ES2965854T3 - Procedimiento preventivo o terapéutico, vacuna y kit de vacuna contra la diarrea epidémica porcina - Google Patents
Procedimiento preventivo o terapéutico, vacuna y kit de vacuna contra la diarrea epidémica porcina Download PDFInfo
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Abstract
Un método preventivo o terapéutico para la diarrea epidémica porcina, que incluye: una primera etapa de administración en la que se administra a los cerdos una vacuna viva para el virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante ya sea por vía oral o nasal; y una segunda etapa de administración en la que se administra a los cerdos por vía intramuscular una vacuna inactivada para el virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento preventivo o terapéutico, vacuna y kit de vacuna contra la diarrea epidémica porcina
Campo técnico
La presente invención se refiere a una vacuna para su uso en un procedimiento de prevención de la diarrea epidémica porcina mediante (i) la administración oral o nasal de una vacuna viva, (ii) seguida de la administración intramuscular de una vacuna inactivada.
Técnica anterior
Diarrea epidémica porcina, PED, está causada por la infección oral del virus de la PED (PEDV) contenido en las heces de un cerdo infectado y se caracteriza principalmente por diarrea acuosa y anorexia. La diarrea epidémica porcina es una enfermedad infecciosa vírica que presenta una tasa de letalidad considerablemente elevada en lechones de una semana de edad o menos (véase NPL 1). Se ha planteado el problema de que, una vez que los PEDV entran en una granja de cría de cerdos, es difícil eliminarlos, lo que provoca graves daños económicos. La diarrea epidémica porcina ha prevalecido en los últimos años en países asiáticos y del continente norteamericano como Norteamérica, provocando graves daños económicos (véase NPL 2).
Las células diana de los PEDV son las células epiteliales de los tractos gastrointestinales, en particular el yeyuno intestinal y el íleon intestinal (véase NPL 3). Se considera que algunos de los PEDV entran en el flujo sanguíneo a través del tejido linfoide bajo las mucosas, y también hay un periodo en el que los genes PEDV se detectan en los órganos de todo el cuerpo. Sin embargo, los PEDV no muestran una administración a los cerdos. Sin embargo, cuando los cerdos en condiciones de estrés, como la infección de otros patógenos, un parto o una cría en hacinamiento se exponen a los PEDV, desarrollan transitoriamente síntomas como anorexia y diarrea en algunos casos (véase NPL 4).
Las vacunas contra la diarrea epidémica porcina (en lo sucesivo, "vacuna PED") están disponibles en Japón, Corea del Sur, China, Filipinas y Norteamérica desde finales de los años noventa. Estas vacunas PED convencionales están diseñadas en base al siguiente mecanismo. En concreto, estas vacunas convencionales contra la PED se administran a las cerdas durante el periodo de gestación y, a continuación, los anticuerpos neutralizantes contra los PEDV se segregan en la leche de la cerda tras el parto. Cuando un lechón toma esta leche, los PEDV introducidos en el tracto gastrointestinal del lechón son neutralizados (véase NPL 5). No se puede evitar que el lechón se infecte con el PEDV únicamente mediante los anticuerpos maternos contenidos en el calostro. A lo largo de un periodo de lactancia, los PEDV pueden neutralizarse si se sigue tomando la leche que tiene una alta concentración de anticuerpos neutralizantes contra los PEDV en virtud de la vacuna PED. Como resultado, es posible prevenir la patogénesis de la diarrea epidémica porcina o aliviar sus síntomas.
Sin embargo, existe el problema de que cuando un lechón se encuentra en tal estado que no puede tomar la leche debido a cualquier razón, el lechón se infecta con el PEDV, avanzando en síntomas severos. Además, también hay problemas de que cuando una cerda negativa para el anticuerpo PEDV y una cerda que posee un nivel inmunitario bajo se exponen a una gran cantidad de PEDV, mostrarán síntomas sistémicos, incluyendo una reducción de la lactación, y los efectos de la vacuna PED no se pueden conseguir suficientemente.
También existe el problema de que los efectos de las vacunas PED convencionales se limitan a una reducción de los síntomas causados por los PEDV y a una reducción de la mortalidad de los lechones y la inducción de la respuesta inmunitaria humoral es insuficiente, lo que no puede inducir suficientemente la respuesta del anticuerpo IgA (véase NPL 6). El NPL 7 describe un estudio para evaluar la respuesta de anticuerpos de vacunas muertas y vivas contra el virus de la diarrea epidémica porcina. En total, se dividieron 20 cerdas en cuatro grupos diferentes con cinco cerdas por grupo: el grupo de control negativo no vacunado, el grupo de vacunación con virus muerto y de recuerdo con virus muerto (K/K), el grupo vacunado con virus vivo y de recuerdo con virus vivo (L/L), y el grupo combinado vacunado con virus vivo y posteriormente reforzado con vacuna muerta (L/K). Las cerdas fueron vacunadas intramuscularmente en el músculo braquiocefálico dos veces, a las cuatro y a las dos semanas antes del parto con 2 ml/cabeza cada vez con una dosis de vacuna de105 TCID50/ml.
En consecuencia, existe una fuerte demanda para la provisión de una nueva vacuna para la diarrea epidémica porcina que no sólo permita la inducción de la producción del anticuerpo neutralizante específico para el PEDV en la leche, sino que también permita la inducción de la respuesta inmune capaz de prevenir a la propia cerda contra la infección, y para la provisión de un procedimiento para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina.
Lista de citas
Literatura no de patentes
NPL 1: Zimmerman J.J. et al., Diseases of swine, 10a edición, Wiley-Blackwell 2012
NPL 2: Lee C., Virol J, 2015, Vol. 12, p. 193
NPL 3: Sueyoshi M. et al., J. Comp. Pathol, 1995, Vol. 113 (1), pp. 59-67
NPL 4: Ayako Miyazaki, "Regarding Recently Prevailed Porcine Epidemic Diarrhea (PED)", The Journal of Veterinary Epidemiology, 2014, 18 (1), pp. 85-89
NPL 5: Tetsuo Sato, "Characteristics and Effects of Porcine Epidemic Diarrhoea Live Vacine", PIG JOURNAL, 2014, febrero, pp. 22-25
NPL 6: Song D. et al., Clin. Exp. Vaccine Res., 2015, Vol.4 (2), pp. 166-176
NPL 7: Paudel et al., Veterinary Quarterly, 2014, Vol. 34 (4), pp. 194-200
Sumario de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas se consideran que no forman parte de la presente invención. Las referencias a procedimientos de tratamiento en los párrafos siguientes de la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es resolver los problemas convencionalmente existentes y lograr los siguientes objetos. Es decir, un objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna para su uso en un procedimiento de prevención de la diarrea epidémica porcina, por administración oral o nasal, de una dosis de cebado, seguida de una dosis de recuerdo administrada por vía intramuscular, que son excelentes en la actividad de inducción de la producción del anticuerpo neutralizante específico del virus de la diarrea epidémica porcina y la actividad de inducción de la respuesta inmune humoral, y pueden prevenir eficazmente la diarrea epidémica porcina.
Solución al problema
Como resultado de los estudios realizados diligentemente por los presentes inventores para lograr el objeto mencionado anteriormente, se encontró que cuando una vacuna viva de un virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante se administran a un cerdo a través de la administración oral o una administración nasal, y luego una vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante se administran además a través de la administración intramuscular, es posible no sólo mejorar la inducción de la producción del anticuerpo neutralizante específico del virus de la diarrea epidémica porcina, sino también inducir el anticuerpo IgA específico del virus de la diarrea epidémica porcina, en comparación con las vacunas convencionales para la diarrea epidémica porcina. Además, se encontró que estos anticuerpos se segregan en la leche y permiten no sólo evitar que los lechones se infecten, sino también que lo hagan las propias cerdas.
La presente invención se basa en el hallazgo de los presentes inventores. Los medios para resolver el objeto mencionado se definen en las reivindicaciones 1 y 3.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con la presente invención, es posible resolver los problemas convencionalmente existentes, lograr el objeto y proporcionar una vacuna para su uso en un procedimiento de prevención de la diarrea epidémica porcina, mediante la administración oral o nasal de una dosis de cebado, seguida de una dosis de recuerdo administrada por vía intramuscular de una vacuna inactivada, que son excelentes en la actividad de inducción de la producción del anticuerpo neutralizante específico del virus de la diarrea epidémica porcina y la actividad de inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y pueden prevenir eficazmente la diarrea epidémica porcina.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un diagrama que presenta un resultado del análisis filogenético de un gen Spike del PEDV.
Descripción de las realizaciones
(Vacuna para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de la diarrea epidémica porcina)
El uso en un procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina incluye una primera etapa de administración y una segunda etapa de administración y además incluye otras etapas, en caso necesario .
<Primera etapa de administrac¡ón>
La primera etapa de administración consiste en administrar una vacuna viva de un virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante a un cerdo por vía oral o nasal.
«Vacuna viva del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV)>>.
La vacuna viva del PEDV es una vacuna obtenida por atenuación de la toxicidad del PEDV.
El PEDV es un virus perteneciente aCoronaviridae, Alphacoronavirus,y se clasifica en dos grupos genéticos de Grupo I y Grupo II.
La clasificación del PEDV utilizado para la vacuna viva de PEDV no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Su clasificación puede ser la del Grupo I o la del Grupo II. Estos PEDV pueden utilizarse solos o combinados.
El procedimiento para obtener el PEDV no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen un procedimiento para obtener el PEDV aislándolo de un cerdo que ha sido infectado con el PEDV y un procedimiento que utiliza un producto comercialmente disponible.
Un ejemplo específico del procedimiento para obtener el PEDV aislando el PEDV de un cerdo que ha sido infectado con el PEDV es, por ejemplo, el siguiente procedimiento.
Se recoge el intestino delgado de un cerdo que ha desarrollado la diarrea epidémica porcina (PED) y se prepara un homogeneizado de tejido. A continuación, el homogeneizado de tejido se administra por vía oral a un cerdo que no ha sido infectado con la PED. Al cabo de varios días, se recoge el intestino delgado de este cerdo y se utiliza para preparar un homogeneizado tisular. Estos pasajes se realizan el número de veces que se seleccione oportunamente. A continuación, se añade tripsina a un homogeneizado de tejido obtenido en la última generación, de forma que la concentración final sea de 5 pg/mL a 10 pg/mL. A continuación, el resultante se inocula en células Vero que se han hecho confluentes y se cultiva en un medio de cultivo con tripsina añadida de 5 pg/mL a 10 pg/mL. El efecto citopático (ECP) se confirma cada día con un microscopio óptico. En el momento en que se observa el ECP, se da por finalizado el cultivo. A partir de un sobrenadante de cultivo de las células Vero en las que se ha confirmado el ECP, se extrae el ARN mediante un procedimiento rutinario, y las secuencias de cebadores establecidas en SEQ ID NOs: 1 a 16 se utilizan para realizar la RT-PCR. A continuación, el producto RT-PCR amplificado se somete a clonación en cualquier vector mediante un procedimiento rutinario para obtener así un plásmido. La secuencia de nucleótidos de un gen Spike del PEDV (en lo sucesivo, "gen S del PEDV") en el plásmido se analiza mediante un procedimiento rutinario. A continuación, se ensamblan los respectivos fragmentos de secuencia analizados. Por ejemplo, realizando el análisis filogenético mediante el procedimiento de unión de vecinos con el software MEGA 4.0 (http7/www.megasoftware.net), es posible juzgar si el sujeto es el PEDV perteneciente al Grupo I o el PEDV perteneciente al Grupo II en el grupo genético.
Un ejemplo específico del procedimiento que utiliza un producto disponible comercialmente es un procedimiento que consiste en inocular una vacuna viva disponible comercialmente en células Vero y luego cultivar las células. En este caso, es preferente utilizar un medio de cultivo al que no se añada tripsina.
Entre los ejemplos de PEDV pertenecientes al Grupo I se incluye la cepa P-5V (Sato T et al., Virus Genes, 2011, Vol.
43 (1), pp. 72-78), la cepa CV777 (Pensaert M.B. et al., Arch. Virol., 1978, Vol. 58 (3), pp. 243-247), la cepa DR13 (Park S. J. et al., Virus Genes, 2007, Vol 35 (1), pp. 55-64), la cepa 96-P4C6 (The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, SUIMMUGEN Registered Trademark<t>G<e>/PED vaccine strain), la cepa JS-2004-2 (Zhao P D. et al., Can. J. Vet. Res., 2015, Vol. 79 (1), 8-15), la cepa OH851 (Wang L. et al., Emerg. Infecta. Dis., 2014, Vol. 20 (5), pp. 917-919), la cepa CH/FJND-1/2011 (Tian Y, et al., Viruses, 2013, Vol. 5 (8), pp. 1991-2004), y la cepa DX (Zhao P D. et al., Can. J. Vet. Res., 2015, Vol. 79 (1), 8-15).
La cepa P-5V puede cultivarse fácilmente a partir de la vacuna NISSEIKEN PED Vaccine (live) (disponible en Nisseiken Co., Ltd) mediante el procedimiento mencionado.
Ejemplos de PEDV pertenecientes al Grupo II incluyen la cepa MZ0116-2/2013 (véase el "Ejemplo de prueba 2" descrito a continuación), la cepa OKN-1/JPN/2013 (Suzuki T et al., Infect. Genet. Evol. 2015, Vol. 36, pp. 363-368), la cepa USA/Colorado/2013 (Marthaler D. et. al., Genome Announce., 2013, Vol. 1 (4), pp. e00555-13), y la cepa USA/Minnesota188/2014 (Marthaler D. et al., Emerg. Infecta. Dis., 2014, Vol. 20 (12), pp. 2162-2163).
El procedimiento para atenuar la patogenicidad del PEDV no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente a partir de procedimientos conocidos dependiendo del propósito previsto. Un ejemplo del procedimiento es, por ejemplo, un procedimiento por subcultivo de los PEDV en huéspedes heterólogos.
Los hospedadores heterólogos no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de ello son las células de cultivo.
La dosis de la vacuna viva de PEDV en la primera etapa de administración no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de diversos factores, como la edad, el peso corporal, la constitución física y los síntomas del individuo que se va a administrar, y la presencia o ausencia de administración de un medicamento o un fármaco que contenga otros ingredientes como principio activo. La dosis es preferentemente tal que el contenido de virus por una administración es de 10<70>TCID<50>o más (10<7 0>TCID<50>/dosis o más). Cuando la dosis es inferior a10<7 0>TCID<50>/dosis, no puede lograrse la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral. Como resultado, la diarrea epidémica porcina no puede prevenirse ni tratarse en algunos casos.
« A d yu va n te »
El tipo de adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos son las sales de aluminio, los adyuvantes completos de Freund, los adyuvantes incompletos de Freund, la saponina, el lípido monofosforil A: MPL, adyuvantes de microemulsión, toxinas del cólera, enterotoxinas termolábilesde E. co li, oligonucleótido CpG, ácido polinosínico-policitidílico (poli (I:C)), adyuvantes poliméricos, escualeno, derivados de dextrina, parafina líquida, acetato de tocoferol y polisorbato. El adyuvante puede utilizarse solo o en combinación.
Entre ellos, son preferentes los adyuvantes en microemulsión, las toxinas del cólera, las enterotoxinas termolábilesde E. c o li, el oligonucleótido CpG, el ácido polinosínico-policitidílico (poli (I:C)), los adyuvantes poliméricos y el escualeno, siendo particularmente preferentes los adyuvantes en microemulsión.
El adyuvante en microemulsión está formado por finas partículas oleosas dispersas en agua. Las partículas oleosas finas son las que se obtienen mezclando un aceite mineral ligero y un tensioactivo y emulsionándolos después en agua y tienen partículas de 5 nm a 500 nm.
El aceite mineral ligero no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son la parafina líquida, la parafina líquida eterificada y la parafina líquida ligera (Farmacopea Japonesa). Estos aceites minerales ligeros pueden utilizarse solos o combinados.
Entre los ejemplos de parafina líquida se incluyen MARCOL (marca registrada) 52 (nombre del producto, disponible en Exxon Mobil) y Penreco (marca registrada) Drakeol (marca registrada) 6VR (nombre del producto, disponible en Penreco).
El contenido de aceite mineral ligero en el adyuvante de microemulsión no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Su contenido es preferentemente del 0,001% en masa al 10,0% en masa, más preferentemente del 0,01% en masa al 0,1% en masa. Cuando el contenido de aceite mineral ligero es inferior al 0,001% en masa, las partículas pueden ser inestables. Cuando su contenido es superior al 10,0% en masa, el residuo del producto vacunado puede permanecer en un animal a vacunar.
El tensioactivo no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son el ácido monooleico mannídico, los derivados etoxilados del éster manitánico del ácido oleico, el monoestearato de glicerilo, el monolaurato de decaglicerilo, el monooleato de sorbitán y el monopalmitato de sorbitán polioxietilenado (20). Estos tensioactivos pueden utilizarse solos o combinados.
El contenido del tensioactivo en el adyuvante de microemulsión no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que el aceite mineral ligero pueda emulsionarse para formar una microemulsión.
El adyuvante de microemulsión puede contener además un agente quelante. Cuando el adyuvante de la microemulsión contiene un agente quelante, los antígenos (PEDV) unidos a las partículas aceitosas finas se estabilizan, o se consigue el acto de ayudar a la unión de las partículas aceitosas finas a las células inmunocompetentes, lo cual es ventajoso.
El agente quelante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de ello son los complejos de ácidos poliiónicos como el gluconato de calcio, el gluconato de manganeso, el salicilato de aluminio y los acetatos de aluminio solubles. Estos agentes quelantes pueden utilizarse solos o combinados.
El contenido del agente quelante en el adyuvante de microemulsión no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Su contenido es preferentemente del 0,002% en masa al 30% en masa, más preferentemente del 0,01% en masa al 15% en masa. Cuando el contenido del agente quelante es inferior al 0,002% en masa, la actividad de respuesta inmunitaria no puede potenciarse en algunos casos. Cuando el contenido del agente quelante es superior al 30% en masa, en algunos casos se producirá un efecto secundario en el animal vacunado.
El procedimiento para preparar la microemulsión adyuvante que contiene el agente quelante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Un procedimiento ejemplar del mismo es un procedimiento para preparar un adyuvante de microemulsión añadiendo el aceite mineral ligero, el tensioactivo y el agente quelante al agua, y emulsionándolos con una unidad de emulsificación conocida. Específicamente, es posible utilizar, por ejemplo, los procedimientos descritos en Solicitud de Patente Japonesa Expuesta al Público Nos. 20004-131417 y 2005-75752. Además, como adyuvante de la microemulsión, puede utilizarse un producto disponible en el mercado. Ejemplos del producto disponible comercialmente incluyen IMS 1312 VG, IMS 1313 VG, IMS 251C, IMS 2215 VG, e IMS 3012 VG ST en la serie MONTANIDE IMS (todos los productos están disponibles en SEPPIC).
La dosis del adyuvante en la primera etapa de administración no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de diversos factores, como el tipo de adyuvante; la presencia o ausencia de administración de un medicamento o un fármaco que contenga otros ingredientes como principio activo; y la edad, el peso corporal, la constitución física y los síntomas del individuo que se va a administrar, siempre que no comprometa los efectos de la vacuna viva de PEDV.
La dosis en el caso de que el adyuvante sea la microemulsión adyuvante no está particularmente limitada. Sin embargo, la dosis es preferentemente tal que una relación de volumen entre el adyuvante de microemulsión y un líquido viral que contiene la vacuna viva de PEDV es de 20/80 a 80/20, particularmente preferentemente tal que la relación de volumen es de 50/50. Cuando la relación de volumen (microemulsión adyuvante/líquido vírico que contiene la vacuna viva del PEDV) es inferior a 20/80, no se puede lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no se puede prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina. Cuando la relación de volumen es superior a 80/20, se producirá hinchazón, induración, enrojecimiento, pirexia y shock anafiláctico en la porción administrada, no se podrá lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmune humoral, y en algunos casos no se podrá prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina.
El momento en el que la vacuna viva de PEDV y el adyuvante se administran a un cerdo mediante administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante y el momento sea anterior a la segunda etapa de administración. La vacuna viva de PEDV y el adyuvante pueden administrarse simultáneamente o por separado. Sin embargo, la administración simultánea es preferente por razones de simplicidad.
Un procedimiento para administrar simultáneamente la vacuna viva de PEDV y el adyuvante a un cerdo mediante administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto. Ejemplos de los mismos incluyen un procedimiento mediante la administración de una composición obtenida mezclando la vacuna viva de PEDV y el adyuvante.
Como composición obtenida mezclando la vacuna viva de PEDV y el adyuvante, se utiliza adecuadamente una vacuna de la presente invención para administración oral o nasal, que se describirá más adelante.
Cuando la vacuna viva de PEDV y el adyuvante se administran por separado a un cerdo mediante administración oral o nasal, el orden de administración de la vacuna viva de PEDV y el adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante.
El intervalo de dosificación entre la vacuna viva de PEDV y el adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante.
El número de veces que se realiza la primera etapa de administración no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. La presente invención es ventajosa en el sentido de que una primera etapa de una sola administración permite lograr efectos suficientes.
<Segunda etapa de administrac¡ón>
La segunda etapa de administración consiste en administrar, por vía intramuscular, una vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante a un cerdo que ha sido sometido a la primera etapa de administración.
«Vacuna inactivada contra el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV)>>.
Una vacuna inactivada de PEDV es una vacuna obtenida eliminando la patogenicidad del PEDV o atenuando su toxicidad.
La clasificación y el procedimiento de adquisición del PEDV utilizado para la vacuna inactivada de PEDV no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de ello incluyen los aspectos descritos en el apartado de la vacuna viva de PEDV en la primera etapa de administración.
Un procedimiento para inactivar la infectividad del PEDV no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto a partir de procedimientos conocidos. Ejemplos de los mismos incluyen un procedimiento por tratamiento del PEDV con un fármaco como la formalina, un procedimiento por calentamiento, un procedimiento por cambio de pH, un procedimiento por emisión de rayos gamma y un procedimiento por emisión de rayos ultravioleta.
Como PEDV utilizado para la vacuna inactivada de PEDV, los virus aislados pueden inactivarse tal cual, o puede inactivarse el PEDV atenuado.
La dosis de la vacuna inactivada de PEDV en la segunda etapa de administración no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de diversos factores, como la edad, el peso corporal, la constitución física y los síntomas del individuo que se va a administrar, y la presencia o ausencia de administración de un medicamento o un fármaco que contenga otros ingredientes como principio activo. La dosis es preferentemente tal que el contenido de virus por una administración es de10<65>TCID<50>o más (de10<65>TCID<50>/dosis o más), más preferentemente tal que el contenido de virus por una administración es de de10<75>TCID<50>o más ( de10<75>TCID<50>/dosis o más). Cuando la dosis es inferior a de10<65>TCID<50>/dosis, no puede lograrse la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral. Como resultado, la diarrea epidémica porcina no puede prevenirse ni tratarse en algunos casos.
« A d yu va n te »
El tipo de adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen los descritos en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración.
Entre ellos, por ejemplo, son preferentes las sales de aluminio, los adyuvantes de microemulsión, los adyuvantes poliméricos, los derivados de dextrina, la parafina líquida, el escualeno, el acetato de tocoferol y el polisorbato, siendo particularmente preferentes los adyuvantes de microemulsión.
Un aspecto de los adyuvantes en microemulsión es el mismo que el descrito en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración.
La dosis del adyuvante en la segunda etapa de administración no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de diversos factores, como el tipo de adyuvante; la presencia o ausencia de administración de un medicamento o un fármaco que contenga otros ingredientes como principio activo; y la edad, el peso corporal, la constitución física y los síntomas del individuo que se va a administrar, siempre que no comprometa los efectos de la vacuna inactivada de PEDV.
La dosis en el caso de que el adyuvante sea la microemulsión adyuvante no está particularmente limitada. La dosis es preferentemente tal que una relación de volumen entre el adyuvante en microemulsión y un líquido viral que contiene la vacuna inactivada de PEDV es de 20/80 a 80/20, particularmente preferentemente tal que la relación de volumen es de 50/50. Cuando la relación de volumen (microemulsión adyuvante/líquido vírico que contiene la vacuna inactivada del PEDV) es inferior a 20/80, no se puede lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no se puede prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina. Cuando la relación de volumen es superior a 80/20, se producirá hinchazón, induración, enrojecimiento, pirexia y shock anafiláctico en la porción administrada, no se podrá lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmune humoral, y en algunos casos no se podrá prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina.
El momento en el que la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante se administran al cerdo mediante administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función del objetivo previsto, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante y el momento sea posterior a la primera etapa de administración. La vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante pueden administrarse simultáneamente o por separado. Sin embargo, la administración simultánea es preferente por razones de simplicidad.
Un procedimiento para administrar simultáneamente la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante al cerdo mediante administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto. Los ejemplos de los mismos incluyen un procedimiento mediante la administración de una composición obtenida mezclando la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante.
Como composición obtenida mezclando la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante, se utiliza adecuadamente una vacuna de la presente invención para administración intramuscular, que se describirá más adelante.
Cuando la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante se administran por separado al cerdo mediante administración intramuscular, el orden de administración de la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante.
El intervalo de dosificación entre la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante.
El número de veces que se realiza la segunda etapa de administración no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. La presente invención es ventajosa en el sentido de que una segunda etapa de administración única permite lograr efectos suficientes.
El intervalo de dosificación entre la primera etapa de administración y la segunda etapa de administración no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. El intervalo de dosificación es preferentemente de 1 semana a 20 semanas, más preferentemente de 2 semanas a 10 semanas, particularmente preferentemente de 4 semanas a 10 semanas. Cuando el intervalo de dosificación es inferior a 1 semana, no se puede lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no se puede prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina. Por lo tanto, incluso después de más de 20 semanas, la producción del anticuerpo neutralizante específico para el PEDV y la inducción de la respuesta inmune humoral no se pueden lograr, y la diarrea epidémica porcina no se puede prevenir o tratar en algunos casos.
(Kit de vacunas (no reivindicado))
Un kit de vacunas incluye una vacuna viva del virus de la diarrea epidémica porcina para administración oral o nasal, un adyuvante para administración oral o nasal, una vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina para administración intramuscular y un adyuvante para administración intramuscular, e incluye además otros componentes si es necesario.
<Vacuna viva del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) para administración oral o nasal>.
La clasificación y el procedimiento de adquisición del PEDV utilizado para la vacuna viva contra el PEDV para administración oral o nasal, y un procedimiento para atenuar la patogenicidad del PEDV no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen los descritos en el apartado de la vacuna viva de PEDV en la primera etapa de administración en el procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina como se ha descrito anteriormente.
El contenido de virus de la vacuna viva PEDV para administración oral o nasal en el kit de vacuna no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función del número de veces de uso. El contenido de virus de la vacuna viva PEDV para administración oral o nasal por una administración es preferentemente de1070 TCID50/dosis o más. Cuando se utiliza el kit de vacunas, la vacuna viva PEDV para administración oral o nasal puede seleccionarse adecuadamente en función de diversos factores, como la edad, el peso corporal, la constitución física y los síntomas del individuo que se va a administrar, y la presencia o ausencia de administración de un medicamento o un fármaco que contenga otros ingredientes como principio activo, y puede ajustarse mediante dilución.
<Adyuvante para administración oral o nasal>
El tipo de adyuvante para la administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen los descritos en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
Entre ellos, son preferentes los adyuvantes de microemulsión, las toxinas del cólera, las enterotoxinas termolábilesde E. c o li, el oligonucleótido CpG, el ácido polinosínico-policitidílico (poli (I:C)), los adyuvantes poliméricos y el escualeno, siendo particularmente preferentes los adyuvantes de microemulsión.
Un aspecto de los adyuvantes de microemulsión es el mismo que el descrito en el artículo del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente. El contenido del adyuvante para la administración oral o nasal en el kit de vacuna no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente dependiendo, por ejemplo, del número de veces de uso y del contenido de un líquido vírico que contenga la vacuna viva PEDV para la administración oral o nasal.
El kit de vacuna (no reivindicado) puede incluir la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal, como constituyentes individuales o en un estado de una composición obtenida mezclándolos.
Como composición obtenida mezclando la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal, se utiliza adecuadamente una vacuna de la presente invención para administración oral o nasal, que se describirá más adelante.
<Vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) para administración intramuscular>.
La clasificación y el procedimiento de adquisición del PEDV utilizado para la vacuna inactivada contra el PEDV para administración intramuscular, y el procedimiento para inactivar la infecciosidad del PEDV no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen aspectos descritos en el apartado de vacuna inactivada de PEDV en la segunda etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
El contenido de virus de la vacuna inactivada PEDV para la administración intramuscular en el kit de vacuna no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función del número de veces de uso. El contenido de virus de la vacuna inactivada PEDV para administración intramuscular por una administración es preferentemente 10<65>TCID<5o>/dosis o más, más preferentemente 10<75>TCID<5o>/dosis o más. Cuando se utiliza el kit de vacunas (no reivindicado), la vacuna inactivada PEDV para administración intramuscular puede seleccionarse adecuadamente en función de diversos factores, como la edad, el peso corporal, la constitución física y los síntomas del individuo que se va a administrar, y la presencia o ausencia de administración de un medicamento o un fármaco que contenga otros ingredientes como principio activo, y puede ajustarse mediante dilución.
<Adyuvante para administración intramuscular>
El tipo de adyuvante para la administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen los descritos en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
Entre ellos, son preferentes las sales de aluminio, los adyuvantes de microemulsión, los adyuvantes poliméricos, los derivados de dextrina, la parafina líquida, el escualeno, el acetato de tocoferol y el polisorbato, siendo particularmente preferentes los adyuvantes de microemulsión.
Un aspecto de los adyuvantes de microemulsión es el mismo que el descrito en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
El contenido del adyuvante para la administración intramuscular en el kit de vacuna (no reivindicado) no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función del número de veces de uso, y del contenido de un líquido vírico que contenga la vacuna inactivada PEDV para la administración intramuscular.
El kit de vacuna (no reivindicado) puede incluir la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular, como constituyentes individuales o en un estado de una composición obtenida mezclándolos.
Como composición obtenida mezclando la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular, se utiliza adecuadamente una vacuna de la presente invención para administración intramuscular, que se describirá más adelante.
<Otros componentes>
Los demás constituyentes no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que no se comprometan los efectos de la presente invención. Ejemplos de ello son un líquido de disolución, una solución salina fisiológica para la dilución, un recipiente para la preparación en uso, una jeringa, una aguja de inyección y un prospecto.
La formulación del líquido de disolución no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de ello son los descritos en el punto de otros ingredientes de la vacuna de la presente invención para administración oral o nasal, que se describirán más adelante.
<Procedimiento de utilizac¡ón>
El kit de vacuna (no reivindicado) se utiliza administrando la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal mediante administración oral o administración nasal, y luego administrando la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular mediante administración intramuscular.
La vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal pueden administrarse simultáneamente o por separado. Sin embargo, la administración simultánea es preferente por razones de simplicidad.
Cuando la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal se administran simultáneamente a un cerdo mediante administración oral o administración nasal, se utiliza preferentemente la composición obtenida mezclando la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal.
Cuando la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal se administran por separado a un cerdo mediante administración oral o administración nasal, el orden de administración de la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista.
El intervalo de dosificación entre la vacuna viva de PEDV para administración oral o nasal y el adyuvante para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante para administración oral o nasal.
La vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular pueden administrarse simultáneamente o por separado. Sin embargo, la administración simultánea es preferente por razones de simplicidad.
Cuando la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular se administran simultáneamente al cerdo mediante administración intramuscular, se utiliza preferentemente la composición obtenida mezclando la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular.
Cuando la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular se administran por separado al cerdo mediante administración intramuscular, el orden de administración de la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista.
El intervalo de dosificación entre la vacuna inactivada de PEDV para administración intramuscular y el adyuvante para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que puedan conseguirse los efectos adyuvantes del adyuvante para administración intramuscular.
El kit de vacuna (no reivindicado) puede utilizarse adecuadamente para el procedimiento descrito anteriormente de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina.
(Vacuna para administración oral o nasal)
Una vacuna para uso en un procedimiento de la presente invención por administración oral o nasal incluye una vacuna viva de un virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante y comprende además otros ingredientes, si es necesario.
La vacuna para uso en un procedimiento por administración oral o nasal se utiliza para un cerdo al que posteriormente se le administra una inmunización de recuerdo mediante administración intramuscular de una vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante.
<Vacuna viva del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV)>.
La clasificación y el procedimiento de adquisición del PEDV utilizado para la vacuna viva de PEDV, y un procedimiento para atenuar la patogenicidad del PEDV no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen aspectos descritos en el apartado de vacuna viva de PEDV en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
El contenido de la vacuna viva de PEDV en la vacuna para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, pero es preferentemente de1070 TCID50/dosiso más. Cuando su contenido es inferior a 1070 TCID50/dosis, no puede lograrse la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no puede prevenirse ni tratarse la diarrea epidémica porcina.
<Adyuvante>
El tipo de adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos del mismo incluyen los descritos en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
Entre los mismos, son preferentes los adyuvantes de microemulsión, las toxinas del cólera, las enterotoxinas termolábilesde E. c o li, el oligonucleótido CpG, el ácido polinosínico-policitidílico (poli (I:C)), los adyuvantes poliméricos y el escualeno, siendo más preferentes los adyuvantes de microemulsión.
Un aspecto del adyuvante en microemulsión es el mismo que el descrito en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
El contenido del adyuvante en la vacuna para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que los efectos de la vacuna viva de PEDV no se vean comprometidos y puedan conseguirse los efectos del adyuvante.
Cuando el adyuvante es el adyuvante en microemulsión, el contenido del adyuvante en microemulsión en la vacuna para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Su contenido es preferentemente del 20% en volumen al 80% en volumen, y especialmente del 50% en volumen. Cuando el contenido de la microemulsión es inferior al 20% en volumen, no puede lograrse la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no puede prevenirse ni tratarse la diarrea epidémica porcina. Cuando el contenido de la misma es superior al 80% en volumen, se producirá hinchazón, induración, enrojecimiento, pirexia y shock anafiláctico en la porción administrada, no se podrá lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmune humoral, y en algunos casos no se podrá prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina.
<Otros ingredientes>
Los demás ingredientes no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente de portadores farmacéuticamente aceptables en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son los agentes aditivos, los adyuvantes farmacéuticos y el agua. Pueden utilizarse solos o combinados.
El agente aditivo o el adyuvante farmacéutico no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos son bactericidas, conservantes, aglutinantes, espesantes, de fijación, aglutinantes, colorantes, estabilizadores, ajustadores del pH, tampones, agentes tonificantes, disolventes, antioxidantes, inhibidores de la radiación ultravioleta, inhibidores de la cristalización, agentes antiespumantes, agentes para mejorar las propiedades y antisépticos.
El bactericida no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son los tensioactivos catiónicos, como el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio y el cloruro de cetilpiridinio.
El conservante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son el parahidroxibenzonato, el clorobutanol, el cresol, el timerosal y el fenoxietanol.
El aglutinante, el espesante o el agente de fijación no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos son almidón, dextrina, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilalmidón, pullulano, alginato sódico, alginato de amonio, alginato de propilenglicol, goma guar, goma garrofín, goma arábiga, goma xantana, gelatina, caseína, alcohol polivinílico, óxido de polietileno, polietilenglicol, polímero en bloque de etileno-propileno, poliacrilato de sodio y polivinilpirrolidona.
El agente aglutinante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos incluyen agua, etanol, propanol, jarabe simple, una solución de glucosa, una solución de almidón, una solución de gelatina, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilalmidón, metilcelulosa, etilcelulosa, goma laca, fosfato de calcio y polivinilpirrolidona.
El colorante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son el óxido de titanio y el óxido de hierro.
El estabilizador no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son el tragacanto, la goma arábiga, la gelatina, el pirosulfito sódico, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), el ácido tioglicólico y el ácido tioláctico.
El ajustador de pH o el tampón no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son el citrato sódico, el acetato sódico y el fosfato sódico.
El agente de tonicidad no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son el cloruro sódico, el cloruro potásico y la glucosa.
El contenido de los demás ingredientes de la vacuna para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que no se comprometan los efectos de la presente invención.
<Forma de dosificac¡ón>
Una forma de dosificación de la vacuna para su uso en un procedimiento por administración oral o nasal no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que pueda realizarse la administración oral o la administración nasal. Ejemplos de ello son la formulación sólida y la formulación líquida. Entre ellas, la vacuna para administración oral es preferentemente la formulación sólida o la formulación líquida, y la vacuna para administración nasal es preferentemente la formulación líquida.
Formulación sólida
La formulación sólida no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Algunos ejemplos son las cápsulas duras y las cápsulas blandas.
Formulación líquida
La formulación líquida no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de formulación líquida utilizada como vacuna para administración oral son los jarabes, las bebidas saludables, las suspensiones, los licores y los agentes dietéticos.
Ejemplos de la formulación líquida utilizada como vacuna para la administración nasal incluyen formulaciones líquidas, colirios, agentes en aerosol y agentes en espray.
<Procedimiento de producción>
Un procedimiento para producir la vacuna para administración oral o nasal no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto a partir de procedimientos conocidos según la forma de dosificación, siempre que la vacuna viva de PEDV y el adyuvante puedan mezclarse.
<Uso>
La vacuna para uso en un procedimiento por administración oral o nasal se utiliza para un cerdo al que posteriormente se le administra una inmunización de recuerdo mediante administración intramuscular de la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante.
El procedimiento para administrar la inmunización de recuerdo al cerdo no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto. El procedimiento descrito en la segunda etapa del procedimiento para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina se utiliza adecuadamente.
La vacuna para administración oral o nasal puede utilizarse sola o en combinación con un medicamento que contenga otros ingredientes como principios activos. Además, la vacuna para administración oral o nasal puede utilizarse en un estado tal que la vacuna para administración oral o nasal se mezcle, por ejemplo, con un medicamento que contenga otros ingredientes como principios activos, pienso o agua potable.
La vacuna para administración oral o nasal puede inducir la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV, mediante la posterior inmunización de recuerdo a través de la administración intramuscular de la vacuna inactivada del PEDV y el adyuvante, y además puede inducir la producción de IgA específica del PEDV a través de la respuesta inmunitaria humoral. Como resultado, es posible prevenir o tratar eficazmente la diarrea epidémica porcina. La vacuna para administración oral o nasal puede administrarse directamente no sólo a una cerda sino también a un lechón. Por lo tanto, incluso cuando un lechón no puede tomar la leche debido a cualquier razón o su cerda tiene una baja concentración del anticuerpo neutralizante contra el PEDV en la leche, se puede prevenir o tratar la infección del lechón con PEDV, lo cual es ventajoso.
(Vacuna para administración intramuscular)
Una vacuna para uso en un procedimiento de la presente invención por administración intramuscular incluye una vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante y comprende además otros ingredientes si es necesario.
La vacuna para administración intramuscular se utiliza para un cerdo que ha recibido una inmunización de cebado mediante administración oral o administración nasal de una vacuna viva del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante.
<Vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV)>.
La clasificación y el procedimiento de adquisición del PEDV utilizado para la vacuna inactivada de PEDV, y un procedimiento para inactivar la infectividad del PEDV no están particularmente limitados y pueden seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto. Ejemplos de los mismos incluyen los aspectos descritos en el apartado de la vacuna inactivada de PEDV en la segunda etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
El contenido de la vacuna inactivada de PEDV en la vacuna para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Su contenido es preferentemente de10<65>TCID<50>/dosis o más, más preferentemente de 10<75>TCID<50>/dosis o más. Cuando su contenido es inferior a 10<65>TCID<50>/dosis, no puede lograrse la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no puede prevenirse ni tratarse la diarrea epidémica porcina.
<Adyuvante>
El tipo de adyuvante no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos del mismo incluyen los descritos en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
Entre los mismos, por ejemplo, son preferentes las sales de aluminio, los adyuvantes de microemulsión, los adyuvantes poliméricos, los derivados de dextrina, la parafina líquida, el escualeno, el acetato de tocoferol y el polisorbato, siendo particularmente preferentes los adyuvantes de microemulsión.
Un aspecto del adyuvante en microemulsión es el mismo que los descritos en el apartado del adyuvante en la primera etapa de administración del procedimiento de la presente invención para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, como se ha descrito anteriormente.
El contenido del adyuvante en la vacuna para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto, siempre y cuando los efectos de la vacuna inactivada de PEDV no se vean comprometidos y puedan lograrse los efectos del adyuvante.
Cuando el adyuvante es el adyuvante en microemulsión, el contenido del adyuvante en microemulsión en la vacuna para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Su contenido es preferentemente del 20% en volumen al 80% en volumen, y especialmente del 50% en volumen. Cuando el contenido de la microemulsión es inferior al 20% en volumen, no puede lograrse la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmunitaria humoral, y en algunos casos no puede prevenirse ni tratarse la diarrea epidémica porcina. Cuando el contenido de la misma es superior al 80% en volumen, se producirá hinchazón, induración, enrojecimiento, pirexia y shock anafiláctico en la porción administrada, no se podrá lograr la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV ni la inducción de la respuesta inmune humoral, y en algunos casos no se podrá prevenir ni tratar la diarrea epidémica porcina.
<Otros ingredientes>
Los demás ingredientes no están particularmente limitados y pueden seleccionarse adecuadamente de portadores farmacéuticamente aceptables en función de la finalidad prevista. Ejemplos de los mismos son los descritos en el punto de los otros ingredientes de la vacuna para administración oral o nasal.
El contenido de los demás ingredientes de la vacuna para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista, siempre que no se comprometan los efectos de la presente invención.
<Forma de dosificac¡ón>
Una forma de dosificación de la vacuna para administración intramuscular no está particularmente limitada y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto, siempre que sea posible realizar la administración intramuscular. Algunos ejemplos son los agentes inyectables.
Agente de inyección
El agente de inyección no está particularmente limitado y puede seleccionarse adecuadamente en función de la finalidad prevista. Ejemplos de ello son las soluciones, suspensiones y formulaciones sólidas que se disuelven durante el uso.
Procedim iento de producción>
Un procedimiento para producir la vacuna para administración intramuscular no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto a partir de procedimientos conocidos, según la forma de dosificación, siempre que la vacuna inactivada de PEDV y el adyuvante puedan mezclarse.
<Uso>
La vacuna para uso en un procedimiento por administración intramuscular se utiliza para un cerdo al que se le ha administrado inmunización de cebado mediante administración oral o administración nasal de la vacuna viva de PEDV y el adyuvante.
El procedimiento para administrar la inmunización de cebado al cerdo no está particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del propósito previsto. El procedimiento descrito en la primera etapa del procedimiento para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina se utiliza adecuadamente.
La vacuna para administración intramuscular puede utilizarse sola o en combinación con un medicamento que contenga otros ingredientes como principios activos. Además, la vacuna para administración intramuscular puede utilizarse en un estado tal que la vacuna para administración intramuscular se mezcle, por ejemplo, con un medicamento que contenga otros ingredientes como principios activos.
Cuando la vacuna para administración intramuscular se utiliza para el cerdo que ha recibido inmunización de cebado mediante administración oral o administración nasal de la vacuna viva del PEDV y el adyuvante, es posible inducir la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV e inducir además la producción de IgA específica del PEDV mediante la respuesta inmunitaria humoral. Como resultado, es posible prevenir o tratar eficazmente la diarrea epidémica porcina.
La vacuna para administración intramuscular puede administrarse directamente no sólo a una cerda sino también a un lechón. Por lo tanto, incluso cuando un lechón no puede tomar la leche debido a cualquier razón o su cerda tiene una baja concentración del anticuerpo neutralizante contra el PEDV en la leche, se puede prevenir o tratar la infección del lechón con PEDV, lo cual es ventajoso.
Ejemplos
La presente invención se describirá en detalle mediante ejemplos. La presente invención no debe interpretarse como limitada a estos ejemplos.
(Ejemplo de producción 1)
<Producción de vacuna viva PEDV (cepa P-5V) 1>
«Aislam iento y preparación de la cepa P-5V del PEDV>>
Se recogió el intestino delgado de un cerdo que había desarrollado la diarrea epidémica porcina (PED) en un campo y se utilizó para formar un homogeneizado de tejido del 10% en masa. El homogeneizado tisular al 10% en masa se administró por vía oral a un lechón que no había sido infectado por la DEP. Al cabo de dos días, se recogió el intestino delgado y se utilizó para preparar un homogeneizado tisular al 10% en masa. El homogeneizado de tejido obtenido se subcultivó en el lechón que no había sido infectado con el PED durante tres generaciones de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Al homogeneizado tisular obtenido del lechón en una fase de paso de la tercera generación, se añadió tripsina hasta alcanzar una concentración final de 10 pg/mL. A continuación, el resultante se inoculó en células Vero que se habían hecho confluentes previamente en un matraz de cultivo de 25 cm2y se cultivó a 37°C durante 60 minutos. A continuación, se añadieron 5 mL de un medio de cultivo (en lo sucesivo, "medio de cultivo con tripsina añadida a 10 pg/mL") preparado por el procedimiento descrito a continuación, y el resultante se cultivó a 37°C. El efecto citopático (ECP) se confirmó utilizando un microscopio óptico cada día. En el momento en que se confirmó el ECP, se dio por finalizado el cultivo. Para el pasaje del virus aislado, a medida que avanzaba el pasaje, la cantidad de tripsina añadida disminuía gradualmente. Por último, no se añadió tripsina al mismo, y el cultivo de pases se realizó durante 100 generaciones.
10 ug/mL de medio de cultivo con tripsina
En 500 mL de Medio Esencial Mínimo (MEM) (disponible en Thermo Fisher Scientific), se disolvió un extracto de levadura (disponible en Difco Laboratories) y Caldo Fosfato Triptose (disponible en Difco Laboratories) de modo que una concentración final del extracto de levadura fuera 0,02% (p/v), y una concentración final del Caldo Fosfato Triptose fuera 0,03% (p/v). A continuación, se disolvieron en ella penicilina (50.000 unidades), estreptomicina (50 mg) y tripsina, de modo que la concentración final de la tripsina fuera de 10 pg/mL.
«Identificación de la cepa P-5V>>
Se utilizó el reactivo TRIZol (marca registrada) (disponible en Thermo Fisher Scientific) para extraer el ARN del virus del sobrenadante del cultivo de la cepa P-5V. El ARN del PEDV se amplificó con un termociclador (Veriti 96-Well Thermal Cycler, disponible en Thermo Fisher Scientific) mediante RT-PCR utilizando SuperScript (marca registrada) III One-Step RT-PCR System (disponible en Thermo Fisher Scientific) y ocho tipos de conjuntos de cebadores específicos del gen S del PEDV (conjuntos de cebadores 1 a 8) presentados en la siguiente Tabla 1. El producto RT-PCR amplificado se insertó en el vector pCR (marca registrada) 2.1-TOPO TA (disponible en Thermo Fisher Scientific), y se transformó enE. coliTOP10 (disponible en Thermo Fisher Scientific) mediante choque térmico, seguido de clonación.E. colise cultivó durante una noche a 37°C utilizando un caldo LB (formulación: cloruro sódico (10 g), Bacto Trypton (10 g) y un extracto de levadura (5 g) disueltos en agua destilada (1 L )). A continuación, se utilizó el kit QIAprep Spin Miniprep (disponible en QIAGEN) para purificar el plásmido. A partir del plásmido purificado, se secuenció la secuencia de bases del gen S del PEDV mediante el reactivo BigDye (marca registrada) Terminator v3.1 y el analizador genético 3130xl (disponible en Applied Biosystems). Cada fragmento secuenciado se ensambló y el análisis filogenético mediante el procedimiento de unión de vecinos se realizó con el programa MEGA4.0 (http://www.megasoftware.net).
Como resultado, la cepa obtenida anteriormente fue identificada como la cepa P-5V del Grupo genético I del PEDV (véase la FIG. 1).
Tabla 1
«Preparación de líquido concentrado de antígeno viral PEDV (cepa P-5V) 1>>.
La cepa P-5V se inoculó en células Vero y se cultivó a 37°C durante 3 días. Se recogieron las células Vero y se sometieron a congelación y descongelación. A continuación, se centrifugó el producto obtenido mediante congelación y descongelación, y el sobrenadante así obtenido se recogió como "PEDV (cepa P-5V) virus antigen liquid 1". Al antígeno viral PEDV (cepa P-5V) líquido 1, se añadieron 7,5% (p/v) de polietilenglicol 6000 y 1M de cloruro sódico. El resultante se agitó a 4°C durante toda la noche y los precipitados se recogieron mediante separación centrífuga. Los precipitados se disolvieron en solución salina fisiológica en una cantidad tal que es una vigésima parte de la cantidad (v/v) del antígeno vírico PEDV (cepa P-5V) líquido 1. A continuación, se centrifugó de nuevo el resultante, y el sobrenadante así obtenido se recogió como "PEDV (cepa P-5V) concentrado de antígeno vírico líquido 1".
Medición del título del virus
El título del virus (título de infectividad del virus) del antígeno concentrado del virus PEDV (cepa P-5V) líquido 1 se midió a través de la Dosis Infectiva de Cultivo de Tejidos del 50%: TCID<50>.
Específicamente, las células Vero se sembraron en una placa de cultivo celular de 24 pocillos a 0,75*10<®>células/0,5 ml/pocillo y se cultivaron a 37°C durante 3 días. El antígeno líquido que se va a medir (en este caso, el antígeno concentrado del virus PEDV (cepa P-5V) líquido 1) se sometió a una dilución en serie de 10 veces en un medio de cultivo. En este caso, el medio de cultivo se obtuvo como se describe a continuación. Específicamente, en MEM (500 mL) (disponible en Thermo Fisher Scientific), se disolvieron un extracto de levadura (disponible en Difco Laboratories) y un caldo de fosfato de triptosa (disponible en Difco Laboratories) de modo que una concentración final del extracto de levadura fuera del 0,02% (p/v) y una concentración final del caldo de fosfato de triptosa fuera del 0,03% (p/v). A continuación, se disolvieron en ella penicilina (50.000 unidades) y estreptomicina (50 mg). El resultante se inoculó en células Vero, y las células se cultivaron a 37°C durante 90 minutos. Después de cambiar el medio de cultivo, el cultivo se realizó a 37°C durante 7 días. El efecto citopático (ECP) se observó con un microscopio óptico y el título del virus (TCID<50>) se calculó según el procedimiento de Reed-Muench.
Como resultado, el título del virus del PEDV (cepa P-5V) concentrado de antígeno viral líquido 1 fue de10<775>TCID<50>/1T1L.
«Preparación de la vacuna viva PEDV (cepa P-5V) 1>>
El PEDV (cepa P-5V) concentrado de antígeno viral líquido 1 y microemulsión (nombre del producto: MONTANIDA IMS1313 VG, disponible en SEPPIC) se mezclaron en cantidades iguales (v/v) y se agitaron a temperatura ambiente (25±5°C) durante 5 minutos o más, para formar la "vacuna viva 1 contra PEDV (cepa P-5V)".
(Ejemplo de producción 2)
<Producción de vacuna viva PEDV (cepa P-5V) 2>
«Preparación de PEDV (cepa P-5V) concentrado de antígeno vírico líquido 2>>
La cepa P-5V del PEDV que se había aislado y preparado en el Ejemplo de producción 1 se inoculó en células Vero y se cultivó a 37°C durante 3 días. Se recogieron las células Vero y se sometieron a congelación y descongelación. A continuación, se centrifugó el producto obtenido mediante congelación y descongelación, y el sobrenadante así obtenido se recogió como "PEDV (cepa P-5V) virus antigen liquid 2". Al antígeno viral PEDV (cepa P-5V) líquido 2, se añadieron 7,5% (p/v) de polietilenglicol 6000 y 1M de cloruro sódico. El resultante se agitó a 4°C durante toda la noche, y los precipitados se recogieron mediante separación centrífuga. Los precipitados se disolvieron en solución salina fisiológica en una cantidad tal que es una vigésima parte de la cantidad (v/v) del antígeno vírico PEDV (cepa P-5V) líquido 2. A continuación, se centrifugó de nuevo el resultante, y el sobrenadante así obtenido se recogió como "PEDV (cepa P-5V) concentrado de antígeno vírico líquido 2".
El título del virus del líquido concentrado de antígeno viral 2 de PEDV (cepa P-5V) se midió mediante el procedimiento TCID<50>descrito en el apartado de "Medición del título del virus" del Ejemplo de producción 1. Como resultado, el título del virus PEDV (cepa P-5V) concentrado de antígeno vírico líquido 2 fue de 10<775>TCID<50>/1T1L.
«Preparación de la vacuna viva PEDV (cepa P-5V) 2>>
El antígeno vírico concentrado líquido 2 de PEDV (cepa P-5V) y la microemulsión preparada en el Ejemplo de producción 1 se mezclaron en cantidades iguales (v/v) y se agitaron a temperatura ambiente (25±5°C) durante 5 minutos o más, para formar la "vacuna viva 2 de PEDV (cepa P-5V)".
(Ejemplo de producción 3)
<Producción de la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 1>.
«Preparación de antígeno de virus inactivado PEDV (cepa P-5V) líquido 1>>
Al líquido concentrado de antígeno viral 1 del PEDV (cepa P-5V) obtenido en el Ejemplo de producción 1, se añadió formalina tampón neutra (disponible en KANTO CHEMICAL CO., INC.) para tener una concentración final del 0,2% (v/v). El resultante se agitó a 4°C durante 48 horas para inactivar el antígeno del virus PEDV (cepa P-5V), obteniéndose la "vacuna 1 inactivada PEDV (cepa P-5V)".
«Preparación de la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 1>>
El antígeno viral inactivado PEDV (cepa P-5V) líquido 1 y la microemulsión preparada en el Ejemplo de producción 1 se mezclaron en cantidades iguales (v/v) y se agitaron a temperatura ambiente (25±5°C) durante 5 minutos o más, para formar la "vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 1".
(Ejemplo de producción 4)
<Producción de vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 2>
«Preparación de antígeno vírico inactivado PEDV (cepa P-5V) líquido 2>>
Al líquido concentrado de antígeno viral 2 del PEDV (cepa P-5V) obtenido en el Ejemplo de producción 2, se añadió formalina tampón neutra (disponible en KANTO CHEMICAL CO., INC.) para tener una concentración final del 0,2% (v/v). El resultante se agitó a 4°C durante 48 horas para inactivar el antígeno vírico del PEDV (cepa P-5V), obteniéndose el "líquido 2 de antígeno vírico inactivado del PEDV (cepa P-5V)".
«Preparación de la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 2>>
El antígeno vírico inactivado PEDV (cepa P-5V) líquido 2 y la microemulsión preparada en el Ejemplo de producción 1 se mezclaron en cantidades iguales (v/v) y se agitaron a temperatura ambiente (25±5°C) durante 5 minutos o más, para formar la "vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 2".
(Ejemplo 1)
<Inmunización de cebado>
A un cerdo de ocho semanas negativo para el anticuerpo PED, se le administró oralmente una vez la vacuna viva 1 contra PEDV (cepa P-5V) (10 mL,10<80>TCID<50>/dosis) producida en el Ejemplo de producción 1.
<Inmunización de recuerdo>
Cuatro semanas después de la inmunización de cebado, la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 1 (2 mL,10<75>TCID<50>/dosis) producida en el Ejemplo de producción 3 se administró (inyectó) intramuscularmente una vez.
(Ejemplo comparativo 1)
<Inmunización de cebado>
A un cerdo de ocho semanas negativo para el anticuerpo PED, se le administró oralmente una vez el líquido concentrado de antígeno viral PEDV (cepa P-5V) (10 mL, 10<80>TCID<50>/dosis) producido en el Ejemplo de producción 1.
<Inmunización de recuerdo>
Cuatro semanas después de la inmunización de cebado, la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 1 (2 mL, 10<7 5>TCID<50>/dosis) producida en el Ejemplo de producción 3 se administró (inyectó) intramuscularmente una vez.(Ejemplo comparativo 2)
<Inmunización de cebado>
A un cerdo de ocho semanas negativo para el anticuerpo PED, se le administró (inyectó) intramuscularmente una vez la vacuna viva NISSEIKEN PED (disponible en Nisseiken Co., Ltd) (2 mL).
<Inmunización de recuerdo>
Cuatro semanas después de la inmunización de cebado, se administró (inyectó) intramuscularmente una vez la vacuna viva NISSEIKEN PED (disponible en Nisseiken Co., Ltd) (2 mL).
Tabla 2
(Ejemplo de prueba 1)
Se recogió sangre de los cerdos del Ejemplo 1, Ejemplo comparativo 1 y Ejemplo comparativo 2, inmediatamente antes de la inmunización de cebado y una semana después de la inmunización de recuerdo. Además, como control, la sangre se extrajo de un cerdo de ocho semanas de edad que era negativo para el anticuerpo PED y que no había sido sometido ni a la inmunización de cebado ni a la inmunización de recuerdo, cuando el cerdo tenía 8 semanas de edad, 12 semanas de edad y 13 semanas de edad. A continuación, se midió el título de anticuerpos neutralizantes del PEDV en la sangre recogida, y se examinó la inducción de la producción de IgA contra el PEDV de las siguientes maneras.
<Medida del título de anticuerpos neutralizantes del PEDV>
Las células Vero se sembraron en una placa de cultivo celular de 24 pocillos a 0,75*10<®>células/0,5 ml/pocillo y se cultivaron a 37°C durante 3 días. El suero porcino obtenido mediante la dilución seriada a 2 veces con un medio de cultivo se mezcló con un líquido viral que contenía la cepa P-5V (200 TCID<50>) en cantidades iguales, y el resultante se dejó reaccionar a 37°C durante 90 minutos. En este caso, el medio de cultivo se obtuvo como se describe a continuación. Específicamente, en MEM (500 mL) (disponible en Thermo Fisher Scientific), se disolvieron un extracto de levadura (disponible en Difco Laboratories) y un caldo de fosfato de triptosa (disponible en Difco Laboratories) de modo que la concentración final del extracto de levadura fuera del 0,02% (p/v), y la concentración final del caldo de fosfato de triptosa fuera del 0,03% (p/v). A continuación, se disolvieron en la misma penicilina (50.000 unidades) y estreptomicina (50 mg). El líquido de mezcla del suero y la cepa P-5V se inoculó en las células Vero y se cultivó a 37°C durante 90 minutos. Después de cambiar el medio de cultivo, el cultivo se realizó a 37°C durante 7 días. El efecto citopático (ECP) se observó utilizando un microscopio óptico y se midió el título de anticuerpos neutralizantes del PEDV. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 3. Nótese que, la unidad del título del anticuerpo neutralizante se presenta por una tasa de dilución (pliegue) del suero.
<Inducción de la producción de IgA contra PEDV>
«Detección de IgA frente a PEDV mediante transferencia Western >>.
En el Ejemplo 1, el Ejemplo comparativo 1 y el Ejemplo comparativo 2, cada sangre recogida una semana después de la inmunización de recuerdo se centrifugó para separar el suero. A continuación, se electroforizaron 200 pl del líquido vírico que contenía la cepa P-5V (10<70>TCID<50>/<1T1>L) en el gel SDS-PAGE, y a continuación se pasó a un filtro de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (disponible en Merck Millipore). El suero porcino, que se diluyó 100 veces en PBS (formulación: 8 g de NaCl , 0,2 g de KCl , 2,9 g de Na<2>HPO^12H<2>O, y 0,2 g de KH<2>PO<4>disueltos en agua destilada (1 L). La misma formulación se aplica a los siguientes Ejemplos de Prueba) a la que se añadió 3% (p/v) de leche desnatada y 0,05% (p/v) de Tween20, como anticuerpo primario, y un anticuerpo policlonal anti-IgA de cerdo marcado con HRP (disponible en Acris Antibodies) como anticuerpo secundario se utilizaron para detectar la IgA contra el PEDV utilizando un reactivo de detección (nombre del producto: ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, disponible en GE Healthcare).
A partir de los resultados del Western blotting, se evaluó la presencia o ausencia de inducción de producción de IgA contra el PEDV en base a los siguientes criterios de evaluación. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 3.
Criterios de evaluación
"-": No hubo actividad de inducción de producción de IgA contra el PEDV (no se detectó ninguna banda mediante Western blotting).
"+": Hubo actividad de inducción de producción de IgA contra el PEDV (La banda se detectó mediante Western blotting).
Tabla 3
Cuando la vacuna viva PEDV (cepa P-5V) que contenía el adyuvante se administró por vía oral en la inmunización de cebado (Ejemplo 1), se encontró una actividad de producción significativamente mejorada del anticuerpo neutralizante específico del PEDV y una actividad de inducción de la producción de IgA específica del PEDV, en comparación con el caso en que el PEDV no contenía adyuvante (Ejemplo comparativo 1) y el caso en que la vacuna convencional para administración intramuscular se administró dos veces (Ejemplo comparativo 2).
(Ejemplo de prueba 2)
Dos semanas después de la inmunización de recuerdo, los cerdos del Ejemplo 1 y del Ejemplo comparativo 1 fueron sometido a pruebas, mediante administración oral, con la cepa MZ0116-2/2013 que era una cepa de campo (en lo sucesivo, "cepa de campo MZ") (1050 TCID50/mL) (5 mL) aislada y preparada de las siguientes maneras. Como control, un cerdo de 14 semanas de edad que era negativo para el anticuerpo PED y que no había sido sometido ni a la inmunización de cebado ni a la inmunización de recuerdo fue sometido a prueba mediante la administración oral de la cepa de campo MZ (1050 TCID50/1T1L) (5 mL), como se ha descrito anteriormente. A continuación, se observaron sus síntomas clínicos, se detectaron los ARN del PEDV en las heces y los ARN del PEDV en los órganos de las siguientes maneras.
« Aislamiento y preparación del PEDV (cepa MZ0116-2/2013 (cepa de campo MZ))>>
Se recogió el intestino delgado del lechón que murió de diarrea epidémica porcina (PED). A continuación, se cargó el intestino delgado (0,5 g) en un tubo disruptor de microesferas (disponible en Bertin Technologies) y se trituró con una máquina de disrupción celular de alta velocidad (disponible en Precellys, Bertin Technologies). La suspensión resultante se suspendió en un medio de cultivo (MEM, disponible en Thermo Fisher Scientific) (5 mL), seguido de separación centrífuga. El sobrenadante después de la separación centrífuga se pasó a través de un filtro de jeringa (disponible en GE Healthcare Japón) con un tamaño de poro (diámetro de poro) de 0,22 pm para formar así una emulsión tisular al 10% en masa. A continuación, se preparó un líquido de mezcla obtenido mezclando la emulsión tisular al 10% en masa (300 pl) y un medio de cultivo con tripsina añadida a 10 pg/mL (100 pl). La cantidad total del líquido de la mezcla se inoculó en células Vero que se habían hecho confluentes previamente en una placa de cultivo celular de 6 pocillos y se cultivó a 37°C durante 90 minutos. A continuación, se extrajo el líquido de la mezcla y se le añadió un medio de cultivo con tripsina a 10 pg/mL (4 mL), tras lo cual se procedió al cultivo a 37°C. El efecto citopático (ECP) se observó cada día utilizando un microscopio óptico, y el cultivo se dio por finalizado en el momento en que se confirmó el ECP. El sobrenadante y las células se recogieron y se sometieron a congelación y descongelación. A continuación, el sobrenadante centrifugado se pasó al siguiente subcultivo.
«Identificación de la cepa MZ0116-2/2013>>
El análisis filogenético se realizó de la misma manera que en la "Identificación de la cepa P-5V", excepto que el sobrenadante de cultivo de la cepa P-5V se cambió por el sobrenadante de cultivo de la cepa de campo MZ en la "Identificación * de la cepa P-5V" del Ejemplo de producción 1.
Como resultado, la cepa obtenida anteriormente fue identificada como la cepa de campo MZ del Grupo genético II del PEDV (véase la FIG. 1).
<Observación de los síntomas clínicos>
Los lechones del Ejemplo 1, Ejemplo comparativo 1, y el control fueron observados cada día para el estado de las heces y el apetito en el Día 0 al Día 14 después del desafío con la cepa de campo MZ y fueron evaluados en base a los siguientes criterios de evaluación. Los resultados del estado de las heces se presentan en la siguiente Tabla 4 y los resultados del apetito se presentan en la siguiente Tabla 5.
Criterios de evaluación del estado de las heces
"0": Heces normales
"1": Heces sueltas
"2": Diarrea heces
"3": Diarrea acuosa heces
Criterios de evaluación del apetito
"0": Normal
"1": Anorexia leve
"2": Anorexia moderada
"3": Anorexia grave
Tabla 4
Tabla 5
Los estados de las heces del Ejemplo 1, del Ejemplo comparativo 1 y del control fueron de cero puntos, y no se encontraron diferencias (Tabla 4). Entretanto, se observó que el apetito del Ejemplo 1 era "normal", pero el Ejemplo comparativo 1 y el control presentaban anorexia (Tabla 5).
<Detección de ARN de PEDV en frotis rectal>
Del Día 0 al Día 14 después de la provocación con la cepa de campo MZ del Ejemplo 1, el Ejemplo comparativo 1 y el control, se utilizó un hisopo de algodón esterilizado (disponible en Osaki Medical Corporation) para recoger el hisopo rectal cada día y se suspendió en PBS (1 mL). La suspensión se centrifugó y el ARNm del virus se extrajo con el reactivo TRIZol (marca registrada) (disponible en Thermo Fisher Scientific). El ARN del PEDV se amplificó con un termociclador (Veriti 96-Well Thermal Cycler, disponible en Thermo Fisher Scientific) mediante RT-PCR utilizando SuperScript (marca registrada) III One-Step RT-PCR System (disponible en Thermo Fisher Scientific) y cebadores específicos del PEDV (el cebador 9-F [5-GATATGTTTGTAATGGTAACTC-3'] establecido en SEQ ID NO: 17 y el cebador 9-R [5-AGCATAGCTAAAAGGCAATGC-3'] establecido en SEQ ID NO: 18). Los productos amplificados de la RT-PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y el gel se tiñó con bromuro de etidio. A continuación, se detectó el ARN del PEDV mediante irradiación de rayos ultravioleta. Se calculó una tasa de incidencia (%) de individuos positivos en los que se detectó el ARN del PEDv con respecto al parámetro de población en cada grupo. Los resultados se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6
<Detección de ARN de PEDV en órganos>
El día 14 después de la prueba con la cepa de campo MZ, se extirparon el páncreas, el yeyuno/ileon, el ciego, el colon y el ganglio linfático mesentérico de cada individuo del Ejemplo 1, el Ejemplo comparativo 1 y el control, y se utilizaron para preparar una emulsión tisular al 10% en masa. El ARN del PEDV en cada órgano se extrajo de cada emulsión tisular al 10% en masa utilizando el reactivo TRIZol (marca registrada) (disponible en Thermo Fisher Scientific). A continuación, se cuantificó la cantidad de ARN (correspondiente a log-10 TCIC50/1T1L) mediante la RT-PCR en tiempo real utilizando el sistema GoTaq (marca registrada) 1-Step RT-qPCR System (disponible en Promega) y cebadores específicos del PEDV (el cebador 10-F [5'-CGCAAAGAc Tg Aa Cc CAc Ta AC-3'] establecido en SEQ ID NO: 19 y el cebador 10-R [5'-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3'] establecido en SEQ ID NO: 20) en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (disponible en Thermo Fisher Scientific). Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 7.
Tabla 7
A partir de los resultados de la Tabla 6, la tasa de incidencia de individuos positivos en los que se detectó el ARN del PEDV fue alta en el Ejemplo comparativo 1 y en el control. Mientras tanto, los individuos positivos en los que se detectó el ARN del PEDV no aparecieron en el Ejemplo 1 durante un periodo de observación. Además, como se observa en los resultados de la Tabla 7, tampoco se detectó ARN PEDV en cada órgano del Ejemplo 1.
Se cree que la IgA secretora segregada por la mucosa intestinal neutraliza el PEDV para lograr la inmunidad protectora de la infección en el Ejemplo 1.
Aquí, como se ve en el Ejemplo comparativo 1 y en el control de la Tabla 6, se sabe que incluso cuando los PEDVs no se detectan una vez, los PEDVs aparecen de nuevo y continúan viviendo durante aproximadamente 1 a 2 meses después de la infección.
(Ejemplo 2)
<Inmunización de cebado>
A un cerdo de ocho semanas de edad negativo para el anticuerpo PED, se le administró por vía nasal una vez la vacuna viva PEDV (cepa P-5V) 2 (1 mL, 10745 TCID50/dosis) producida en el Ejemplo de producción 2.
<Inmunización de recuerdo>
Seis semanas después de la inmunización de cebado, la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 2 (2 mL, 10775 TCID50/dosis) producida en el Ejemplo de producción 4 se administró (inyectó) intramuscularmente una vez.
Tabla 8
(Ejemplo de prueba 3)
La sangre del cerdo del Ejemplo 2 se recogió inmediatamente antes de la inmunización de cebado y una semana después de la inmunización de recuerdo. Además, cuando un cerdo de ocho semanas de edad que era negativo para el anticuerpo PED y no había sido sometido ni a la inmunización de cebado ni a la inmunización de recuerdo tenía 8 semanas de edad y 15 semanas de edad, se le extrajo sangre como control. A continuación, se examinaron el título de anticuerpos neutralizantes del PEDV en la sangre recogida y la inducción de la producción de IgA contra el PEDV de la misma manera que en el procedimiento descrito en <Medida del título de anticuerpos neutralizantes del PEDV> y la “Production induction of IgA against PEDV”; en el Ejemplo de prueba 1. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 9.
Tabla 9
Incluso cuando la vacuna viva PEDV (cepa P-5V) se administró por vía nasal en la inmunización de cebado, se encontró una actividad de producción significativamente mayor del anticuerpo neutralizante específico del PEDV y una actividad de inducción de la producción de IgA específica del PEDV similares al caso en que se administró por vía oral.
Convencionalmente, no se ha informado de que el PEDV infecte los órganos respiratorios, y la infección con el PEDV se restringe a los órganos digestivos. Por lo tanto, el hecho de que la administración nasal pueda inducir la producción del anticuerpo neutralizante específico del PEDV y de la IgA específica del PEDV es un hallazgo inesperado por los presentes inventores.
(Ejemplo de prueba 4)
Dos semanas después de la inmunización de recuerdo, el cerdo del Ejemplo 2 fue sometido apruebas con la cepa de campo MZ (1050 TCID50/1T1L) (5 mL) a través de la administración oral. Como control, se sometió a una prueba un cerdo de 16 semanas de edad que era negativo para el anticuerpo PED y que no había sido sometido ni a la inmunización de cebado ni a la inmunización de recuerdo mediante la administración oral de la cepa de campo MZ (1050 TCID50/1T1L) (5 mL) como se ha descrito anteriormente. A continuación, la detección del ARN PEDV en el hisopo rectal y la detección de los ARN PEDV en los órganos se realizaron de la misma manera que se describe en la <Detección del ARN PEDV en el hisopo rectal> del Ejemplo de prueba 2.
<Detección de ARN de PEDV en frotis rectal>
Se calculó la tasa de incidencia (%) de individuos positivos en los que se detectó el ARN del PEDV con respecto al parámetro de población en cada grupo. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 10.
Tabla 10
<Detección de ARN de PEDV en órganos>
El día 14 después de la provocación con la cepa de campo MZ, se extirparon el yeyuno/ileon, el ciego, el colon y el ganglio linfático mesentérico de cada individuo del Ejemplo 2 y del control. El ARN del PEDV en cada órgano se detectó de la misma manera que se describe en <Detection of PEDV RNA in organs> del Ejemplo de prueba 2 para cuantificar la cantidad de ARN (correspondiente a log-10 TCID50/mL). Los resultados se presentan en la Tabla 11.
Tabla 11
(Ejemplo 3)
<Inmunización de cebado>
A una cerda preñada negativa para el anticuerpo PED, se le administró por vía nasal una vez la vacuna viva PEDV (cepa P-5V) 2 (1 mL, 10745 TCID50/dosis) producida en el Ejemplo de producción 2.
<Inmunización de recuerdo>
Ocho semanas después de la inmunización de cebado, la vacuna inactivada PEDV (cepa P-5V) 2 (2 mL, 10775 TCID50/dosis) producida en el Ejemplo de producción 4 se administró (inyectó) intramuscularmente una vez.
(Ejemplo comparativo 3)
<Inmunización de cebado>
A una cerda preñada negativa para el anticuerpo PED, se le administró (inyectó) intramuscularmente una vez la vacuna viva NISSEIKEN PED (disponible en Nisseiken Co., Ltd) (2 mL).
<Inmunización de recuerdo>
Cuatro semanas después de la inmunización de cebado, se administró (inyectó) intramuscularmente una vez la vacuna viva NISSEIKEN PED (disponible en Nisseiken Co., Ltd) (2 mL).
Tabla 12
(Ejemplo de prueba 5)
Los lechones (Día 2 después del nacimiento) nacidos de las cerdas preñadas de los Ejemplos 3 y comparativo 3 fueron sometidos a pruebas cada uno con la cepa de campo MZ (101050 TCID50/mL) (5 mL) mediante administración oral. Como control, un lechón (día 2 después del nacimiento) nacido de la cerda gestante, que era negativo para el anticuerpo PED y no había sido sometido ni a la inmunización de cebado ni a la inmunización de recuerdo, fue sometido a pruebas con la cepa de campo MZ (1050 TCID50/1T1L) (5 mL) mediante administración oral. Aquí, después de que los lechones fueran sometidos a pruebas, las cerdas del Ejemplo 3 y del Ejemplo comparativo 3 convivieron con estos lechones.
<Título de anticuerpos neutralizantes contra PEDV en cerda>
La sangre de cada una de las cerdas preñadas (cerdas) del Ejemplo 3, del Ejemplo comparativo 3 y del control se recogió inmediatamente antes de la administración del cebado, una semana después de la administración del cebado y una semana después de someter a pruebas al lechón. El título de anticuerpos neutralizantes del PEDV en la sangre recogida se examinó de la misma manera que en el procedimiento descrito en <Medida del título de anticuerpos neutralizantes del PEDV> en el Ejemplo de prueba 1. Los resultados se presentan en la Tabla 13.
<Inducción de IgA contra PEDV en la leche de cerda>
Inmediatamente antes de que los lechones fueran sometidos a pruebas, se recogió la leche de cada una de las cerdas del Ejemplo 3, del Ejemplo comparativo 3 y del control. La IgA contra el PEDV en la leche se detectó de la misma manera que en el Ejemplo de prueba 1, excepto que la sangre se cambió por la leche en el procedimiento descrito en la «Detección de IgA contra el PEDV mediante Western blotting>> del Ejemplo de prueba 1. A continuación, se evaluó la presencia o ausencia de inducción de producción de IgA contra el PED<v>de la misma manera que en el Ejemplo de prueba 1. Los resultados se presentan en la Tabla 13.
Tabla 13
<Tasa de supervivencia de los lechones>
[0202] Del Día 0 al Día 7 después de que los lechones nacidos de las cerdas gestantes del Ejemplo 3, del Ejemplo comparativo 3 y del control fueran sometidos apruebas con la cepa de campo MZ, se confirmó cada día la tasa de supervivencia de los mismos. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 14.
Tabla 14
<Observación histopatológica del intestino delgado de lechón>
El intestino delgado de cada lechón extirpado en <Detection of PEDV RNA en órganos de lechones> se fijó con formol y se utilizó para preparar una sección de parafina mediante el procedimiento rutinario. A continuación, se utilizó xileno para eliminar la parafina de la sección de parafina. A continuación, para rehidratar la sección, ésta se sumergió en soluciones acuosas de etanol con gradientes de concentración para rehidratar la sección. A continuación, se utilizó agua destilada para eliminar el etanol. La muestra de sección de la que se había retirado el etanol se sumergió en una solución de hematoxilina durante 20 minutos y se lavó con agua destilada. A continuación, el espécimen seccionado se sumergió en una solución de eosina durante 2 minutos para teñirlo. La muestra de sección se deshidrató sumergiéndola en soluciones acuosas de etanol con gradientes de concentración y se sumergió en xileno para su aclarado, obteniéndose así una muestra de tejido. La muestra de tejido preparada se observó con un microscopio óptico y se realizaron evaluaciones exhaustivas, como la atrofia de las vellosidades, la vacuolización de las células de las vellosidades, la planarización de las vellosidades y la inflamación de la membrana basal de las vellosidades, basándose en los siguientes criterios de evaluación. Obsérvese que de una misma cerda nacieron varios lechones. Por lo tanto, para las puntuaciones de los criterios de evaluación, se ha calculado un valor medio de las puntuaciones de los lechones de cada uno de los grupos: Ejemplo 3, Ejemplo comparativo 3 y el control. A continuación, se confirmó la existencia de una diferencia significativa mediante la prueba t de Student. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 15.
Criterios de evaluación
"0" : Normal
"1" : Leve
"2" Moderado
"3" : Grave
Tabla 15
Aplicabilidad industrial
En la presente invención, una vacuna para uso según las reivindicaciones adjuntas en el procedimiento para prevenir la diarrea epidémica porcina, por administración oral o nasal, y la vacuna para uso según las reivindicaciones adjuntas en un procedimiento para prevenir la diarrea epidémica porcina por administración intramuscular son excelentes en la actividad de inducción de la producción del anticuerpo neutralizante específico del virus de la diarrea epidémica porcina y la actividad de inducción de la respuesta inmune humoral, y pueden usarse adecuadamente para prevenir la diarrea epidémica porcina.
Claims (4)
1. Una vacuna que comprende:
una vacuna viva de un virus de la diarrea epidémica porcina; y
un adyuvante para su uso en un procedimiento de prevención de la diarrea epidémica porcina, que comprende: administrar la vacuna por vía oral o nasal,
en la que la vacuna se utiliza para un cerdo al que posteriormente se administra una inmunización de recuerdo mediante la administración intramuscular de una vacuna inactivada del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante.
2. La vacuna para uso en el procedimiento según la reivindicación 1, en la que el adyuvante es un adyuvante en microemulsión.
3. Una vacuna que comprende:
una vacuna inactivada de un virus de la diarrea epidémica porcina; y
un adyuvante para su uso en un procedimiento de prevención de la diarrea epidémica porcina, que comprende administrar la vacuna por vía intramuscular,
en la que la vacuna se utiliza para un cerdo al que se ha administrado una inmunización de cebado mediante administración oral o nasal de una vacuna viva del virus de la diarrea epidémica porcina y un adyuvante.
4. La vacuna para uso en el procedimiento según la reivindicación 3, en la que el adyuvante es un adyuvante en microemulsión.
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