JP2018531265A6

JP2018531265A6 - ローソニア・イントラセルラリス感染から生じる障害に対してｍｄａ陽性動物を防御するためのワクチン

Info

Publication number: JP2018531265A6
Application number: JP2018519950A
Authority: JP
Inventors: ヤーコブス，アントニウス・アルノルドゥス・クリスティアーン
Original assignee: インターベットインターナショナルベー．フェー．
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2018-12-13
Anticipated expiration: 2036-10-21

Abstract

本発明は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染から生じる障害に対して動物を防御する方法における使用のための、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物への皮内投与のための不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原を含むワクチンに関する。

Description

発明の全般的分野
本発明は、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染から生じる障害に対して、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物を防御するためのワクチンに関する。

回腸炎としても公知の増殖性腸疾患は、偏性細胞内細菌であるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）により引き起こされる、世界中の離乳後のブタの一般的な腸疾患である。特徴的な病変は、回腸陰窩における未熟腸細胞の増殖であり、これらの細胞は、通常、それらの頂端細胞質内に原因細菌を含有する。剖検時に、組織学的病変は、特に腸細胞において、１．５〜２．５μｍの長さのビブリオ様形状細菌の可視化によりローソニア陽性として確認されうるが、腸間膜リンパ節においておよび陰窩間の粘膜固有層において位置するマクロファージ内でも確認されうる。腸細胞からの該細菌の排除は関連増殖性病変の消散をもたらし、このことは、陰窩に対する該細菌の直接的な局所効果を示している（ＭｃＯｒｉｓｔら，Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｒｅｓｏｌｖｉｎｇｌｅｓｉｏｎｓｉｎｐｏｒｃｉｎｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ：ｐｏｓｓｉｂｌｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１１５，１９９６，ｐｐ３５−４５）。これらの病変におけるローソニア・イントラセルラリスの存在は、疾患を発症している動物および無症状感染のみを示している動物の両方において、ＰＣＲを用いて実証されている。臨床症例は、通常、成長（ｇｒｏｗｅｒ）−仕上げ（ｆｉｎｉｓｈｅｒ）期間において見られ、幾つかのより高齢の仕上げブタにおいては、急性出血性形態が記録されている。

能動的防御を誘導することによりローソニア・イントラセルラリスと闘うためのワクチンは商業的に入手可能であり、当技術分野において記載されており、例えば、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍＶｅｔｍｅｄｉｃａ，ＵＳＡ）およびＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（ＭｅｒｃｋＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）の商品名で入手可能である。母体由来抗体はこれらのワクチンを阻害しうるであろう。

発明の目的
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染から生じる障害に対して、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体（ＭＤＡ）を有する動物、特にブタを防御するのに使用される、代替的であるが有効かつ安全なワクチンを提供することが本発明の１つの目的である。先行技術のワクチンより良好にＭＤＡを打ち破りうる、そのような方法において使用されるワクチンを提供することが、もう１つの目的である。

発明の概括
本発明の目的を達成するために、前記の「発明の全般的分野」の節において提示された、動物への皮内投与用のワクチンを本発明において案出した。この点に関して、無針ワクチン接種は皮内ワクチン接種と同じではないことが注目される。世界保健機関は、その２００９年８月２７日付けの論文（題名“ＩｎｔｒａｄｅｒｍａｌＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆＶａｃｃｉｎｅｓ；Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒｕｓｅｉｎｌｏｗ− ａｎｄｍｉｄｄｌｅ−ｉｎｃｏｍｅｃｏｕｎｔｒｉｅｓ”）において、「無針」ワクチン接種は「皮内」ワクチン接種を必ずしも意味しないことを明らかに示している（該総説の第３頁表１を参照されたい）。無針装置が「皮内ワクチン接種のために構成されている」場合にのみ、ワクチンは実際に（少なくとも部分的に）皮内に運搬される。そうでなければ、ワクチンはその全体が皮下または筋肉内に運搬されうる。

本発明はまた、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染から生じる障害に対して動物を防御するための、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物への皮内投与のためのワクチンの製造のための不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原の使用を可能にする。

同時に、本発明は、不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原を含むワクチンを皮内投与することにより、ローソニア・イントラセルラリスによる感染から生じる障害に対して、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物を防御するための方法を可能にする。

不活化ローソニアワクチンでの筋肉内ワクチン接種は当技術分野において既に記載されていることが注目される（とりわけ、ＷＯ２００９１４４０８８を参照されたい）。しかし、これは、そのようなワクチンの皮内ワクチン接種が、有効かつ安全なワクチンに明らかにつながることを意味せず、ましてや、該ワクチンが筋肉内適用された場合と少なくとも同等に良好に母体由来抗体を打ち破りうるワクチンにつながることは勿論意味しない。例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全の基礎（ＶａｃｃｉｎｅＳａｆｅｔｙＢａｓｉｃｓ）」と称されるｅラーニングコースを公開しており、このコースの第５３頁に、「投与経路は、ワクチン（または薬物）が身体と接触する経路である。これは免疫化の成功のための決定的に重要な要因である。物質は、進入部位から、その作用が生じることが望まれる身体部分へと輸送されなければならない。しかし、この目的に身体の輸送メカニズムを用いることは自明ではない。」と報告されている。これに関して、米国カリフォルニア州保健局予防接種部門（ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅｓ’ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＢｒａｎｃｈ）は適切な免疫化のための指針を公開している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｐｕｂｓ／ｐｉｎｋｂｏｏｋ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／ｄ／ｖａｃｃａｄｍｉｎ．ｐｄｆ）。投与部位に関して、それは第７頁第１段落全体において以下のとおりに記載している：「各ワクチンに関する推奨経路および部位は、臨床試験、実際の経験および理論的考慮に基づく。この情報は各ワクチンに関する製造業者の製品情報に含まれる。ワクチンの投与には５つの経路が用いられる。推奨経路からの逸脱はワクチンの有効性を低下させ、または局所的有害効果を増強しうる」。第１４頁に、米国で許可されている唯一の皮内ワクチンが取り上げられている：「皮内フルゾン（ＦｌｕｚｏｎｅＩｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）は、皮内経路により投与される、米国で許可されている唯一のワクチンである。それは１８〜６４歳の者における使用のみに関して承認されている。このフルゾン製剤は不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の筋肉内製剤と同じではない。他のＴＩＶ製剤は皮内経路により投与されるべきではない。」。

全体として、特定の部位におけるワクチン接種は単純ではなく、安全性および有効性を決定するための実験を要することが一般に公知である。

本発明の意味におけるワクチンは、一般に、免疫学的に有効な量（すなわち、野生型微生物でのチャレンジの負の効果を少なくとも低減するのに十分な程度で標的動物の免疫系を刺激しうる量）の１以上の抗原、例えば弱毒化もしくは死滅微生物および／またはそれらのサブユニット、または例えば生物の代謝産物のような任意の他の物質を含む、動物への適用に適した構成であることが注目され、それは、典型的には、医薬上許容される担体（すなわち、生物適合性媒体、すなわち、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示しうる対象動物における有意な有害反応を投与後に誘導しない媒体）、例えば、水および／または任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体、または固体担体、例えば、凍結乾燥ワクチンを得るために一般に使用されるもの（糖および／またはタンパク質に基づくもの）と組合され、免疫刺激剤（アジュバント）を所望により含んでいてもよく、それは、野生型微生物による感染から生じる障害に対して動物を防御するための、すなわち、そのような障害の予防、改善または治癒を補助するための免疫応答を、動物への投与の際に誘導する。

一般に、ワクチンは、医薬上許容される担体、例えば液体担体、例えば（所望により緩衝化されていてもよい）水、または固体担体、例えば、凍結乾燥ワクチンを得るために一般に使用されるものと抗原（または抗原を含有する組成物）とを混合することを基本的に含む、当技術分野で公知の方法を用いて製造されうる。所望により、ワクチンの意図される使用または要求される特性に応じて、他の物質、例えばアジュバント、安定剤、粘度調節剤または他の成分が加えられうる。

不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原は、組換え生産されたか否かに無関係に、生存ローソニア・イントラセルラリス細菌に由来する任意の非生存性ローソニア・イントラセルラリス抗原である。特に、不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原は、１）死菌、特に、死滅全細菌および／または（部分）溶菌細菌（一括して「バクテリン」とも称される）、および／または、２）対応する生存ローソニア・イントラセルラリス細菌により典型的に産生されるタンパク質および他の分子のようなサブユニットを含みうる。

本発明の第１の実施形態においては、ワクチンは１回のワクチン接種の後で防御を誘導し、すなわち、適切な防御レベルを得るために第２（「ブースター」とも称される）のワクチン接種は必要でない。本発明の第２の実施形態においては、抗原は死滅ローソニア・イントラセルラリス細菌（これは溶菌または他の非全細胞形態でありうる）を含む。

実施例
序論
この実験の目的は、ローソニアチャレンジに対して、ワクチン接種され野外条件下で維持されたブタに皮内投与されるローソニア抗原、特に、凍結乾燥ローソニアバクテリン（鉱油アジュバントワクチンにおいて再構成されたもの）の有効性を試験することであった。

実験計画
１７週齢の７５頭のブタ（２５頭のブタの３つの群）を２０ｍｌの均質化ローソニア感染腸粘膜で経口的にチャレンジした。第１群のブタはワクチン接種されていなかった（チャレンジ対照）。第２群のブタは、商業的に入手可能な皮内ワクチン接種装置ＩＤＡＬ（登録商標）（ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）を使用して、鉱油アジュバント化ワクチンにおいて再構成された凍結乾燥死滅全細胞ローソニア細菌（例えば、ＷＯ２００９１４４４０８８から公知のもの又は商業的に入手可能なワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ）で、頚部の皮内に１回（０．２ｍｌ）、３週齢においてワクチン接種されていた。第３群のブタは、一般的なシリンジを使用して、鉱油アジュバント化ワクチンにおいて再構成された凍結乾燥ローソニアで、頚部の筋肉内に１回（２ｍｌ）、３週齢においてワクチン接種されていた。チャレンジ後、ローソニア感染に関してブタを毎日観察した。チャレンジの前および後の一定の時点で、ブタの体重を測定し、血清（血清学）および糞便（Ｑ−ＰＣＲ）サンプルを集めた。チャレンジ後の第２１日に、ブタを死亡させ、死後検査した。ローソニア・イントラセルラリス感染を示す兆候に関して腸を巨視的に検査した。Ｑ−ＰＣＲおよび（免疫）組織学的スコア化（ＩＨＣ）のために回腸サンプルを集めた。

材料および方法
死亡前
チャレンジの１日前ならびにチャレンジ後の第６日、第１３日および第２０日に、ブタの体重を測定した。チャレンジの直前ならびにチャレンジ後の第７日および第１４日ならびに剖検中に、各ブタの糞便サンプル（グラム量）を集め、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で試験するまで冷蔵保存した。チャレンジの直前および３週間後（剖検の日）に血液サンプルを集めた。サンプルをローソニア抗体ＥＬＩＳＡで試験するまで、血清を凍結保存した。ＰＣＲに関しては、０．２ｇの糞便および／または粘膜サンプルからＤＮＡを単離し、ローソニア・イントラセルラリスのＡｓｐＡ遺伝子に対する定量的ＰＣＲを、Ｋａｐａプローブ高速ユニバーサルｑＰＣＲキットマスターミックス（Ｋａｐａｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。

死亡後
チャレンジの３週間後、ブタを安楽死させ、死後検査に付した。腸、特に回腸を、ローソニア感染を示す病変に関して検査した。回腸サンプルをｑＰＣＲおよび免疫組織学的スコア化（ＩＨＣ）のために集めた。小腸の遠位５０ｃｍ（回腸）を取ることにより、病変の総スコア化を行った。粘膜を以下のとおりにスコア化した：０＝正常、０．５＝軽微、１＝軽度、２＝中等度、３＝重度の肥厚および／または発赤；４＝フィブリンおよび／または壊死による重度の肥厚および／または発赤。粘膜肥厚および／または発赤に罹患した回腸の割合（％）もスコア化し（０〜１００％）、全病変スコアは回腸粘膜スコア×罹患回腸の割合（％）であった。

回腸サンプルの組織学的スコア化に関しては、各動物から（存在する場合には罹患領域から）サンプルを集めた。スライドを固定し、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ染色）で、および抗ローソニア・イントラセルラリスＭｏａｂを使用する免疫組織化学染色（ＩＨＣ染色）で染色し、顕微鏡で検査した。スコアは以下のとおりであった。ＨＥ染色においては、０＝異常は検出されず、０．５＝疑わしい病変、１＝軽度の病変、２＝中程度の病変、３＝重度の病変。ＩＨＣ染色においては、０＝明らかな細菌は存在せず、０．５＝細菌の疑わしい存在、１＝スライド内の単一／少数の細菌の存在、２＝スライド内の中等度の数の細菌の存在、３＝スライド内の多数の細菌の存在。総組織学的スコア＝ＨＥスコア×ＩＨＣスコア。

結果
ｑＰＣＲ、陽性の死後スコアおよび／または組織学的スコアにより証明されるとおり、全ての対照動物が感染し、このことはチャレンジの成功を証明している。ワクチン接種によると考えられうる有害事象は記録されなかった。したがって、ワクチンは安全だとみなされうる。主要有効性パラメータ、すなわち、粘膜サンプルに対するｑＰＣＲ（感染）、糞便サンプルに対するｑＰＣＲ（排出）および（免疫）組織学的回腸病変スコアに関して、統計を示した。これらのパラメータはローソニア感染に直接的に関連づけられうる。全ての試験に関して、有意水準（α）は０．０５に設定され、検定は両側検定であった。

チャレンジの当日（１７週齢）、対照群の２４頭のブタは血清陰性であり（すなわち、＜３．９ｌｏｇ２）、３．０ｌｏｇ２の平均力価を示した。第２群および第３群のブタは、それぞれ、５．７および５．５ｌｏｇ２の平均力価を示した。ローソニアでのチャレンジの後、全ての群は抗体力価の増加を示した。ブタは野外研究から得られた。この研究から、３週齢（すなわち、ワクチン接種の日）の多数のブタは、ワクチン接種後に典型的に得られる力価（典型的には約６〜８ｌｏｇ２）を遥かに超える１１．７ｌｏｇ２までの非常に高い（母体由来）抗体力価を有することが明らかとなった。抗体が実際に母体由来であったかどうかを調べるために、それぞれの成熟雌ブタの血液サンプルも採取し、ローソニア抗体に関して試験した。成熟雌ブタおよび子ブタの抗体力価の間で非常に良好な相関が認められたことは、該子ブタの抗体力価が母体由来であることを証明するものであった。ワクチン接種とチャレンジとの間の１４週間の間、対照群における抗体力価は血清陰性まで減少した。高い母体由来の抗体力価にもかかわらず、両方のワクチン接種群は、対照と比較して明らかな抗体応答を示した。

平均１日体重増加（ＡＤＷＧ）、ＰＣＲおよび死後スコアに関するデータを表１に示す。チャレンジ後の第３週においてＡＤＷＧ（ｋｇ単位）を評価した。なぜなら、ローソニア感染はほぼその時点においてそのピークに達するからである。ＰＣＲデータはｌｏｇ_１０ｐｇＤＮＡ／μｌ単位で示されている。

「ＩＤ」群における全ての主要パラメータおよびＡＤＷＧは、チャレンジ対照とは有意に異なっていた。「ＩＭ」群に関しては、これは糞便（第２１日）のＰＣＲおよび粘膜のＰＣＲの場合であった。

非常に高いＭＤＡレベルにもかかわらず、ワクチン接種はうまくいったようであった。ＩＤワクチン接種は、より良好なＡＤＷＧおよびより低い全体的スコアに基づけば、ＩＭワクチンより優れているようであった。

Claims

ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染から生じる障害に対して、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物をワクチンの皮内投与により防御するための方法における使用のための、不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原を含むワクチン。
１回のワクチン接種の後でワクチンが防御を誘導することを特徴とする、請求項１記載の使用のためのワクチン。
抗原が死滅ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細菌を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染から生じる障害に対して動物を防御するための、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物への皮内投与のためのワクチンの製造のための、不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原の使用。
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原を含むワクチンを皮内投与することにより、ローソニア・イントラセルラリスによる感染から生じる障害に対して、ローソニア・イントラセルラリスに対する母体由来抗体を有する動物を防御するための方法。