更佳。又，前述肌肉內投予用之PEDV不活化疫苗，於前述疫苗套組之使用時，可考慮投予對象個體之年齡、體重、體質、症狀、有無其他成分作為有效成分的醫藥或藥劑的投予等之各式各樣要因而加以適當選擇，藉由稀釋等加以調整。
<肌肉內投予用佐劑>
就前述肌肉內投予用佐劑之種類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法的第一投予步驟中的佐劑項目中記載者等。
此等中，以鋁鹽、微乳化佐劑、聚合物佐劑、糊精衍生物、流動石蠟、鯊烯、生育酚乙酸酯、聚山梨醇酯等為較佳，微乳化佐劑為特佳。
前述微乳化佐劑之態樣係與上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法的第一投予步驟中的佐劑項目中記載者相同。
就前述疫苗套組中的前述肌肉內投予用佐劑之量而言，並未特別限制，可因應使用次數、前述肌肉內投予用之含PEDV不活化疫苗的病毒液之量等加以適當選擇。
前述疫苗套組可具有前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗、與前述肌肉內投予用佐劑為個別的構成，亦可具有混合此等的組成物之狀態。
就將前述肌肉內投予用之PEDV不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑混合的組成物而言，適合用於後述本發明之肌肉內投予用疫苗。
<其他構成>
就前述其他構成而言，只要無損本發明之效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，溶解液、稀釋用生理食鹽水、使用前調製用之容器、注射器、注射針、包裝說明書等。
就前述溶解液之組成而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，後述本發明之經口或經鼻投予用疫苗中之其他成分項目中記載者。
<使用方法>
前述疫苗套組係將前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑經口投予或經鼻投予後，將前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑進行肌肉內投予來使用。
前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑係可同時投予，亦可各別投予，但於簡便的觀點，同時投予為較佳。
於將前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑同時經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的情形，較佳使用將前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑混合的前述組成物。
於將前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑各別經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的情形，就前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑之投予順序而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
又，就前述經口或經鼻投予用之PEDV的活疫苗與前述經口或經鼻投予用佐劑之投予間隔而言，只要可獲得前述經口或經鼻投予用佐劑之佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑係可同時投予，亦可各別投予，但於簡便的觀點，同時投予為較佳。
於將前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑同時地以肌肉內投予對前述豬投予的情形，較佳使用將前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑混合的前述組成物。
於將前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑各別地以肌肉內投予對前述豬投予的情形，就前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑之投予順序而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
又，就前述肌肉內投予用之PEDV的不活化疫苗與前述肌肉內投予用佐劑之投予間隔而言，只要可獲得前述肌肉內投予用佐劑之佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
前述疫苗套組係可適合使用於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法。
(經口或經鼻投予用疫苗)
本發明之經口或經鼻投予用疫苗係含有豬流行性下痢病毒之活疫苗及佐劑，因應必要，進一步包含其他成分。
前述經口或經鼻投予用疫苗係用於將豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑進行肌肉內投予後，賦予追加免疫的豬。
<豬流行性下痢病毒(PEDV)之活疫苗>
就於PEDV之活疫苗所使用的PEDV之分類、取得方法、將PEDV之毒性弱毒化的方法等而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第一投予步驟中的PEDV的活疫苗項目中記載的態樣等。
就前述經口或經鼻投予用疫苗中的前述PEDV之活疫苗的含量而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但107.0 TCID50/劑以上為較佳。前述含量低於107.0 TCID50/劑時，有無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，無法預防或治療豬流行性下痢的情形。
<佐劑>
就前述佐劑之種類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法的第一投予步驟中之佐劑項目中記載者等。
此等之中，微乳化佐劑、霍亂毒素、大腸菌易熱性毒素、CpG寡核苷酸、聚肌胞苷酸(poly(I：C))、聚合物佐劑、鯊烯等為較佳，微乳化佐劑為特佳。
前述微乳化佐劑之態樣係與上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第一投予步驟中的佐劑項目中記載者相同。
就前述經口或經鼻投予用疫苗中的前述佐劑之含量而言，只要無損前述PEDV之活疫苗效果，獲得佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
前述佐劑為前述微乳化佐劑的情形，就前述經口或經鼻投予用疫苗中的前述微乳化佐劑之含量而言，亦未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但20體積%~80體積%為較佳，50體積%為特佳。前述微乳化之含量低於20體積%時，有無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，無法預防或治療豬流行性下痢的情形，超過80體積%時，有引起投予部位之腫脹、硬結、發紅、發熱、過敏性休克等、或無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，而無法預防或治療豬流行性下痢等情形。
<其他成分>
就前述其他成分而言，並未特別限制，可因應目的，由藥理學上可容許的載體中適當選擇，可列舉例如，添加劑、輔助劑、水等。此等可單獨使用一種，亦可併用二種以上。
就前述添加劑或前述輔助劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，殺菌劑、保存劑、黏結劑、增黏劑、固著劑、結合劑、著色劑、安定化劑、pH調整劑、緩衝劑、等張化劑、溶劑、抗氧化劑、紫外線防止劑、結晶析出防止劑、消泡劑、物性提升劑、防腐劑等。
就前述殺菌劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、氯化本索寧(benzethonium chloride)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)等之陽離子性界面活性劑等。
就前述保存劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、甲酚、硫柳汞、苯氧基乙醇等。
就前述黏結劑、前述增黏劑、或前述固著劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，澱粉、糊精、纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羧基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基澱粉、聚三葡萄糖(pullulan)、褐藻酸鈉、褐藻酸銨、褐藻酸丙二醇酯、瓜爾膠(Guar gum)、刺槐豆膠(locust bean gum)、阿拉伯膠、黃原膠、明膠、酪蛋白、聚乙烯醇、聚氧化乙烯(polyethylene oxide)、聚乙二醇、乙烯‧丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮等。
就前述結合劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、澱粉液、明膠液、羧基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基澱粉、甲基纖維素、乙基纖維素、蟲膠、磷酸鈣、聚乙烯吡咯烷酮等。
就前述著色劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，氧化鈦、氧化鐵等。
就前述安定化劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，黃蓍膠(tragacanth)、阿拉伯膠、明膠、焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫乙醇酸(thioglycolic acid)、硫乳酸等。
就前述pH調整劑或前述緩衝劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉等。
就前述等張化劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖等。
就前述經口或經鼻投予用疫苗中的前述其他成分之含量而言，只要無損本發明之效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
<劑型>
就前述經口或經鼻投予用疫苗之劑型而言，只要可經口投予或經鼻投予即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，固形劑、液劑等。其中，就前述經口投予用疫苗而言，前述固形劑、前述液劑等為較佳，就前述經鼻投予用疫苗而言，前述液劑為較佳。
-固形劑-
就前述固形劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，硬膠囊劑、軟膠囊劑等。
-液劑-
就前述液劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但呈經口投予用疫苗使用的情形，可列舉例如，糖漿劑、飲料劑、懸浮劑、酒精劑、混餌劑等。
前述液劑呈經鼻投予用疫苗使用的情形，可列舉例如，液劑、點眼劑、氣溶膠劑、噴霧劑等。
<製造方法>
就製造前述經口或經鼻投予用疫苗的方法而言，只要可混合前述PEDV之活疫苗與前述佐劑即可，並未特別限制，可因應劑型等，由公知之方法中，因應目的加以適當選擇。
<使用>
前述經口或經鼻投予用疫苗係用於將PEDV之不活化疫苗與佐劑作肌肉內投予後，賦予追加免疫的豬。
就前述對豬賦予追加免疫的方法而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但較佳使用前述豬流行性下痢之預防或治療方法之前述第二步驟記載之方法。
前述經口或經鼻投予用疫苗可單獨使用一種，亦可與將其他成分作為有效成分的醫藥併用。又，前述經口或經鼻投予用疫苗可以配合將其他成分作為有效成分的醫藥、飼料、飲水等的狀態下使用。
前述經口或經鼻投予用疫苗，之後藉由將PEDV之不活化疫苗與佐劑進行肌肉內投予而賦予追加免疫，因可誘導對PEDV的特異的中和抗體的產生，進一步藉由體液性免疫反應亦誘導對PEDV之特異的IgA的產生，可效率佳地預防或治療豬流行性下痢。
前述經口或經鼻投予用疫苗因不僅可直接對母豬投予，亦可直接對仔豬投予，即使對因某些原因無法攝取乳汁的仔豬、或母豬之乳汁中的抗PEDV的中和抗體濃度低的情形，亦可預防或治療仔豬之對PEDV的感染的觀點為有利的。
(肌肉內投予用疫苗)
本發明之肌肉內投予用疫苗包含豬流行性下痢病毒之不活化疫苗及佐劑，因應必要，進一步含有其他成分。
前述肌肉內投予用疫苗係用於將豬流行性下痢病毒之活疫苗與佐劑作經口或經鼻投予而賦予初次免疫的豬。
<豬流行性下痢病毒(PEDV)之不活化疫苗>
就於PEDV之不活化疫苗所使用的PEDV的分類、取得方法、將PEDV之感染能力不活化的方法等，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第二投予步驟中的PEDV的不活化疫苗項目中所記載的態樣等。
就前述肌肉內投予用疫苗中的前述PEDV的不活化疫苗的含量而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但106.5 TCID50/劑上為較佳，107.5 TCID50/劑以上為更佳。前述含量低於106.5 TCID50/劑時，無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形。
<佐劑>
就前述佐劑之種類而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法之第一投予步驟中的佐劑項目中記載者等。
此等中，鋁鹽、微乳化佐劑、聚合物佐劑、糊精衍生物、流動石蠟、鯊烯、生育酚乙酸酯、聚山梨醇酯等為較佳，微乳化佐劑為特佳。
前述微乳化佐劑之態樣，係與上述本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法的第一投予步驟中的佐劑項目中記載者相同。
就前述肌肉內投予用疫苗中的前述佐劑之含量而言，只要無損前述PEDV之不活化疫苗的效果，獲得佐劑效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
前述佐劑於前述微乳化佐劑的情形，亦為前述肌肉內投予用疫苗中的前述微乳化佐劑之含量，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但20體積%~80體積%為較佳，50體積%為特佳。前述微乳化之含量低於20體積%時，無法誘導PEDV特異的中和抗體之產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢的情形，超過80體積%時，有引起投予部位的腫脹、硬結、發紅、發熱、過敏性休克等，或無法誘導PEDV特異的中和抗體的產生或體液性免疫反應，有無法預防或治療豬流行性下痢等情形。
<其他成分>
就前述其他成分而言，並未特別限制，可由藥理學上可容許的載劑中，因應目的加以適當選擇，可列舉例如，於前述經口或經鼻投予用疫苗之其他成分的項目所記載者等。
就前述肌肉內投予用疫苗中的前述其他成分之含量而言，只要無損本發明之效果即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇。
<劑型>
就前述肌肉內投予用疫苗之劑型而言，只要可肌肉內投予即可，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，注射劑等。
-注射劑-
就前述注射劑而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，可列舉例如，溶液、懸浮液、使用前溶解用固形劑等。
<製造方法>
就製造前述肌肉內投予用疫苗的方法而言，只要可將前述PEDV之不活化疫苗與前述佐劑加以混合即可，並未特別限制，可因應劑型等，由公知之方法之中，因應目的加以適當選擇。
<使用>
前述肌肉內投予用疫苗係用於將PEDV之活疫苗與佐劑進行經口或經鼻投予而賦予初次免疫的豬。
就前述對豬賦予初次免疫的方法而言，並未特別限制，可因應目的加以適當選擇，但較佳使用於前述豬流行性下痢之預防或治療方法之前述第一步驟所記載的方法。
前述肌肉內投予用疫苗可單獨使用一種，亦可與將其他成分作為有效成分的醫藥併用。又，前述肌肉內投予用疫苗係可摻合於將其他成分作為有效成分的醫藥中的狀態下使用。
前述肌肉內投予用疫苗，藉由用於將PEDV之活疫苗與佐劑經口投予或經鼻投予而賦予初次免疫的豬，因可誘導對PEDV特異的中和抗體之產生，進一步藉由體液性免疫反應，亦可誘導對PEDV特異的IgA之產生，故可效率佳地預防或治療豬流行性下痢。
前述肌肉內投予用疫苗因不僅可對母豬直接投予，亦可對仔豬直接投予，於某種原因無法攝取乳汁的仔豬、或於母豬之乳汁中之抗PEDV的中和抗體的濃度為低的情形，亦可預防或治療仔豬之對PEDV的感染的觀點，為有利的。
[實施例]
以下，列舉實施例等而具體地說明本發明，但本發明並未受限於此等實施例。
(製造例1)
<PEDV(P-5V株)活疫苗1之製造>
<<PEDV之P-5V株的分離及製作>>
自野外有豬流行性下痢(PED)症狀的仔豬採取小腸，作成10質量%組織乳劑。將此10%組織乳劑，經口投予無感染PED的仔豬，2日後，採取小腸，製作10質量%組織乳劑。以相同方法，於未感染PED的仔豬繼代3代。於自第三次繼代的仔豬所獲得的組織乳劑中添加胰蛋白酶至終濃度成為10μg/mL，接種於事先於25cm2培養燒瓶中融合的Vero細胞，於37℃培養60分鐘。之後，添加以下記載的方法所調製的培養液(以下，有時稱為「10μg/mL胰蛋白酶加培養液」)5mL，並於37℃培養。以光學顯微鏡每日確認細胞變性效果(CPE)，於確認有CPE的時點，停止培養，進行繼代。分離的病毒之繼代係隨著繼代進展而逐漸減少胰蛋白酶添加量，最終地作成未添加胰蛋白酶，繼代至總繼代數100代。
-添加10μg/mL胰蛋白酶培養液-
於500mL之最小必須培養基(Minimal Essential Media)(MEM)(Thermo Fisher Scientific公司製)中溶解酵母萃取物(Difco Laboratories公司製)成終濃度0.02%(w/v)及溶解胰蛋白腖磷酸鹽肉湯(Tryptose phosphate broth)(Difco Laboratories公司製)成終濃度0.03%(w/v)，再溶解青黴素(penicillin)50,000單位、鏈黴素(streptomycin)50mg、及胰蛋白酶成為終濃度10μg/mL。
<<P-5V株的鑑定>>
使用TRIZol(註冊商標)試藥(Thermo Fisher Scientific公司製)，自P-5V株之培養上清液，提取病毒RNA。將PEDV RNA，藉由使用SuperScript(註冊商標)III One-Step RT-PCR System(Thermo Fisher Scientific公司製)及下述表1所示的8種類之PEDVS基因特異性引子組(引子組1~8)的RT-PCR，以熱循環器(Veriti 96-Well Thermal Cycler、Thermo Fisher Scientific公司製)增幅。經增幅的RT-PCR產物，使用熱休克法，於pCR(商標註冊)2.1-TOPO TA載體(Thermo Fisher Scientific公司製)，轉形於大腸菌TOP10(Thermo Fisher Scientific公司製)，並選殖。將大腸菌使用LB培養基(組成：氯化鈉10g、Bacto Trypton 10g、酵母萃取物5g溶解於1L之蒸餾水)，於37℃培養一晚後，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司製)，純化質體。自純化的質體，藉由BigDye(註冊商標)Terminator v3.1試藥及3130x1基因分析儀(Genetic analyzer)(Applied Biosystems公司製)，解讀PEDV S基因鹼基序列。將經解讀的各序列片段組合，使用MEGA4.0軟體(http：//www.megasoftware.net)，進行利用近鄰接合法的系統樹解析。
其結果，上述所獲得的株鑑定為PEDV之遺傳學的群組I之P-5V株(參照圖1)。
Figure 106125846-A0305-02-0029-1
Figure 106125846-A0305-02-0030-2
<<PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1之調製>>
將前述P-5V株接種於Vero細胞，於37℃培養3日後，回收Vero細胞，冷凍解凍。其次，將前述冷凍解凍物離心分離，將獲得的上清液，回收作為「PEDV(P-5V株)病毒抗原液1」。對前述PEDV(P-5V株)病毒抗原液1，各自添加7.5%(w/v)之聚乙二醇6000、及1M之氯化鈉，於4℃攪拌一晚後，離心分離並回收沉澱物。以前述PEDV(P-5V株)病毒抗原液1之1/20量(v/v)的生理食鹽水將前述沉澱物溶解後，再次進行離心分離，將獲得的上清液回收作為「PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1」。
-病毒力價的測定-
藉由50%組織培養感染值量(50% Tissue Culture Infective Dose：TCID50)法，測定前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1之病毒力價(病毒感染價)。
具體而言，將Vero細胞，以0.75×106細胞/0.5ml/井，接種於24井細胞培養盤，並於37℃培養3日。將測定對象的抗原液(其中，前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1)，以培養液10倍階段稀釋，該培養液係將酵母萃取物(Difco Laboratories公司製)溶解成終濃度0.02%(w/v)及將胰蛋白腖磷酸鹽肉湯(Difco Laboratories公司製)溶解成終濃度0.03%(w/v)的培養液(500mL之MEM(Thermo Fisher Scientific公司製)，進一步溶解青黴素50,000單位、鏈黴素50mg)，接種於Vero細胞後，於37℃培養90分鐘。交換培養液後，於37℃培養7日。以光學顯微鏡觀察細胞變性效果(CPE)，按照Reed-Muench法算出病毒力價(TCID50)。
其結果，前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1之病毒力價為107.75 TCID50/mL。
<<PEDV(P-5V株)活疫苗1之調製>>
將前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1與微乳液(商品名：MONTANIDE IMS1313 VG、SEPPIC公司製)等量(v/v)混合，於室溫(25±5℃)攪拌5分鐘以上，作為「PEDV(P-5V株)活疫苗1」。
(製造例2)
<PEDV(P-5V株)活疫苗2之製造>
<<PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液2之調製>>
將製造例1中分離及製作的PEDV的P-5V株接種於Vero細胞，於37℃培養3日後，回收Vero細胞並冷凍解凍。接著，將前述冷凍解凍物離心分離，將獲得的上清液回收作為「PEDV(P-5V株)病毒抗原液2」。對前述PEDV(P-5V株)病毒抗原液2，各自添加7.5%(w/v)之聚乙二醇6000、及1M之氯化鈉，於4℃攪拌一晚後，回收經離心分離的沉澱物。以前述PEDV(P-5V株)病毒抗原液 2之1/20量(v/v)的生理食鹽水將前述沉澱物溶解後，再次進行離心分離，將獲得的上清液回收作為「PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液2」。
將前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液2之病毒力價，藉由前述製造例1之「病毒力價的測定」欄中記載之TCID50法來測定。其結果，前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液2之病毒力價為107.75 TCID50/mL。
<<PEDV(P-5V株)活疫苗2之調製>>
將前述PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液2與製造例1調製的微乳液以等量(v/v)混合，於室溫(25±5℃)攪拌5分鐘以上，作為「PEDV(P-5V株)活疫苗2」。
(製造例3)
<PEDV(P-5V株)不活化疫苗1之製造>
<<PEDV(P-5V株)不活化病毒抗原液1之調製>>
對製造例1所獲得的PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液1，添加中性緩衝福馬林(關東化學股份有限公司製)成為終濃度0.2%(v/v)，於4℃攪拌48小時，藉由將前述PEDV(P-5V株)病毒抗原不活化，獲得「PEDV(P-5V株)不活化病毒抗原液1」。
<<PEDV(P-5V株)不活化疫苗1之調製>>
將前述PEDV(P-5V株)不活化病毒抗原液1與製造例1調製的微乳液以等量(v/v)混合，於室溫(25±5℃)攪拌5分鐘以上，作為「PEDV(P-5V株)不活化疫苗1」。
(製造例4)
<PEDV(P-5V株)不活化疫苗2之製造>
<<PEDV(P-5V株)不活化病毒抗原液2之調製>>
對製造例2所獲得的PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液2，添加中性緩衝福馬林(關東化學股份有限公司製)成為終濃度0.2%(v/v)，於4℃攪拌48小時，藉由將前述PEDV(P-5V株)病毒抗原不活化，獲得「PEDV(P-5V株)不活化病毒抗原液2」。
<<PEDV(P-5V株)不活化疫苗2之調製>>
將前述PEDV(P-5V株)不活化病毒抗原液2與製造例1所調製的微乳液以等量(v/v)混合，於室溫(25±5℃)攪拌5分鐘以上，作為「PEDV(P-5V株)不活化疫苗2」。
(實施例1)
<初次免疫>
於PED抗體陰性之8週齡豬，經口投予一次製造例1所製造的PEDV(P-5V株)活疫苗1(10mL、108.0 TCID50/劑)。
<追加免疫>
自前述初次免疫4週後，將製造例3所製造的PEDV(P-5V株)不活化疫苗1(2mL、107.5 TCID50/劑)肌肉內投予(注射)一次。
(比較例1)
<初次免疫>
於PED抗體陰性之8週齡豬，將製造例1所獲得的PEDV(P-5V株)濃縮病毒抗原液(10mL、108.0 TCID50/劑)經口投予一次。
<追加免疫>
自前述初次免疫4週後，將製造例3所製造的PEDV(P-5V株)不活化疫苗1(2mL、107.5 TCID50/劑)肌肉內投予(注射)一次。
(比較例2)
<初次免疫>
於PED抗體陰性之8週齡豬，肌肉內投予(注射)日生研PED活疫苗(日生研股份有限公司製)(2mL)一次。
<追加免疫>
自前述初次免疫4週後，將日生研PED活疫苗(日生研股份有限公司製)(2mL)肌肉內投予(注射)一次。
Figure 106125846-A0305-02-0034-3
(試驗例1)
於實施例1、比較例1、及比較例2之豬，正要初次免疫之前及追加免疫1週後，各自採取血液。又，作為對照，於未進行初次免疫及追加免疫的PED抗體陰性之8週齡豬，亦於8週齡、12週齡、及13週齡的時點採取血液。接 著，藉由以下所示的方法，調查採取的血液中之PEDV中和抗體價的測定、及對PEDV的IgA之產生誘導。
<PEDV中和抗體價之測定>
將Vero細胞以0.75×106細胞/0.5ml/井，接種於24井細胞培養盤，於37℃培養3日。以培養液(500mL之MEM(Thermo Fisher Scientific公司製)中溶解酵母萃取物(Difco Laboratories公司製)成為終濃度0.02%(w/v)及溶解胰蛋白腖磷酸鹽肉湯(Difco Laboratories公司製)成為終濃度0.03%(w/v)，再溶解青黴素50,000單位、鏈黴素50mg)2倍階段稀釋的豬血清，混合含有等量之P-5V株(200 TCID50)的病毒液，於37℃使反應90分鐘。將血清與P-5V株的混合液，接種於前述Vero細胞，並於37℃培養90分鐘。將培養液交換後，於37℃培養7日。以光學顯微鏡觀察細胞變性效果(CPE)，並測定PEDV中和抗體價。將結果示於下述表3。又，中和抗體價的單位以血清的稀釋倍率(倍)表示。
<抗PEDV的IgA之產生誘導>
<<利用西方墨點轉漬法(Western blot)之抗PEDV的IgA之檢測>>
實施例1、比較例1、及比較例2之追加免疫1週後，將採取的血液各自離心分離，而將血清分離。將含有P-5V株(107.0 TCID50/mL)的病毒液200μL以SDS-PAGE凝膠泳動後，轉漬至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)(PVDF)過濾膜(Merck Millipore公司製)。使用作為1次抗體之以3%(w/v)脫脂牛奶及0.05%(w/v)Tween20的PBS(組成：將NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4/12H2O 2.9g、及KH2PO4 0.2g溶解蒸餾水1L。於以下之試驗例亦作成相同組成)作100倍稀釋的豬血清，使用作為2次抗體之HRP標識抗豬IgA多株抗體(Acris Antibodies公司製)，藉由檢測試藥(商品名：ECL Prime Western Blotting Detection Reagent、GE Healthcare公司製)，檢測抗PEDV的IgA。
西方墨點轉漬法之結果，基於以下的評價基準，評價抗PEDV的IgA之產生誘導的有無。將結果示於下述表3。
-評價基準-
「-」：無抗PEDV的IgA的產生誘導活性(西方墨點轉漬法的帶未檢測出來)
「+」：有抗PEDV的IgA的產生誘導活性(有西方墨點轉漬法的帶檢測出來)
Figure 106125846-A0305-02-0036-4
於初次免疫將含佐劑的PEDV(P-5V株)活疫苗經口投予的情形(實施例1)，與將未含佐劑的PEDV經口投予的情形(比較例1)、將歷來的肌肉內投予用疫苗2次投予的情形(比較例2)比較，觀察到顯著的PEDV特異的中和抗體之產生增強活性、及PEDV特異的IgA之產生誘導活性。
(試驗例2)
對實施例1及比較例1之豬，自追加免疫2週後，將各自以下列方法分離及作出的野外株的MZ0116-2/2013株(以下，稱為「野外株MZ」)(105.0 TCID50/mL)5mL經口投予而攻撃。又，作為對照，未進行初次免疫及追加免疫的PED抗體陰性之14週齡豬，亦同樣地，將野外株MZ(105.0 TCID50/mL)5mL經口投予而攻撃。接著，以下列所示的方法，進行臨床症狀的觀察、糞便中之PEDV RNA的檢測、及臓器中PEDV RNA的檢測。
<<PEDV(MZ0116-2/2013株(野外株MZ))之分離及製作>>
自以豬流行性下痢(PED)死亡的仔豬採取小腸，將此小腸0.5g置入已放入小珠的破碎管(Bertin Technologies公司製)，以高速細胞破碎機(Precellys、Bertin Technologies公司製)破碎後，懸浮於培養液(MEM、Thermo Fisher Scientific公司製)5mL，離心分離。將離心分離後的上清液通過孔大小(孔徑)0.22μm之注射器過濾器(GE HEALTHCARE公司製)，作成10質量%組織乳劑。接著，調製混合前述10質量%組織乳劑300μL與10μg/mL胰蛋白酶加培養液100μL的混合液。於預先於6井細胞培養盤中融合的Vero細胞中，將前述混合液全量接種，並於37℃培養90分鐘。接著，去除前述混合液，添加10μg/mL胰蛋白酶加培養液4mL，並於37℃培養。以光學顯微鏡每日確認細胞變性效果(CPE)，於有確認CPE的時點停止培養。回收上清液及細胞，冷凍解凍後將離心分離的上清液繼代。
<<MZ0116-2/2013株的鑑定>>
於製造例1之「P-5V株的鑑定」，除了使用野外株MZ之培養上清液替代P-5V株之培養上清液以外，以與前述「P-5V株的鑑定」相同的方法，進行系統樹解析。
其結果，上述所獲得的株係鑑定為PEDV之遺傳學上的第II群的野外株MZ(參照圖1)。
<臨床症狀之觀察>
將實施例1、比較例1、及對照組以野外株MZ攻撃後第0日~第14日，每日觀察糞便的狀態及食慾，基於以下之評價基準進行評價。將糞便的狀態的結果示於下述表4，將食慾的結果示於下述表5。
-糞便狀態的評價基準-
「0」：正常便
「1」：軟便
「2」：下痢便
「3」：水樣性下痢便
-食慾的評價基準-
「0」：正常
「1」：輕度不振
「2」：中程度不振
「3」：重度不振
Figure 106125846-A0305-02-0038-5
Figure 106125846-A0305-02-0039-6
於糞便的狀態，實施例1、比較例1、及對照組全部為0點，未觀察到差異(表4)。另一方面，於食慾，相對於實施例1為正常，於比較例1及對照組觀察到食慾不振(表5)。
<直腸拭子(rectal swab)中之PEDV RNA的檢測>
將實施例1、比較例1、及對照組以野外株MZ攻撃後第0日~第14日之間，每日使用滅菌綿棒(Osaki Medical股份有限公司製)，採取直腸拭子，懸浮於1mL的PBS。將此懸浮液離心分離，使用TRIZol(註冊商標)試藥(Thermo Fisher Scientific公司製)，提取病毒RNA。將PEDV RNA，藉由使用SuperScript(註冊商標)III One-Step RT-PCR System(Thermo Fisher Scientific公司製)及PEDV特異的引子(序列識別號17所表示的引子9-F〔5’-GATATGTTTGTAATGGTAACTC-3’〕及序列識別號18所表示的引子9-R〔5’-AGCATAGCTAAAAGGCAATGC-3’〕)的RT-PCR，以熱循環器(Veriti 96-Well Thermal Cycler、Thermo Fisher Scientific公司製)增幅。經增幅的RT-PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳(Agarose gel electrophoresis)分離，使用溴化乙錠(ethidium bromide)染色後，藉由紫外線照射檢測。將算出相對於各組母數的PEDV RNA所檢測出的陽性個體之出現率(%)的結果示於下述表6。
Figure 106125846-A0305-02-0040-7
<臓器中PEDV RNA的檢測>
將實施例1、比較例1、及對照組以野外株MZ攻撃後第14日，摘出各個體之脾臓、空迴腸、盲腸、結腸、及腸管膜淋巴節，各自製作10質量%組織乳劑。自各10質量%組織乳劑，使用TRIZol(註冊商標)試藥(Thermo Fisher Scientific公司製)，提取各臓器中的PEDV RNA。接著，使用GoTaq(註冊商標)1-Step RT-qPCR System(Promega公司製)及PEDV特異的引子(序列識別號19所表示的引子10-F〔5’-CGCAAAGACTGAACCCACTAAC-3’〕及序列識別號20所表示的引子10-R〔5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3’〕)的即時RT-PCR(real time RT-PCR)，以StepOnePlus Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific公司製)將RNA量(log10 TCID50/mL相當)定量。將結果示於下述表7。
Figure 106125846-A0305-02-0040-8
Figure 106125846-A0305-02-0041-9
由表6之結果，於比較例1及對照組，相對於PEDV RNA檢測出的陽性個體之出現率為高的，於實施例1，觀察期間中未出現有檢測出PEDV RNA的陽性個體。又，由表7之結果，臓器中PEDV RNA亦同樣地，未於實施例1中檢測出來。
由此等結果認為，於實施例1，藉由自腸管黏膜所分泌的分泌型IgA而PEDV被中和，成立感染防禦免疫。
又，如表6之比較例1及對照組所示，可知PEDV即使一次未檢測出，但再次出現，其為感染後持續1個月~2個月左右。
(實施例2)
<初次免疫>
於PED抗體陰性之8週齡的豬，將製造例2所製造的PEDV(P-5V株)活疫苗2(1mL、107.45TCID50/劑)經鼻投予一次。
<追加免疫>
自前述初次免疫6週後，將製造例4所製造的PEDV(P-5V株)不活化疫苗2(2mL、107.75TCID50/劑)肌肉內投予(注射)一次。
Figure 106125846-A0305-02-0041-10
Figure 106125846-A0305-02-0042-11
(試驗例3)
於實施例2之豬，採取自剛初次免疫前及追加免疫1週後的血液。又，作為對照組，於未進行初次免疫及追加免疫的PED抗體陰性之8週齡豬，亦於8週齡及15週齡的時點採取血液。接著，以與試驗例1之「PEDV中和抗體價的測定」及「抗PEDV的IgA之產生誘導」的欄位記載的方法同樣之方法，調查採取的血液中之PEDV中和抗體價、及抗PEDV的IgA之產生誘導。將結果示於下述表9。
Figure 106125846-A0305-02-0042-12
於初次免疫將PEDV(P-5V株)活疫苗經鼻投予的情形，亦與經口投予的情形同樣地，觀察到顯著的PEDV特異的中和抗體之產生增強活性、及PEDV特異的IgA的產生誘導活性。
歷來，並無PEDV感染呼吸器官系器官的報告，因PEDV的感染侷限於消化器官，藉由經鼻投予，可誘導PEDV特異的中和抗體或PEDV特異的IgA的產生，為本發明者們預想之外的知識見解。
(試驗例4)
於實施例2之豬，自追加免疫2週後，將野外株MZ(105.0 TCID50/mL)5mL經口投予而攻撃。又，作為對照，對未進行初次免疫及追加免疫的PED抗體陰性之16週齡的豬，亦同樣地將野外株MZ(105.0 TCID50/mL)5mL經口投予而攻撃。接著，以與試驗例2之「直腸拭子中之PEDV RNA的檢測」之欄中記載的方法相同的方法，進行直腸拭子中之PEDV RNA的檢測、及臓器中的PEDV RNA的檢測。
<直腸拭子中的PEDV RNA的檢測>
將算出相對於各組母數的PEDV RNA所檢測出的陽性個體之出現率(%)的結果示於下述表10。
Figure 106125846-A0305-02-0043-13
<臓器中的PEDV RNA的檢測>
將實施例2及對照組以野外株MZ攻撃後第14日，摘出各個體之空迴腸、盲腸、結腸、及腸間膜淋巴節，將各臓器中的PEDV RNA以與試驗例2之「臓器中的PEDV RNA的檢測」欄中記載的方法相同的方法檢測，定量RNA量(log10 TCID50/mL相當)。將結果示於下述表11。
[表11]
Figure 106125846-A0305-02-0044-14
(實施例3)
<初次免疫>
於PED抗體陰性的妊娠豬，將製造例2所製造的PEDV(P-5V株)活疫苗2(1mL、107.45TCID50/劑)經鼻投予一次。
<追加免疫>
自前述初次免疫8週後，將製造例4所製造的PEDV(P-5V株)不活化疫苗2(2mL、107.75TCID50/劑)作肌肉內投予(注射)一次。
(比較例3)
<初次免疫>
於PED抗體陰性的妊娠豬，將日生研PED活疫苗(日生研股份有限公司製)2mL肌肉內投予(注射)一次。
<追加免疫>
自前述初次免疫4週後，將日生研PED活疫苗(日生研股份有限公司製)2mL肌肉內投予(注射)一次。
Figure 106125846-A0305-02-0044-15
Figure 106125846-A0305-02-0045-16
(試驗例5)
於由實施例3及比較例3之妊娠豬所生的仔豬(生後第2日)，各自將野外株MZ(105.0 TCID50/mL)5mL經口投予而攻撃。又，作為對照組，對自未進行初次免疫及追加免疫的PED抗體陰性之妊娠豬所生的仔豬(生後第2日)亦將野外株MZ(105.0 TCID50/mL)5mL經口投予而攻撃。又，仔豬之攻撃後，亦使實施例3及比較例3之母豬與該等之仔豬同居。
<母豬中的PEDV中和抗體價>
於實施例3、比較例3、及對照組之妊娠豬(母豬)，採取剛初次投予之前、追加投予1週後、及對仔豬之攻撃1週後的血液。接著，以與試驗例1之「PEDV中和抗體價的測定」欄中記載的方法相同的方法，調查採取的血液中之PEDV中和抗體價。將結果示於下述表13。
<母豬之乳汁中的抗PEDV的IgA之產生誘導>
於剛要對仔豬攻撃前，採取實施例3、比較例3、及對照組之母豬乳汁，除了將試驗例1之「利用西方墨點轉漬法之抗PEDV的IgA之檢測」欄位中記載的方法將血液變換為前述乳汁以外，以與試驗例1相同之方法，檢測乳汁中之抗PEDV的IgA，以與試驗例1相同的方法評價抗PEDV的IgA之產生誘導的有無。將結果示於下述表13。
Figure 106125846-A0305-02-0046-17
<仔豬的生存率>
將由實施例3、比較例3、及對照組的妊娠豬所生的仔豬以野外株MZ攻撃後第0日~第7日，每日進行生存率的確認。將結果示於下述表14。
Figure 106125846-A0305-02-0046-18
<仔豬之小腸的病理組織學的觀察>
將前述「仔豬之臓器中的PEDV RNA的檢測」之際摘出的各仔豬之小腸以福馬林固定後，藉由通常方法製作石蠟切片。接著，使用二甲苯自前述石蠟切片去除石蠟。接著，為了切片的再水合，將切片浸漬於具有濃度梯度的乙醇水 溶液，進行切片的再水合後，使用蒸餾水而去除乙醇。將去除乙醇的切片標本，浸漬於蘇木素(hematoxylin)液中20分鐘後，以蒸餾水洗淨，浸漬於伊紅(eosin)液2分鐘而染色。接著，浸漬於具有濃度梯度的乙醇水溶液而脫水後，浸漬於二甲苯而透徹，作為組織標本。將製作的組織標本以光學顯微鏡觀察，基於以下的評價基準進行絨毛的萎縮、絨毛細胞之空泡化、絨毛的平坦化、及絨毛基底膜的炎症的綜合評價。又，因自1頭母豬生數頭仔豬，評價基準之分數係算出實施例3、比較例3、及對照組之各組的仔豬之平均值，進行藉由Student之T檢定進行有意義差的確認。將結果示於下述表15。
-評價基準-
「0」：正常
「1」：輕度
「2」：中等度
「3」：重度
Figure 106125846-A0305-02-0047-19
a：有意義差(p<0.05,Student的T檢定)
b：有意義差(p<0.01,Student的T檢定)
就本發明之態樣而言，可列舉例如，以下之態樣等。
<1>一種豬流行性下痢之預防或治療方法，其特徵為包含：將豬流行性下痢病毒之活疫苗與佐劑以經口投予及經鼻投予之任一者對豬投予的第一投予步驟；及將前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑以肌肉內投予對前述豬投予的第二投予步驟。
<2>如前述<1>記載之豬流行性下痢之預防或治療方法，其中佐劑為微乳化佐劑。
<3>一種疫苗套組，其特徵為具有經口或經鼻投予用之豬流行性下痢病毒的活疫苗、經口或經鼻投予用佐劑、肌肉內投予用之前述豬流行性下痢病毒的不活化疫苗、及肌肉內投予用佐劑。
<4>如前述<3>記載之疫苗套組，其中經口或經鼻投予用佐劑及肌肉內投予用佐劑為微乳化佐劑。
<5>一種經口或經鼻投予用疫苗，其特徵為包含：前述豬流行性下痢病毒之活疫苗及佐劑，係用於將豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與佐劑作肌肉內投予後賦予追加免疫的豬。
<6>如前述<5>記載之經口或經鼻投予用疫苗，其中佐劑為微乳化佐劑。
<7>一種肌肉內投予用疫苗，其特徵為包含前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗及佐劑，係用於將豬流行性下痢病毒之活疫苗與佐劑經口投予或經鼻投予而賦予初次免疫的豬。
<8>如前述<7>記載之肌肉內投予用疫苗，其中佐劑為微乳化佐劑。
[產業上之利用可能性]
本發明之豬流行性下痢之預防或治療方法、疫苗套組、經口或經鼻投予用疫苗、及肌肉內投予用疫苗因對豬流行性下痢病毒特異的中和抗體 之產生誘導活性、及體液性免疫反應的誘導活性為優異，可適合利用於豬流行性下痢之預防或治療。
<110> 日本.一般財團法人日本生物科學研究所NIPPON INSTITUTE FOR BIOLOGICAL SCIENCE
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<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-F primer
<400> 1
Figure 106125846-A0305-02-0050-20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1-R primer
<400> 2
Figure 106125846-A0305-02-0050-21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-F primer
<400> 3
Figure 106125846-A0305-02-0051-22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-R primer
<400> 4
Figure 106125846-A0305-02-0051-23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-F primer
<400> 5
Figure 106125846-A0305-02-0051-24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3-R primer
<400> 6
Figure 106125846-A0305-02-0052-25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-F primer
<400> 7
Figure 106125846-A0305-02-0052-26
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-R primer
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Figure 106125846-A0305-02-0052-27
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5-F primer
<400> 9
Figure 106125846-A0305-02-0053-28
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5-R primer
<400> 10
Figure 106125846-A0305-02-0053-29
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6-F primer
<400> 11
Figure 106125846-A0305-02-0053-31
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6-R primer
<400> 12
Figure 106125846-A0305-02-0054-32
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7-F primer
<400> 13
Figure 106125846-A0305-02-0054-33
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7-R primer
<400> 14
Figure 106125846-A0305-02-0054-34
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8-F primer
<400> 15
Figure 106125846-A0305-02-0055-35
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8-R primer
<400> 16
Figure 106125846-A0305-02-0055-36
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9-F primer
<400> 17
Figure 106125846-A0305-02-0055-37
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9-R primer
<400> 18
Figure 106125846-A0305-02-0055-38
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10-F primer
<400> 19
Figure 106125846-A0305-02-0056-39
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10-R primer
<400> 20
Figure 106125846-A0305-02-0056-40

Claims (3)

  1. 一種疫苗套組，其特徵為具有：(a)經口或經鼻投予用之豬流行性下痢病毒之P-5V株活疫苗；(b)經口或經鼻投予用佐劑；(c)肌肉內投予用之將前述活疫苗不活化後之不活化疫苗；及(d)肌肉內投予用佐劑；其中，前述經口或經鼻投予用佐劑及前述肌肉內投予用佐劑為微乳化佐劑；及在使用前述疫苗套組時，於使用前述(a)及前述(b)之後，使用前述(c)及(d)。
  2. 一種用於預防或治療豬流行性下痢用組成物的製造之豬流行性下痢病毒的活疫苗及微乳化佐劑的用途，其特徵在於：前述豬流行性下痢病毒係P-5V株；且經口或經鼻投予前述豬流行性下痢病毒之活疫苗及前述微乳化佐劑，並其用於將豬流行性下痢病毒之不活化疫苗與微乳化佐劑作肌肉內投予後而賦予追加免疫的豬。
  3. 一種用於預防或治療豬流行性下痢用組成物的製造之豬流行性下痢病毒的不活化疫苗及微乳化佐劑的用途，其特徵在於：前述豬流行性下痢病毒係P-5V株；且肌肉內投予前述豬流行性下痢病毒之不活化疫苗及前述微乳化佐劑，其係用於將豬流行性下痢病毒之活疫苗與微乳化佐劑進行經口投予或經鼻投予而賦予初次免疫的豬。
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