ES2899204T3 - Composiciones de vacuna novedosas para el virus de la diarrea epidémica porcina - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna que comprende virus inactivado de la diarrea epidémica porcina (PEDV), adyuvado como una emulsión de aceite en agua, en la que los componentes adyuvantes incluyen lecitina en aceite mineral liviano e hidróxido de aluminio.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de vacuna novedosas para el virus de la diarrea epidémica porcina

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a composiciones de vacuna novedosas que protegen a los cerdos de la enfermedad causada por el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV).

Antecedentes de la invención

La diarrea epidémica porcina (PED) es altamente contagiosa y se caracteriza por la deshidratación, la diarrea y la alta mortalidad en los cerdos, especialmente en los lechones jóvenes. El agente causante, el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo identificado con el género Alphacoronoavirus de la familia Coronaviridae. El PEDV tiene un genoma de aproximadamente 28kb y contiene 7 marcos de lectura abiertos. Los síntomas de la infección por el PEDV suelen ser similares a los causados por el virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV), también miembro de los Coronaviridae. Cabe señalar que, por lo general, no se observa una protección cruzada entre el PEDV y el TGEV, ya que las secuencias generales de nucleótidos virales son, como máximo, similares en un 60%.

Es probable que la PED se haya observado por primera vez en Europa alrededor de 1970, y el virus causante se caracterizó posteriormente (véase, por ejemplo M. Pensaert et al. Arch. Virol, v. 58, pp 243-247, 1978 y D. Chasey et al., Res. Vet Sci, v. 25, pp 255-256, 1978). La enfermedad de la PED se consideraba generalmente desconocida en Norteamérica hasta 2013, momento en el que empezaron a producirse brotes generalizados y se produjeron graves pérdidas económicas en la industria porcina. Los aislados prototipos norteamericanos han permanecido genéticamente relacionados (es decir, con una identidad nucleotídica general superior al 99%), y son similares a las cepas asiáticas caracterizadas allí unos años antes de los brotes norteamericanos. Por lo general, el PEDV crece mal en cultivo, y es necesario identificar tanto las cepas particulares como las condiciones de cultivo que son apropiadas para el cultivo de un número suficiente de virus para la preparación de vacunas comerciales. Además, es necesario desarrollar vacunas que proporcionen una protección cruzada eficaz contra los aislados conocidos del PEDV, y que se espera proporcionen una protección cruzada eficaz contra las cepas evolutivas no prototipo del PEDv . El documento KR 20100129247 A desvela una composición de vacuna que comprende PEDV inactivado adyuvado con una emulsión de aceite en agua que comprende hidróxido de aluminio. El documento WO 93/19779 A1 desvela vacunas de Pasteurella haemolytica adyuvadas con Amphigen® e hidróxido de aluminio.

Además, recientemente se han identificado en Europa cepas variantes del PEDV (por ejemplo Calaf14, véase SEQ ID NÚM. 1, 4 para la secuencia de la proteína S), que son diferentes en forma reconocida de las cepas europeas conocidas. Estas cepas variantes (similares a Calaf14 de acuerdo con la secuencia de la proteína de espiga) también han aparecido en Norteamérica, y anteriormente en Asia, y pueden ser más similares entre sí que a las cepas prototipo. Por consiguiente, es necesario identificar tanto las cepas de vacunas como las composiciones de vacunas adecuadas que sean eficaces contra los brotes actuales y emergentes del PEDV en todo el mundo, proporcionando así la necesaria protección cruzada.

El deltacoronavirus porcino (PDCoV) es un miembro de un nuevo grupo de coronavirus que fue identificado inicialmente como "Coronavirus de grupo 3c" por Woo et al. (J Virol., 83(2):908-917, 2009) en varias especies de aves. Posteriormente, estos virus se reclasificaron como "deltacoronavirus", y se han identificado en otras especies aviares, así como en cerdos (Woo et al., J Virol., 86(7):3995-4007, 2012 Marthaler et al., Genome Announc., 2(2):e00278-14, 2014 Li et al., Genome Announc., 2(2):e00278-14, 2014 Wang et al., Genome Announc., 2(2):e00291-14, 2014 Wang et al., Emerg. Infect. Dis., 20(7):1227-1230, 2014). El tamaño del genoma de los deltacoronavirus (-25-26 kb) es menor que el del PEDV y otros alfacoronavirus, que pueden acercarse a 32 kb.

Hasta la fecha, el PDCoV se ha detectado al menos en Hong Kong, Canadá, China y los Estados Unidos, y aunque la tasa de mortalidad en lechones notificada para las infecciones por PDCoV (30-40%) es aparentemente inferior a la que se suele observar con la infección por PEDV, la interpretación de los datos de campo suele ser difícil, ya que las coinfecciones con PEDV y otros patógenos intestinales son comunes (EFSA Journal, 12(10):3877, 2014). Aunque es necesario conocer mejor la patogénesis y las implicaciones clínicas del PDCoV, este virus recientemente identificado parece ser un patógeno emergente en los cerdos. Por lo tanto, se desean composiciones de vacuna eficaces para tratar y prevenir la enfermedad causada por el PDCoV, así como vacunas combinadas que prevengan y/o traten tanto las enfermedades causadas por el PEDV como por el PDCoV.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende el virus inactivado de la diarrea epidémica porcina (PEDV), adyuvado como una emulsión de aceite en agua, en la que los componentes adyuvantes incluyen lecitina en aceite mineral liviano e hidróxido de aluminio. La composición de vacuna se proporciona en una cantidad eficaz para provocar la producción de anticuerpos neutralizantes en los cerdos. Las composiciones de vacuna de la invención protegen a los cerdos de la infección por el PEDV, y son eficaces en dosis únicas, en programas de dos dosis, o en programas de vacunación que incluyen múltiples dosis, que pueden estar separadas por al menos una semana, y opcionalmente en intervalos de tiempo mayores, como de uno a varios meses. Se debe tener en cuenta que, dependiendo del nivel de amenaza epidémica en una población porcina concreta, el programa de dosis de vacunas de una, dos o múltiples dosis puede repetirse, de tanto en tanto, como medida de precaución. Además, se debe tener en cuenta que la vacunación de una cerda madre durante la gestación proporcionará protección a un lechón joven, a través de la transferencia materna de anticuerpos y células T en la leche, aunque dicha protección puede necesitar un seguimiento con dosis de vacunación adicionales para el lechón. Se contempla la vacunación de todos los cerdos, incluidos los lechones y los adultos.

Cabe señalar que, aunque las cepas prototipo norteamericanas del PEDV utilizadas en la práctica de la invención son útiles para controlar los brotes de la enfermedad en Norteamérica (y, de hecho, la vacuna USA/Colorado/2013, véase más adelante, ha sido autorizada para este fin), inesperadamente se ha descubierto que dichas vacunas de cepas prototipo norteamericanas también son protectoras cruzadas contra las cepas europeas y asiáticas en general, y también son eficaces contra los aislados emergentes de la enfermedad PEDV, como los que parecen similares a Calaf14 (y otras cepas emergentes europeas, asiáticas y norteamericanas) en base a la secuencia de espigas. Un ejemplo de una cepa emergente norteamericana "similar a Calaf14" es PEDV-INDEL (OH851), aislada por primera vez por el Ohio Department of Agriculture (L. Wang et al., Emerg. Infect. Dis., 2014, v. 20, pp. 917-919). De hecho, al parecer las cepas norteamericanas circulantes se agrupan ahora en 2 clados distintos, el clado recientemente emergente que tiene inserciones y deleciones en el gen de la espiga (S-INDELS) que comparten todos el 98-100% de identidad a nivel de nucleótidos (gen de la espiga), pero tales aislados recientes sólo presentan aproximadamente 96-97% de identidad a nivel de nucleótidos (gen de la espiga) con las cepas norteamericanas iniciales (prototipo) (véase también A. Vlasova et al. "Distinct Characteristics and Complex Evolution of PEDV Strains, North America, May 2013-February 2014", Emerging Infectious Disease, Vol 20, No. 10, 2014. Estos S-INDEL tienden a ser menos virulentos y se atenúan más fácilmente para uso en vacunas vivas. La primera divulgación pública de S-INDEL norteamericanos puede ser la del Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, el 30 de enero de 2014, definida por tener sólo 93,9-94,6% de identidad con las cepas estadounidenses previamente identificadas, pero siendo casi idénticas (99+%) entre sí. Las inserciones y deleciones útiles no tienen por qué limitarse al gen de la espiga. Las modificaciones de ORF3 (especialmente las deleciones) se han relacionado con la adaptación al cultivo celular y la reducción de la patogenicidad (véase S-J. Park et al., Virus Genes, 2008, v 36, pp. 95-104y otros (véase J. Zhang et al. Journal of Clinical Microbiology, v. 52(9), pp. 3511-3514, 2014) han comentado que la clasificación de los PEDV en base a ORF3 puede ser apropiada. También se han identificado previamente cepas del tipo INDEL en Asia. Véase, por ejemplo, D. S. Song et al., Research in Veterinary Science, v 82, pp. 134-140, 2007 S-J Park et al., Virus Genes, v 35, pp. 55-64, 2007y su discusión por D. Song et al. (Virus Genes (2012) v 44 pp. 167-175) que se refiere a la cepa DR13, pasada al nivel 100, y previamente autorizada en Corea (véase también Patente KR 0502008). Finalmente T. Oka et al., Veterinary Microbiology, 173, pp 258-269 (2014) desvelan otras cepas S-INDEL, y una cepa PEDV relacionada con las cepas virulentas prototipo, pero que lleva una gran deleción de 197 aminoácidos de la proteína S, posiblemente resultante del pasaje.

Por lo tanto, de acuerdo con la práctica de la presente invención, se proporcionan vacunas contra el PEDV en base a virus inactivados, como la cepa inactivada USA/Colorado/2013 (SEQ ID NÚM.: 7), que son muy eficaces, incluso a nivel mundial (para incluir América del Norte, Europa y Asia), incluso contra cepas prototipo e INDEL. En otro aspecto importante de la invención, también se proporcionan vacunas contra el PEDV en base a la cepa Calaf14 (ya sean inactivadas o vivas) que son igualmente eficaces en todo el mundo. Por lo tanto, las composiciones de vacuna de la presente invención son útiles para proteger a los cerdos de la enfermedad o el desafío por PEDV en general, a nivel mundial, incluyendo los aislados más recientes, tales como, pero sin limitación a los aislados que muestran homología con las variantes norteamericanas S-INDEL, tal como OH851, u otras variantes emergentes. A este respecto, se concede protección contra todas las cepas prototipo, INDEL u otras variantes mencionadas en el párrafo inmediatamente anterior.

La composición de la vacuna de la presente invención también puede abarcar un PEDV y un PDCoV inactivado. Además, la composición de la vacuna puede comprender otros antígenos porcinos, incluyendo Escherichia coli y Clostridium perfringens, tipos A-D, cuyas dosis son equivalentes a las que se encuentran en las vacunas disponibles en el mercado, Gletvax® y Litterguard®. Las vacunas pueden contener uno o más adyuvantes, y opcionalmente uno o más excipientes, en una cantidad eficaz para provocar la producción de anticuerpos neutralizantes en los cerdos. El adyuvante proporciona preferentemente una emulsión de aceite en agua con componentes adicionales. Las composiciones de vacuna de la invención protegen a los cerdos de la infección por el PEDV y, si el antígeno del PDCoV está presente en la composición, del PDCoV, y son eficaces en dosis únicas, en programas de dos dosis o en programas de vacunación que incluyen múltiples dosis, que pueden estar separadas por al menos una semana, y opcionalmente en intervalos de tiempo mayores, como de uno a varios meses.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1 a 3 representan ciertos aspectos de la optimización del pasaje del PEDV en las células Vero 76 en base a la detección de la morfología de las células infectadas (cepa USA/Colorado/2013, SEQ ID NÚM.: 7).

La Figura 1 muestra células Vero infectadas por el PEDV con el "efecto burbuja" causado por el virus.

La Figura 2 muestra células Vero infectadas por el PEDV que evidencian una "capa pelicular" circundante.

La Figura 3 muestra células Vero no infectadas, mostrando en cambio el efecto de una alta concentración de tripsina, pero sin infección por PEDV.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos del aislado español Calaf14 reciente correspondiente a la proteína de la espiga (SEQ ID NÚM.: 1)

La Figura 5 muestra una comparación de las identidades porcentuales de las secuencias de aminoácidos (proteína de la espiga) para varios aislados europeos y norteamericanos.

La Figura 6 muestra un árbol filogenético de numerosos aislados conocidos del PEDV en base a la proteína de la espiga, de acuerdo con los localizadores de sus registros de depósito.

La Figura 7 proporciona una tabla de puntuaciones de identidad de las secuencias completas de codificación de la proteína de la espiga para tres aislados europeos del PEDV, CV777, Br1-87 y Calaf14.

La Figura 8 proporciona una tabla de puntuaciones de identidad de aminoácidos de la proteína de la espiga completa para tres aislados europeos del PEDV, CV777, Br1-87 y Calaf14

La Figura 9 muestra las alineaciones de la secuencia completa de aminoácidos para las proteínas de espiga (S) de longitud completa para las cepas europeas CV777, BR1-87 y Calaf14. (SEQ ID NÚM.: 6, 5 y 4, respectivamente). Comenzando por el amino-terminal, los Paneles A a E muestran, consecutivamente, la secuencia de aminoácidos que terminan, respectivamente, en los residuos 250, 550, 850, 1150, para luego terminar aproximadamente en la posición 1383.

La Figura 10 muestra las alineaciones de la secuencia de nucleótidos de codificación completa para las proteínas de espiga (S) de longitud completa para las cepas europeas CV777, BR1-87 y Calaf14 (SEQ ID NÚM.: 3, 2 y 1, respectivamente). Comenzando por el amino-terminal, los Paneles A a R muestran, consecutivamente, la secuencia de residuos de ácido nucleico que termina, respectivamente, en los residuos 240, 480, 720, 960, 1200, 1440, 1680, 1920, 2160, 2400, 2640, 3120, 3360, 3600, 3840, 4080, y que termina aproximadamente en la posición 4140.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NÚM.: 1 proporciona, como versión de ADN, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de espiga de la cepa Calaf14 del PEDV.

SEQ ID NÚM.: 2 proporciona, como versión de ADN, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de espiga de la cepa Br1-87 del PEDV.

SEQ ID NÚM.: 3 proporciona, como versión de ADN, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de espiga de la cepa CV777 del PEDV.

SEQ ID NÚM.: 4 proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína de espiga de la cepa Calaf14 del PEVD.

SEQ ID NÚM.: 5 proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína de espiga de la cepa Br1-87 del PEVD.

SEQ ID NÚM.: 6 proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína de espiga de la cepa CV777 del PEVD.

SEQ ID NÚM.: 7 proporciona, como versión de ADN, la secuencia completa de nucleótidos que codifica el virus PEDV de USA/Colorado /2013.

SEQ ID NÚM.: 8-10 proporciona la secuencia de nucleótidos de los oligonucleótidos utilizados en los procesos de clonación.

SEQ ID NÚM.: 11 proporciona, como versión de ADN, la secuencia completa de nucleótidos que codifica para el virus PDCoV USA/Indiana/2014/8501010.

SEQ ID NÚM.: 12 proporciona, como versión de ADN, la secuencia completa de nucleótidos que codifica el virus PDCoV NVSL USA/Michigan/8977/2014.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona vacunas novedosas y eficaces útiles para prevenir la enfermedad causada por PEVD.

Definiciones

Las vacunas pueden ser más eficaces si se incluye un adyuvante apropiado en la composición. El término "adyuvante" se refiere generalmente a cualquier material que aumenta la respuesta inmunitaria humoral o celular a un antígeno. Los adyuvantes se utilizan para cumplir dos objetivos: Ralentizar la liberación de antígenos desde el lugar de la inyección y potenciar la estimulación del sistema inmunitario. Las vacunas tradicionales se componen generalmente de una preparación cruda de microorganismos patógenos inactivados o muertos o modificados. Las impurezas asociadas a estos cultivos de microorganismos patológicos pueden actuar como adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria. Sin embargo, la inmunidad invocada por las vacunas que utilizan preparaciones homogéneas de microorganismos patológicos o subunidades proteicas purificadas como antígenos suele ser escasa. Por lo tanto, se hace necesaria la adición de ciertos materiales exógenos, tal como un adyuvante. Además, en algunos casos, la producción de vacunas sintéticas y subunidades puede ser costosa. Además, en algunos casos, el patógeno no puede cultivarse a escala comercial, por lo que las vacunas sintéticas/subunitarias representan la única opción viable. La adición de un adyuvante puede permitir el uso de una dosis menor de antígeno para estimular una respuesta inmune similar, reduciendo así el coste de producción de la vacuna. Por lo tanto, la eficacia de algunos agentes medicinales inyectables puede aumentar significativamente cuando el agente se combina con un adyuvante.

Se deben tener en cuenta muchos factores en la selección de un adyuvante. Un adyuvante debe causar una tasa relativamente lenta de liberación y absorción del antígeno de manera eficiente con un mínimo de efectos tóxicos, alergénicos, irritantes y otros indeseables para el huésped. Para ser deseable, un adyuvante no debe ser viricida, ser biodegradable, capaz de crear sistemáticamente un alto nivel de inmunidad, capaz de estimular la protección cruzada, compatible con múltiples antígenos, eficaz en múltiples especies, no tóxico y seguro para el huésped (por ejemplo, sin reacciones en el lugar de la inyección). Otras características deseables de un adyuvante son que sea capaz de microdosificación, que ahorre dosis, que tenga una excelente estabilidad de almacenamiento, que se pueda secar, que no tenga aceite, que pueda existir como sólido o líquido, que sea isotónico, que se pueda fabricar fácilmente y que su producción sea barata. Por último, es muy deseable que un adyuvante sea configurable para inducir una respuesta inmunitaria humoral o celular, o ambas, en función de los requisitos del escenario de vacunación. Sin embargo, el número de adyuvantes que pueden cumplir los requisitos anteriores es limitado. La elección de un adyuvante depende de las necesidades de la vacuna, ya sea un aumento de la magnitud o la función de la respuesta de anticuerpos, un aumento de la respuesta inmunitaria mediada por células, una inducción de la inmunidad de las mucosas o una reducción de la dosis de antígeno. Se han propuesto varios adyuvantes, pero ninguno ha demostrado ser idóneo para todas las vacunas. El primer adyuvante del que se informó en la literatura fue el Adyuvante Completo de Freund (FCA), que contiene una emulsión de agua en aceite y extractos de micobacterias. Desgraciadamente, el FCA se tolera mal y puede provocar una inflamación incontrolada. Desde el descubrimiento del FCA, hace más de 80 años, se han realizado esfuerzos para reducir los efectos secundarios no deseados de los adyuvantes.

Algunos otros materiales que se han utilizado como adyuvantes incluyen óxidos metálicos (por ejemplo, hidróxido de aluminio), alumbre, quelatos inorgánicos de sales, gelatinas, diversos aceites de tipo parafina, resinas sintetizadas, alginatos, compuestos mucoides y polisacáridos, caseinatos y sustancias derivadas de la sangre como coágulos de fibrina. Aunque estos materiales son generalmente eficaces para estimular el sistema inmunitario, ninguno ha resultado totalmente satisfactorio debido a los efectos adversos en el huésped (por ejemplo, producción de abscesos estériles, daños en los órganos, carcinogenicidad o respuestas alergénicas) o a las propiedades farmacéuticas indeseables (por ejemplo, dispersión rápida o mal control de la dispersión desde el lugar de la inyección, o hinchazón del material).

La "respuesta inmunitaria celular" o "respuesta inmunitaria mediada por células" es aquella mediada por los linfocitos T u otros glóbulos blancos o ambos, e incluye la producción de citocinas, quimiocinas y moléculas similares producidas por los linfocitos T activados, los glóbulos blancos o ambos; o una respuesta de los linfocitos T u otra célula inmunitaria que mata a una célula infectada.

El término "emulsionante" se utiliza ampliamente en la presente divulgación. Incluye sustancias generalmente aceptadas como emulsionantes, por ejemplo, diferentes productos de las líneas de productos TWEEN® o SPAN® (ésteres de ácidos grasos del sorbitol polietoxilado y tensioactivos de sorbitán sustituidos por ácidos grasos, respectivamente), y diferentes potenciadores de la solubilidad, como el aceite de ricino PEG-40 u otro aceite hidrogenado PEGilado.

La "respuesta inmune humoral" se refiere a la que está mediada por anticuerpos. "Respuesta inmunitaria" en un individuo se refiere al desarrollo de una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria humoral y celular a un antígeno. Las respuestas inmunitarias pueden determinarse normalmente mediante inmunoensayos y ensayos de neutralización estándar, conocidos en la técnica.

"Cantidad inmunológicamente protectora" o "cantidad inmunológicamente eficaz" o "cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria" de un antígeno es una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunógena en el receptor. La respuesta inmunogénica puede ser suficiente para fines de diagnóstico u otras pruebas, o puede ser adecuada para prevenir los signos o síntomas de la enfermedad, incluidos los efectos adversos para la salud o sus complicaciones, causados por la infección con un agente patógeno. Se puede inducir inmunidad humoral, inmunidad celular o ambas. La respuesta inmunogénica de un animal a una composición inmunogénica puede evaluarse, por ejemplo, indirectamente a través de la medición de los títulos de anticuerpos, ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente a través de la supervisión de los signos y síntomas después del desafío con la cepa de tipo salvaje, mientras que la inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción de los signos clínicos como la mortalidad, la morbilidad, el número de temperatura, la condición física general, y la salud y el rendimiento general del sujeto. La respuesta inmunitaria puede comprender, sin limitación, la inducción de la inmunidad celular y/o humoral. "Inmunogénico" significa que evoca una respuesta inmunitaria o antigénica. Por lo tanto, una composición inmunogénica sería cualquier composición que induzca una respuesta inmunitaria.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un antígeno o vacuna que induciría una respuesta inmunitaria en un sujeto que recibe el antígeno o la vacuna que es adecuada para prevenir o reducir los signos o síntomas de la enfermedad, incluidos los efectos adversos para la salud o las complicaciones de la misma, causados por la infección con un patógeno, como un virus o una bacteria. Se puede inducir inmunidad humoral, inmunidad celular o ambas. La respuesta inmunogénica de un animal a una vacuna puede ser evaluada, por ejemplo, indirectamente a través de la medición de los títulos de anticuerpos, ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente a través del seguimiento de los signos y síntomas tras el desafío con la cepa de tipo salvaje. La inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción de los signos clínicos como la mortalidad, la morbilidad, el número de temperatura, la condición física general y la salud y el rendimiento generales del sujeto. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo del adyuvante particular utilizado, el antígeno particular utilizado, o la condición del individuo, y puede ser determinada por un experto en la materia.

"TCID⁵⁰" se refiere a la "dosis infectiva de cultivo de tejidos" y se define como la dilución de un virus necesaria para infectar el 50% de un lote determinado de cultivos celulares inoculados. Se pueden utilizar varios procedimientos para calcular la TCID⁵⁰, incluido el procedimiento de Spearman-Karber que se utiliza en esta especificación. Para una descripción del procedimiento Spearman-Karber, véase B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25­ 46 (1996).

Vacunas y composiciones inmunoaénicas

La composición de vacuna de la presente invención induce al menos una de varias respuestas inmunitarias humorales y celulares en un sujeto porcino al que se le ha administrado una composición de vacuna de la invención. En general, las composiciones de vacuna de la invención pueden administrarse a cerdos de cualquier edad, ya sean machos o hembras, independientemente de su estado reproductivo, y aunque se contempla que lo más habitual es un régimen de dos dosis, los tratamientos de vacuna de dosis única y de dosis múltiple también son eficaces en la práctica de la invención. Un virus más preferente para uso de acuerdo con todos los aspectos de la invención en relación con el PEDV es USA/Colorado/2013, cuya secuencia está depositada con el número de acceso de GenBank KF272920, del NCBI de los United States National Institutes of Health. Bethesda, MD (véase SEQ ID NÚM.:7 para la secuencia de codificación como ADN).

Otro virus preferente es Calaf14, como se explica más adelante (véase SEQ ID NÚM.: 1,4). Los más preferentes son los virus codificados a partir de una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad del 99,0, 99,5 y 99,9% con la secuencia codificadora completa de Calaf14 o el gen de la espiga.

Un virus preferente relacionado con el PDCoV es USA/Michigan/8977/2014, cuya secuencia está depositada con el número de acceso de GenBank KM012168 (véase SEQ ID NÚM.: 12 para codificar la secuencia como ADN). Otro virus preferente relacionado con el PDCoV es USA/Indiana/2014/8501010 (véase SEQ ID NÚM.: 11 para codificar la secuencia como ADN).

GenBank® es la base de datos reconocida de secuencias genéticas de US-NIH, que comprende una colección anotada de secuencias de ADN disponibles públicamente, y que además incorpora envíos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL) and the DNA DataBank of Japan (Dd BJ), véase Nucleic Acids Research, January 2013,v 41(D1) D36-42 para su discusión.

Aislados virales

Las composiciones de vacuna adyuvadas de la invención incorporan eficazmente todas las cepas o aislados reconocidos del PEDV, incluidas las cepas aisladas de Europa, Asia y América del Norte, incluyendo preferentemente todas las cepas que tienen al menos aproximadamente 80% de identidad nucleotídica global con la cepa norteamericana USA/Colorado/2013, depositada como número de acceso de GenBank KF272920 (véase SEQ ID NÚM.:7 para su stock de semillas, mostrado como copia de ADN). Preferentemente, la homología global de los nucleótidos es de 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más con respecto a USA/Colorado/2013, más preferentemente al menos de 95% o más. Por consiguiente, las cepas representativas adicionales útiles en la práctica de todos los aspectos de la invención incluyen, sin limitación, la cepa SDCV/USA/Illinois121/2014; la cepa USA/Colorado/2013 depositada como número de acceso de GenBank KF272920; la cepa china AH2012, depositada como número de acceso de GenBank KC210145; la cepa 13-019349, depositada como número de acceso de GenBank KF267450; la cepa CH-ZMDZY-11 depositada como número de acceso de GenBank KC196276; la cepa OH851 (Ohio); la cepa europea CV777 (véase R. Kocherhans et al., Virus Genes, vol 23(2), pp 137-144, 2001; y las cepas iA2013-KF452322 e IN2013-KF452323 (véase G. Stevenson et al. J. Vet. Diagn. Invest., vol 25, pp.649-654, 2013. Es preferente el uso de la cepa USA/Colorado/2013 depositada con el número de acceso de GenBank KF272920. Otras cepas preferentes, útiles en la práctica de todos los aspectos de la invención, todas ellas idénticas en un 99% o más a la cepa USA/Colorado/2013 depositada con el número de acceso de GenBank KF272920, incluyen: Número de acceso de GenBank KJ645688 (USA/lowa96/2013); KJ645640 (USA/Oklahoma32/2013); KJ778615 (NPL-PEDv/2013); KJ645647 (USA/Minnesota41/2013); KJ645637 ((USA/Kansas29/2013); KJ645639 (USA/Texas31/2013); KJ645666 (USA/Lowa70/2013); KJ645646 (USA/Carolina del Norte40/2013); KM189367 (PEDv ON-018); y KJ645669 (USA/Wisconsin74/2013).

De acuerdo con la práctica de la invención, los aislados de PEDV útiles en la fabricación de vacunas adyuvadas también pueden compararse con USA/Colorado/2013 (depositado como número de acceso de GenBank KF272920) sobre la base de la secuencia de aminoácidos de la proteína de la espiga. En la práctica de todos los aspectos de la invención son preferentes aquellos aislados virales que tienen secuencias de proteínas de espiga que son al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% idénticas a la proporcionada por KF272920, más preferentemente 95% o más. En consideración de que AID56763 representa el número de acceso de GenBank (US NIH/NCBI) para la secuencia de la proteína de espiga codificada dentro de KF272920, las siguientes cepas de PEDV (identificadas por sus accesiones de proteína de espiga) se encuentran entre las cepas o aislados de virus informados que son más preferentes para uso en todos los aspectos de la presente invención: AID56757.1; AHA38139.1; AGO58924.1; AHA38125.1; AIM47748.1; AID56895.1: AID5669.1: AII20255.1: AGG34694.1; AIE15986.1; AHG05730.1; AHG05733.1 (todos representativos de los que tienen más de 99% de identidad con la secuencia de la espiga de USA/Colorado/2013), y además, AIC82397.1; AFL02631.1; AHB33810.1; AFQ37598.1; AGG34691.1; AFJ97030.1; AFR11479.1; y AEW22948.1 (todos representativos de los que tienen más de 98% de identidad con la secuencia de espiga de USA/Colorado/2013). Como se ha señalado, el aislado de USA-PEDV mostrado por la secuencia completa de nucleótidos como SEQ ID NÚM.:7 es altamente preferente como vacuna para todos los aspectos de la práctica de la presente invención.

Típicamente, en el caso de las vacunas adyuvadas, el componente vírico se mata, sin embargo los expertos en la técnica reconocerán que ciertos adyuvantes son compatibles con una vacuna de virus vivos.

También es generalmente reconocido que las cepas en evolución del PEDV, como las INDEL, suelen estar atenuadas naturalmente en comparación con las cepas prototipo más antiguas, y por lo tanto pueden utilizarse como vacunas en las que el virus está vivo atenuado, o inactivado. Calaf 14 es un ejemplo de este tipo de cepas, en las que sólo puede ser necesario un mínimo pasaje adicional para proporcionar una vacuna segura atenuada. Los virus de vacuna ejemplares de la invención también incluyen aquellos que tienen un 95, 96, 97, 98, 99 y más preferentemente un 99,5% o más de identificación de secuencia con Calaf14, ya sea la secuencia de aminoácidos medida o la secuencia de nucleótidos codificantes, para la proteína de espiga o en base a la secuencia viral completa.

Además de las diversas cepas de PEDV que pueden utilizarse en una vacuna adyuvada, la proteína de espiga recombinante, incluidos los fragmentos S1 y/o S2 de la misma, también puede utilizarse en una vacuna. La proteína de espiga o los fragmentos S1 o S2 también pueden emplearse como antígenos de diagnóstico. Las secuencias ejemplares de la proteína de espiga del PEDV incluyen, pero sin limitación, las proporcionadas como SEQ ID NÚM.: 4, 56 y de acuerdo con la codificación de SEQ ID NÚM.:7.

Las composiciones de vacunas PEDV adyuvadas de la invención también incorporan eficazmente todas las cepas o aislados reconocidos de PDCoV, incluidas las cepas aisladas de América del Norte, incluyendo preferentemente, pero sin limitación necesariamente a ellas, todas las cepas que tienen al menos un 80% de identidad nucleotídica global con el aislado KNU14-04, depositado como número de acceso de GenBank KM820765; el aislado USA/IA/2014/8734, depositado como número de acceso de GenBank KJ567050; la cepa aislada HKU15 MI6148, depositada como número de acceso de GenBank KJ620016; la cepa aislada HKU15 MN3092, depositada como número de acceso de GenBank KJ584360; cepa aislada HKU15 NE3579, depositada como número de acceso de GenBank KJ584359; cepa aislada HKU15 PA3148, depositada como número de acceso de GenBank KJ584358; cepa aislada HKU15 KY4813, depositada como número de acceso de GenBank KJ584357; cepa aislada HKU15 SD3424, depositada como número de acceso de GenBank KJ584356; cepa aislada HKU15 IL2768, depositada como número de acceso de GenBank KJ584355; cepa aislada OhioCVM1/2014, depositada como número de acceso de GenBank KJ769231; aislado PDCoV/USA/Illinois121/2014, depositado como número de acceso de GenBank KJ481931; aislado PDCoV/USA/Ohio137/2014, depositado como número de acceso de GenBank KJ601780; aislado PDCoV/USA/Illinois136/2014, depositado como número de acceso de GenBank KJ601779; aislado PDCoV/USA/Illinois134/2014, depositado como número de acceso de GenBank KJ601778; aislado PDCoV/USA/Illinois133/2014, depositado como número de acceso de GenBank KJ601777; aislado HKU15 cepa IN2847, depositado como número de acceso de GenBank KJ569769; la cepa HKU15 OH1987, depositada con el número de acceso de GenBank KJ462462; y la cepa HKU15 HKU15-155, depositada con el número de acceso de GenBank JQ065043.

Además de las diversas cepas de PDCoV que pueden utilizarse en una vacuna, la proteína de espiga recombinante, incluidos los fragmentos S1 y/o S2, también puede utilizarse en una vacuna. La proteína de espiga o los fragmentos S1 o S2 también pueden emplearse como antígenos de diagnóstico. Las secuencias ejemplares de la proteína de la espiga incluyen, pero sin limitación, las de los aislados de PDCoV USA/IA/2014/8734, USA/Michigan/8977/2014 y USA/Indiana/2014/8501010.

Cultivo de virus

El aislamiento y la propagación del PEDV han sido generalmente difíciles. Los primeros estudios en los que se utilizaron células Vero para su propagación en cultivo sólo han sido parcialmente eficaces, y han requerido un medio que contenga tripsina, a menudo con un efecto citopático excesivo que incluye la fusión celular, la formación de sincitios y el desprendimiento de células (véase, por ejemplo K. Kusangi et al., J. Vet Med Sci, vol. 54(2), pp.313-318, 1992y M. Hofmann et al. J. Clinical Microbiology, vol. 26(11), pp2235-2239, 1988). Por consiguiente, se desarrollaron procedimientos de pasaje mejorados para la práctica de la presente invención. Los detalles de este procedimiento se presentan en los Ejemplos 1 y 2 a continuación. Cabe destacar que tanto USA/Colorado/2013 como Calaf14 pueden cultivarse en células Vero.

El cultivo de PDCoV también ha demostrado no ser un proceso sencillo. El medio que contiene tripsina también es necesario para propagar el PDCoV; sin embargo, no todas las líneas celulares probadas soportaron el crecimiento del virus. Sin embargo, las células testiculares porcinas (ST) han demostrado que soportan la replicación del SDCoV y son la línea celular preferente para la propagación del virus. Las células ST pueden obtenerse, por ejemplo, de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE. UU., con el número de depósito CRL-1746.

Inactivación de virus

Las cepas virales inactivadas o muertas son aquellas que han sido inactivadas por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo el tratamiento con formalina, betapropriolactona (BPL), etilenimina binaria (BEI), radiación esterilizante, calor u otros procedimientos similares.

Componente adyuvante

Las composiciones de vacuna de la invención se proporcionan como emulsiones, con componentes adyuvantes proporcionados a partir de una combinación de lecitina en aceite mineral liviano, y también un componente de hidróxido de aluminio. Los detalles relativos a la composición y formulación de Amphigen® (como componente representativo de lecitina/aceite mineral) se proporcionan en el Ejemplo 5 a continuación, así como los detalles relativos a los componentes representativos de hidróxido de aluminio.

De acuerdo con la práctica de la invención, el aceite utilizado en las formulaciones adyuvantes de la presente invención es un aceite mineral liviano. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "aceite mineral" se refiere a una mezcla de hidrocarburos líquidos obtenida a partir de la vaselina mediante una técnica de destilación. El término es sinónimo de "parafina licuada", "vaselina líquida" y "aceite mineral blanco" El término también incluye el "aceite mineral liviano", es decir, el aceite que se obtiene de forma similar por destilación de la vaselina, pero que tiene una gravedad específica ligeramente inferior a la del aceite mineral blanco. Véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18° Ed. (Easton, Pa: Mack Publishing Company, 1990, at pages 788 and 1323). El aceite mineral puede obtenerse de varias fuentes comerciales, por ejemplo, J. T. Baker (Phillipsburg, Pa.), USB Corporation (Cleveland, Ohio). El aceite mineral liviano preferente está disponible comercialmente bajo el nombre de DRAKEOL®.

Típicamente, la fase oleosa está presente en una cantidad de 50% a 95% en volumen; preferentemente, en una cantidad mayor que 50% a 85%; más preferentemente, en una cantidad mayor que 50% a 60%, y más preferentemente en la cantidad mayor que 50-52% v/v de la composición de la vacuna. La fase oleosa incluye aceite y emulsionantes (por ejemplo, SPAN® 80, TWEEN® 80, etc.), si están presentes.

Los emulsionantes sintéticos no naturales adecuados para uso en las formulaciones adyuvantes de la presente invención también incluyen tensioactivos no iónicos a base de sorbitán, por ejemplo tensioactivos de sorbitán sustituidos por ácidos grasos (disponibles comercialmente con el nombre de SPAN® o ARLACEL®), ésteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes como el aceite de ricino (EMULFOR®); ácido graso polietoxilado (por ejemplo, ácido esteárico disponible bajo el nombre de SIMULSOL® M-53), polímero de isooctilfenol/formaldehído polioxilado (TYLOXAPOL®), éteres de alcoholes grasos polioxilados (BRIJ®); éteres de nonfenilo polioxilados (TRITON® N), éteres de isooctilfenilo polioxilados (TRITON® X). Los tensioactivos sintéticos preferentes son los disponibles bajo el nombre de SPAN® y TWEEN®, tal como TWEEN®-80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitán) y SPAN®-80 (monooleato de sorbitán). En general, los emulsionantes pueden estar presentes en la composición de la vacuna en una cantidad del 0,01% al 40% en volumen, preferentemente, del 0,1% al 15%, más preferentemente del 2% al 10%.

Excipientes

Las composiciones de vacuna de la invención pueden comprender además portadores, excipientes y/o estabilizadores aceptables para uso farmacéutico (véase, por ejemplo Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones, y pueden comprender tampones tal como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tal como la sal sódica de mercurio((o-carboxifenilo)tio)etilo (THIOMERSAL), el cloruro de octadecildimetilbencil amonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el fenol, el alcohol butílico o bencílico; los parabenos alquílicos tal como el metil o el propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); proteínas, tal como la albúmina de suero, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono como la glucosa, la manosa o los dextranos; agentes quelantes tal como el EDTA; azúcares tal como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; contra-iones formadores de sal tal como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína).por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tal como el polietilenglicol (PEG), TWEEN o PLURONICS.

Dosificación

Una indicación clínica preferente es el tratamiento de cerdas reproductoras y cerdas jóvenes antes del parto. En un ejemplo preferente (aplicable tanto a las cerdas como a las cerdas jóvenes), se utilizarán dos dosis de 2 ml de vacuna muerta, la primera dosis se administrará tan pronto como antes de la cría hasta 5 semanas antes del parto, y la segunda dosis se administrará entre 1 y 3 semanas antes del parto. Las dosis de vacuna muerta proporcionan preferentemente una cantidad de material viral que correspondería a una TCID⁵⁰ (dosis infectiva de cultivo de tejidos) de entre aproximadamente 106 y 108, más preferentemente entre aproximadamente 107 y 1075, si el virus estuviera vivo, y puede variarse, como se reconoce en la técnica. Las dosis de refuerzo pueden administrarse dos semanas antes de los siguientes partos. Es preferente la vacunación intramuscular (todas las dosis), aunque una o más de las dosis pueden administrarse por vía subcutánea o, menos preferentemente, por vía oral.

En otro ejemplo preferente, la cerda o cerda joven se vacunan por vía intramuscular a las 5 semanas antes del parto y luego a las 2 semanas antes del parto. En estas condiciones (de aproximadamente TCID⁵⁰107 a aproximadamente 1075, se demostró una respuesta inmunitaria protectora en las cerdas vacunadas negativas al PEDV, en el sentido de que desarrollaron anticuerpos (medidos mediante el título de neutralización focal fluorescente de las muestras de suero) con actividad neutralizadora, y estos anticuerpos se transfirieron pasivamente a sus lechones. Los protocolos de la invención también son aplicables al tratamiento de cerdas y cerdas jóvenes ya seropositivas, y también de lechones y verracos. Aunque es preferente revacunar a una cerda madre antes de cualquier parto posterior, las composiciones de vacuna de la invención pueden seguir proporcionando protección a los lechones a través de la transferencia pasiva continua de anticuerpos, incluso si la cerda madre sólo fue vacunada en asociación con un parto anterior.

Cabe señalar que los lechones pueden ser vacunados a partir del primer día de vida. Por ejemplo, los lechones pueden ser vacunados al día 1, con una dosis de refuerzo a las 3 semanas de edad y un refuerzo cada 6 meses, si la cerda madre no fue vacunada antes de la cría; sin embargo, si la cerda fue vacunada antes de la cría, y por lo tanto los lechones reciben el anticuerpo materno a través del calostro, entonces simplemente reforzar los lechones a las 3 semanas y cada 6 meses. Los verracos (que normalmente se mantienen para la cría) deben ser vacunados una vez cada 6 meses.

La variación de las cantidades de dosis está bien dentro de la práctica de la técnica.

Procedimientos de uso

La invención abarca procedimientos de prevención de la infección por el virus PEDV que comprenden la administración de las composiciones de vacuna de la invención en un sujeto porcino de cualquier edad.

Cuando se suministra terapéuticamente, la vacuna se suministra en una cantidad eficaz tras la detección de un síntoma de infección real. Se dice que una composición es "aceptable para uso farmacológico" si su administración puede ser tolerada por un receptor. Se dice que dicha composición se administra en una "cantidad terapéutica o profiláctica eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa.

Al menos una composición de vacuna de la presente invención puede administrarse por cualquier medio que logre el propósito previsto, utilizando una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, la vía de administración de dicha composición puede ser parenteral, oral, oronasal, intranasal, intratraqueal, tópica, subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa. En una alternativa, la composición se administra por vía intramuscular. La administración parenteral puede ser por inyección en bolo o por perfusión gradual en el tiempo. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para administrar las composiciones, incluyendo jeringas, goteros, dispositivos de inyección sin aguja, parches y similares. La vía y el dispositivo seleccionados para uso dependerán de la composición del adyuvante, el antígeno y el sujeto, y son bien conocidos por el experto en la técnica.

De acuerdo con la presente invención, una "cantidad eficaz" de una composición de vacuna es aquella que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado, en este caso al menos uno de respuesta inmune celular o humoral a una o más cepas de PEDV. Se entiende que la dosis efectiva dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del sujeto, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis efectivas proporcionados a continuación no pretenden limitar la invención y representan ejemplos de intervalos de dosis que pueden ser adecuados para administrar las composiciones de la presente invención. Sin embargo, la dosis puede adaptarse al sujeto individual, tal y como lo entiende y determina un experto en la técnica, sin necesidad de experimentación excesiva.

Ejemplos

Ejemplo 1: Protocolo de extracción del virus PEDV de muestras de tejido

Se utilizó aproximadamente 1 cm de tejido para la extracción del virus PEDV. El tejido se cortó en trozos finos utilizando un bisturí estéril y unas tijeras estériles en una placa de Petri estéril. El trabajo se realizó en una cabina de bioseguridad para garantizar las condiciones asépticas. Se añadieron 2 ml de PBS estéril a la placa de Petri para recoger el tejido y se transfirió el material a un tubo cónico de 15 ml. El tejido se homogeneizó utilizando un TissueRuptor de Qiagen al 80% del máximo por pulsación durante un total de 30 segundos. La homogeneización se realizó en una cubeta de hielo para disminuir el efecto del calor sobre el virus PEDV. El material homogeneizado se filtró a través de un filtro de 0,45 uM y se utilizaron 60 ul de material para el aislado del ARN y la Q-PCR del PEDV para confirmar la presencia del virus PEDV. El material filtrado que contenía el virus PEDV se diluyó nuevamente 1:10 en PBS estéril y luego se filtró a través de un filtro de 0,20 uM.

El homogeneizado de PEDV filtrado de manera estéril se utilizó para infectar monocapas confluentes de células Vero 76 transfiriendo 1 ml de material filtrado a un matraz T-25 que contenía 2,8E+06 células sembradas de 3 a 4 días antes. Los matraces T-25 de células Vero 76 confluentes se lavaron 2 veces con PBS estéril y 1 vez con medio DMEM que contenía 10% de TPB, 20ug/ml de geneticina y 4ug/ml de tripsina TPCK (equivalente a 18,8 unidades USP/ml). Las células se infectaron durante 1 hora a 37°C y CO25% en una incubadora con suaves agitaciones cada 15 minutos para asegurar que el virus se distribuyera uniformemente en todas las células. Se añadieron 5 ml de medio DMEM con 10% de t Pb , 20ug/ml de geneticina y 4ug/ml de tripsina TPCK (equivalente a 18,8 unidades USP/ml) a los matraces y se dejaron incubar 2 días. Después de 2 días, los matraces se congelaron a -80°C y se descongelaron a 37°C. Este material se considera el Pasaje 1 del virus. A continuación, se utilizó un mililitro del volumen total del matraz para el Pasaje 2 del virus. El 1 ml de material del Pasaje 1 se utiliza para infectar un matraz T-25 que contiene 2,8E+06 células sembradas 3 o 4 días antes. Las células se lavaron primero 2 veces con PBS estéril y 1 vez con medio DMEM que contenía 10% de TPB, 20ug/ml de geneticina y 4ug/ml de tripsina TPCK (equivalente a 18,8 unidades USP/ml). Las células se infectaron durante 1 hora a 37°C y CO25% en una incubadora con suaves agitaciones cada 15 minutos para asegurar que el virus se distribuyera uniformemente en las células. Se añadieron 5 ml de medio DMEM con 10% de TPB, 20ug/ml de geneticina y 4ug/ml de tripsina TPCK (equivalente a 18,8 unidades USP/ml) a los matraces y se dejaron incubar durante 2 días. Este material es el Pasaje 2 del virus PEDV. Los pases se repiten cada 2 días hasta que las células muestren signos de infección indicados por racimos de células rodeados por una capa de material filamentoso y/o un efecto de burbuja en las células agrupadas (véanse las Figuras 1-3). La aparición de células infectadas por el PEDV se confirmó por una disminución del valor Ct en el ensayo Taqman del PEDV. Las células infectadas por el PEDV tienen un aspecto redondeado con una capa de película brillante que rodea las células redondeadas.

Ejemplo 2: Producción de semillas maestra con cepa USA/Colorado/2013

El aislado del virus de la diarrea epidémica porcina PEDv-1 CO-2013 se originó a partir de una muestra de diagnóstico porcina procedente de Colorado en 2013 y fue adquirida por los National Veterinary Services Laboratories in Ames, IA (número de acceso de GenBank: KF272920). El virus se propagó en células Vero 76 hasta el pasaje 5. A continuación, el virus se sometió a tres rondas de clonación por dilución limitada para obtener una población clonal. A continuación, se prepararon las existencias de semillas maestra. Las pruebas de agentes extraños, esterilidad y Mycoplasma del PEDV se realizaron de acuerdo con 9 CFR Parte 113.55, Parte 113.27 y Parte 113.28, respectivamente. La línea celular Vero fue designada Vero MCS Las células pueden utilizarse desde el MCS hasta el MCS+20.

Para la formulación del medio (para el medio de crecimiento celular no inoculado), utilizando un proceso de producción en botella de rodillo o biorreactor, el medio de crecimiento celular es OPTIMEM, DMEM o un medio de cultivo celular equivalente complementado con hasta 1% de glutamina y 0,5 a 3% de glucosa, y 0,5 a 5% de suero fetal bovino irradiado por gamma. Se añade gentamicina a una concentración final de 20-30 pg/ml (o como se determine en los experimentos de desarrollo de la vacuna). Para el medio de producción de virus, de nuevo para el proceso de producción en botella de rodillo o biorreactor, el medio de crecimiento celular es OPTIMEM, OPTIPRO o equivalente suplementado con hasta un 1% de glutamina, > 2 Unidades/litro de tripsina bovina o porcina 2X, y de 0,5 a 3% de glucosa. Se añade gentamicina a una concentración final de 20-30 pg/ml (o como se determine en los experimentos de desarrollo de la vacuna). Los matraces de rodillo y los biorreactores pueden enjuagarse con medio de crecimiento celular (OPTIMEM, OPTOPRO o equivalente) hasta 3 veces antes de la infección.

Ejemplo 3: Propagación y cosecha

Los matraces de plástico o las botellas de rodillo se utilizan para el crecimiento y la expansión de los cultivos celulares. Para la propagación del virus se utilizarán botellas de rodillo o biorreactores. Las células pueden ser lavadas, para eliminar el suero, antes de la inoculación con el virus. El virus puede diluirse en medio de producción de virus y añadirse directamente a la monocapa celular. Cuando se utilizan biorreactores para la propagación del virus, las células tripsinizadas se retirarán de los matraces de rodillo y se cultivará un último pasaje celular en un medio de crecimiento celular sin inocular. Se preparan los microportadores para los biorreactores. El virus semilla se diluye hasta un volumen adecuado dentro de un intervalo de multiplicidad de infección (MOI) de 0,0001 a 10,0

El virus PED causa un efecto citopático observable (CPE). El virus se recoge cuando el ECP inducido por el virus ha alcanzado el 50-100% y las células infectadas han empezado a desprenderse en el medio (pérdida de la monocapa celular superior al 50%). Los recipientes de los matraces de rodillo se retiran de la incubadora y se inspeccionan al microscopio para detectar tanto el ECP como la evidencia de contaminación microbiana. Tras el examen, el líquido antigénico se recoge en recipientes estériles adecuados de forma aséptica. Los fluidos de los biorreactores se examinan al microscopio en busca de evidencias de contaminación microbiana y de la presencia de los efectos citopáticos deseados (CPE). Un resultado representativo de stock de semillas se informa como SEQ ID NÚM.:7, como ADN).

Tras el examen, los fluidos víricos se hacen pasar por un filtro de < 100 micrómetros o un tamiz de malla de acero inoxidable para eliminar los microtransportadores y se recogen en recipientes estériles adecuados de forma aséptica. Los fluidos pueden almacenarse a 2°C - 7°C durante un máximo de 24 horas hasta su inactivación. Los fluidos recolectados pueden utilizarse para la siembra si tienen el nivel de pasaje adecuado y un título de infectividad aceptable.

Ejemplo 4: Inactivación y neutralización

Los fluidos de producción de antígenos cosechados aceptables se agruparán en recipientes de inactivación adecuados y se inactivarán utilizando una solución de etilenimina binaria (BEI) de 5mM. La mezcla se somete a ciclación durante 60-80 minutos a 36 ± 2°C. Tras la adición de inactivante, el antígeno se mezclará exhaustivamente y se transferirá a un recipiente de inactivación durante la duración del proceso (>48 horas, con agitación). La neutralización de los fluidos de antígeno inactivado se facilitará mediante la adición de tiosulfato de sodio 1M estéril hasta una concentración final de aproximadamente 20 mM - 25 mM. Los fluidos de producción de antígenos postinactivados/neutralizados se someterán a pruebas de esterilidad y de integridad de la inactivación y se almacenarán a 2-7°C para uso futuro en la formulación de series de vacunas. La genatamicina puede utilizarse entonces como conservante. Este antibiótico se añadirá en la etapa de lote. La concentración de gentamicina en el producto final será < 30 pg/ml.6.

Ejemplo 5: Composiciones y formulación de adyuvantes

Una composición de vacuna adyuvada preferente fue ensamblada de la siguiente manera. La vacuna muerta proporciona 7,8 log10TCID50 de virus de USA/Colorado/2013 muerto por dosis de 2 ml en una solución tamponada que comprende además aproximadamente 5% (v/v) de Rehydragel® (gel de hidróxido de aluminio) y "20% Amphigen" ® a aproximadamente 25% final (v/v). También son preferentes dosis de hasta 7,0 log10TCID50 de USA/Colorado/2013 muertos.

Amphigen® se describe generalmente en la Patente de los Estados Unidos 5.084.269 y proporciona lecitina desaceitada (preferentemente de soja) disuelta en un aceite liviano, que luego se dispersa en una solución acuosa o suspensión del antígeno como una emulsión de aceite en agua. El anfígeno ha sido mejorado de acuerdo con los protocolos de la Patente de los Estados Unidos 6.814.971 (véanse las columnas 8-9 de la misma) para proporcionar un componente denominado "20% de Amphigen" para uso en las composiciones finales de vacunas adyuvadas. Por lo tanto, una mezcla madre de 10% de lecitina y 90% de aceite portador (DRAKEOL®, Penreco, Karns City, PA) se diluye 1: 4 con una solución salina tamponada con fosfato al 0,63%, reduciendo así los componentes de lecitina y DRAKEOL al 2% y al 18% respectivamente (es decir, al 20% de sus concentraciones originales). Los tensioactivos Tween 80 y Span 80 se añaden a la composición, siendo las cantidades finales representativas y preferentes el 5,6% (v/v) de Tween 80 y el 2,4% (v/v) de Span 80, en el que Span se proporciona originalmente en el componente DRAKEOL en stock, y Tween se proporciona originalmente a partir del componente salino tamponado, de modo que la mezcla de los componentes salino y DRAKEOL da lugar a las concentraciones de tensioactivos finalmente deseadas. La mezcla de las soluciones de DRAKEOL/lecitina y de solución salina se llevó a cabo utilizando un aparato emulsionador In-Line Slim, modelo 405, Charles Ross and Son, Hauppauge, NY, USA.

La composición de la vacuna también incluye Rehydragel® LV (aproximadamente 2% de contenido de hidróxido de aluminio en el material de stock), como componente adyuvante adicional (disponible en Reheis, NJ, USA, y ChemTrade Logistics, USA). Con una dilución adicional utilizando PBS al 0,63%, la composición final de la vacuna contiene las siguientes cantidades de composición: 7,8 log10TCID50 de virus USA/Colorado/2013 muertos por dosis de 2 ml; 5% (v/v) de Rehydragel® LV; 25% (v/v) de "20% Amphigen", es decir, se diluye 4 veces más); y 0,01% (p/v) de merthiolate.

Como se comprende en la técnica, el orden de adición de los componentes puede variarse para proporcionar la composición de vacuna final equivalente. Por ejemplo, se puede preparar una dilución adecuada de virus muertos en tampón. A continuación, se puede añadir una cantidad adecuada de solución madre de Rehydragel® LV (con un contenido de hidróxido de aluminio de aproximadamente el 2%), con la mezcla, para permitir la concentración deseada del 5% (v/v) de Rehydragel® LV en el producto final real. Una vez preparado, este material de stock intermedio se combina con una cantidad adecuada de stock de "Amphigen 20%" (como se ha descrito en general, y que ya contiene las cantidades necesarias de Tween 80 y Span 80) para conseguir nuevamente un producto final que tenga un 25% (v/v) de "Amphigen 20%". Por último, se puede añadir una cantidad adecuada de merthiolate al 10%.

Las composiciones de vacunas de la invención permiten la variación de todos los ingredientes, de manera que la dosis total de antígeno puede variar preferentemente por un factor de 100 (hacia arriba o hacia abajo) en comparación con la dosis de antígeno indicada anteriormente, y más preferentemente por un factor de 10 o menos (hacia arriba o hacia abajo),. Del mismo modo, las concentraciones de tensioactivos (ya sea Tween o Span) pueden variarse hasta un factor de 10, independientemente unas de otras, o pueden suprimirse por completo, sustituyéndose por concentraciones adecuadas de materiales similares, como es bien sabido en la técnica.

Las concentraciones de Rehydragel® en el producto final pueden ser variadas, primero por el uso de materiales equivalentes disponibles de muchos otros fabricantes (por ejemplo, Alhydrogel® ,Brenntag; Denmark), o por el uso de variaciones adicionales en la línea de productos Rehydragel® tal como CG, HPA o HS. Utilizando LV como ejemplo, las concentraciones finales útiles incluyen del 0% al 20%, siendo más preferente el 2-12%, y más preferente el 4-8%. De manera similar, aunque la concentración final de Amphigen (expresada como % del "20% de Amphigen") es preferentemente el 25%, esta cantidad puede variar del 5-50%, preferentemente el 20-30% y es más preferentemente aproximadamente 24-26%.

Ejemplo 6: Protección cruzada

El virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) se introdujo inicialmente en Estados Unidos en abril de 2013 y posteriormente se extendió por todo el país. La secuenciación de los aislados de PEDV reveló una homología nucleotídica similar (>99%) con una cepa china de 2012. En Europa, se han notificado varios brotes desde 2014, que son diferentes a los anteriores brotes europeos. Las nuevas cepas europeas se agrupan con las variantes INDEL (inserción-deleción) del árbol filogenético del PEDV (Figura 6), y justifican una importante atención epidemiológica.

Para evaluar la eficacia de una vacuna inactivada contra el virus de la diarrea epidémica porcina en cerdas preñadas, se realizaron los siguientes experimentos. Se utilizó la cepa USA/Colorado/2013 (depositada con el número de acceso de GenBank KF272920), y se cultivó y preparó como se ha indicado anteriormente. La "Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Killed Virus", fabricada por Zoetis, está destinada a la vacunación previa al parto de cerdas y cerdas jóvenes contra la enfermedad diarreica en sus cerdos neonatos causada por el PEDV. Esta vacuna se desarrolló utilizando una cepa americana altamente virulenta del PEDV. En un ejemplo preferente, la vacuna se administra por vía intramuscular a las cerdas preñadas en dos dosis, de 2 ml cada una, con un intervalo de tres semanas, a las cinco y dos semanas antes del parto.

El objetivo del estudio fue determinar la eficacia inmunogénica de esta vacuna muerta, infectando lechones de 4 días nacidos de cerdas preñadas vacunadas con un nuevo aislado español del PEDV (Calaf14), característico de los recientes brotes europeos, como desafío. Era necesario realizar un estudio de eficacia de la vacuna en cerdas preñadas para evaluar la protección de los anticuerpos maternos contra el virus de la diarrea epidémica porcina, dado que el PEDv induce la enfermedad gastrointestinal, y la protección contra la infección y la enfermedad contra el PEDV están mediadas por anticuerpos de origen materno.

Se incluyeron en el estudio ocho cerdas preñadas. A las 5 semanas antes del parto, se administró una dosis (vía IM) de una partida experimental de la vacuna inactivada contra el PEDV a 5 cerdas; 3 cerdas permanecieron sin vacunar. Tres semanas después, las cerdas vacunadas recibieron una segunda dosis. Después del parto, aproximadamente a los 4±1 días de edad, todos los lechones fueron desafiados con la cepa española de PEDV Calaf14 (los nucleótidos codificantes, como ADN, y la secuencia de aminoácidos para la proteína de la espiga, se reportan como SEQ ID NÚM.: 1 y 4 respectivamente), aislados de casos recientes de diarrea en cerdos neonatos, y agrupados con las variantes INDEL del PEDV. Entre tres y cuatro días después de la prueba, todos los lechones fueron sacrificados y se les practicó necropsia. Dos veces al día después del desafío, todos los lechones fueron evaluados para la presencia de signos clínicos, temperatura rectal, peso corporal, y se tomaron hisopos fecales para realizar una RT-qPCR específica para el PEDV. Entre el día 3 y el 4 después de la prueba, todos los lechones fueron sacrificados y se tomaron muestras de tejido intestinal.

Las cerdas vacunadas dieron a luz un total de 32 lechones, mientras que las cerdas de control dieron a luz 21 lechones. En las cerdas de control, se observó una diarrea de moderada a grave en todas las camadas, que afectó a 19 de los 21 lechones (90,5%). La pérdida de peso durante el estudio afectó a 12/21 lechones (57,1%), y 4 de ellos alcanzaron la valoración de deshidratación y signos clínicos gastrointestinales graves y tuvieron que ser sacrificados. En cambio, en las cerdas vacunadas, 3 de 5 camadas no se vieron afectadas por la diarrea, o sólo un cerdo de la camada se vio levemente afectado en una sola observación; en dos camadas, varios lechones desarrollaron una diarrea de leve a moderada. En total, 15 lechones nacidos de madres vacunadas desarrollaron diarrea (46,9%). Sólo se observó una pérdida de peso en 3/32 lechones (6,5%), y ninguno de ellos debió ser sacrificado.

Los datos clínicos obtenidos confirman que la Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Killed Virus, fabricada por Zoetis, que contiene un aislado de PEDV de los Estados Unidos muerto como antígeno, es capaz de conferir protección cruzada a los lechones nacidos de cerdas vacunadas, frente al desafío con un aislado heterólogo de PEDV de la UE.

El virus del desafío europeo (aislado español Calaf14) se comparó con dos aislados europeos conocidos y más antiguos sobre la base de la secuencia de codificación de la proteína de la espiga completa. El aislado español "Calaf 14" se obtuvo de un caso de PEDV detectado en una granja española en 2014. Se procesaron los intestinos de un lechón de 4 días para obtener un homogeneizado intestinal clarificado. Se extrajo el ARN y la muestra resultó positiva mediante un análisis de RT-PCR en tiempo real (ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en el gen PEDV N).

El gen completo de la espiga (S) (4152nt) fue secuenciado como se describió previamente (Chen, Q., et al. "Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States" J Clin Microbiol 52(1): 234-2432014). La secuencia completa de codificación del gen S del PEDV Calaf14 (SEQ ID NÚM.:1) que circula actualmente se comparó con las de los dos aislados europeos de referencia del PEDV (CV777, véase SEQ ID NÚM.: 3 y Br1/87, véase SEQ ID NÚM.:2) disponibles en GenBank (números de acceso AF353511 y Z25483 respectivamente). No hay secuencias publicadas ni disponibles en GenBank de los brotes más recientes ocurridos en otros países europeos. Para el alineamiento, se utilizaron tanto el Vector NTI Advance 11.5 como el alineamiento de secuencias múltiples CLUSTAL 2.1. Los análisis mostraron que los dos aislados europeos eran prácticamente idénticos entre sí (99,9% de identidad nucleotídica, véase el Apéndice 1). Sin embargo, cuando se compara con el aislado Calaf14, las puntuaciones de identidad disminuyeron a un 95,71% de identidad para Br1/87 y a un 95,81% de identidad con el aislado CV777 (véase Figura 7).

Se generaron secuencias de proteínas completas S predichas (1383 aminoácidos) para los tres aislados (SEQ ID NÚM. 4, 5 y 6) utilizando el software Vector NTI Advance 11.5. Las secuencias de proteínas se alinearon utilizando tanto Vector NTI Advance 11.5 como CLUSTAL 2.1 para la alineación múltiple de secuencias. No se detectaron inserciones ni deleciones cuando se comparó la proteína Calaf14 S (SEQ ID NÚM.:4) con las proteínas de los aislados europeos CV777 (SEQ ID NÚM.:6) y Br1/87 (SEQ ID NÚM.:5). Sin embargo, el análisis mostró que la identidad entre los dos aislados europeos de referencia era del 99,71%, mientras que la proteína S de Calaf14 mostró un 95,81% de identidad con Br1/87 y un 96,1% con la proteína S de CV777 (véase la figura 8).

Cabe señalar que Calaf14 es también una cepa excelente para proporcionar una vacuna (ya sea viva atenuada o muerta, en ambos casos con o sin adyuvante) que proteja contra la desafío y la enfermedad del PEDV, independientemente de que la enfermedad/la desafío sea el PEDV: (1) de origen asiático, incluidos los tipos INDEL; (2) de origen europeo, cuando la cepa europea es una cepa prototipo, como la que se detectó por primera vez en la década de 1970, o es cualquier cepa emergente reciente, por ejemplo, similar a las INDEL norteamericanas; o (3) de origen norteamericano, cuando la cepa norteamericana es una cepa prototipo, como la que se detectó por primera vez en 2013, o es un reflejo de las cepas norteamericanas emergentes, como las INDEL; o (4) cuando la amenaza de la enfermedad está representada por cualquier combinación de cepas asiáticas, norteamericanas y europeas, como se describe en la presente memoria.

La cepa Calaf14 puede proporcionarse para uso como vacuna muerta, siguiendo, por ejemplo, los procedimientos de preparación descritos en la presente memoria u otros procedimientos conocidos en la técnica, para incluir opcionalmente un adyuvante como las composiciones adyuvantes descritas en la presente especificación. La cepa Calaf14 también puede proporcionarse como una vacuna viva atenuada (es decir, modificada), con o sin un adyuvante, aunque los expertos en la materia reconocerán que sólo ciertos adyuvantes son compatibles con el mantenimiento de la viabilidad del virus de la vacuna viva. La atenuación del virus Calaf14 para una vacuna viva, de modo que no sea lo suficientemente patógeno como para dañar sustancialmente al animal objetivo vacunado, puede lograrse mediante procedimientos conocidos, típicamente mediante pases en serie, como se menciona en cualquiera de las siguientes referencias que proporcionan la atenuación de los coronavirus: B. Neuman et al., Journal of Virology, vol. 79, No. 15, pp. 9665-9676, 2005 J. Netland et al., Virology, v 399(1), pp. 120-128, 2010 Y-P Huang et al., "Sequence changes of infectious bronchitis virus isolates in the 3' 7.3 kb of the genome after attenuating passage in embryonated eggs, Avian Pathology, v. 36 (1), (Abstract), 2007y S. Hingley et al., Virology, v. 200(1) 1994, pp. 1-10. También se ha desvelado generalmente que las cepas de tipo INDEL suelen ser menos virulentas hacia los cerdos (incluidas las cerdas y los lechones) en comparación con las cepas prototipo del PEDV, lo que permite utilizar Calaf14 como vacuna viva con escasa o nula atenuación.

En general, también está dentro de la práctica de la presente invención proporcionar vacunas que contengan más de un aislado de PEDV, ya sea que la vacuna sea una vacuna viva o muerta, y/o vacunar animales proximalmente en el tiempo con más de una composición de vacuna para así entregar más de un aislado de PEDV como antígeno. Las vacunas combinadas representativas (muertas o vivas) de la invención incluyen (a) el uso de Calaf14 con el aislado europeo CV777 y/o Br1/87, u otros aislados europeos ya sean prototipos o emergentes; (b) el uso de Calaf14 en combinación con la cepa norteamericana USA/Colorado/2013 GenBank Núm. KF272920, o cualquier otro prototipo norteamericano y/o cepa emergente norteamericana (INDL), (c) uso de Calaf 14 con cualquier cepa asiática, y (d) uso de Calaf14 con todas las combinaciones de las anteriores. Además, todas estas combinaciones múltiples pueden combinarse con un virus PDCoV vivo (atenuado) o muerto modificado.

Ejemplo 7: Protección cruzada contra las cepas europeas. Resultados adicionales de los ensayos

La Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Killed Virus, fabricada por Zoetis, está destinada a la vacunación previa al parto de cerdas y cerdas jóvenes contra la enfermedad diarreica en sus cerdos neonatos causada por el PEDV. Esta vacuna muerta se desarrolló utilizando una cepa americana altamente virulenta del PEDV (USA/Colorado/2013) para ser administrada por vía intramuscular a cerdas preñadas en dosis de dos ml con un intervalo de tres semanas a las 5 y 2 semanas antes del parto.

El objetivo del estudio fue determinar la inmunogenicidad de esta vacuna, infectando lechones de 4-6 días de edad nacidos de cerdas preñadas vacunadas con un nuevo aislado vivo español de PEDV, Calaf14, como un desafío. Era necesario realizar un estudio de eficacia de la vacuna en cerdas preñadas para evaluar la protección de los anticuerpos maternos contra el virus de la diarrea epidémica porcina, dado que PEDv induce la enfermedad gastrointestinal, y la protección contra la infección y la enfermedad contra PEDv está mediada por anticuerpos de origen materno. Véase la Tabla 1A/1B para el diseño.

Un total de 31 lechones nacidos de cerdas vacunadas con la vacuna inactivada contra el PEDV (T02) y 21 de cerdas vacunadas con el placebo (T01) fueron incluidos en el estudio. Todos los lechones fueron desafiados con el aislado español del PEDV a la edad de 4 o 6 días. No se detectó ninguna mortalidad asociada al desafío del PEDV en los lechones procedentes de cerdas vacunadas con la vacuna inactivada contra el PEDV (T02), mientras que se registró un 23,8% de mortalidad asociada al desafío en los lechones procedentes de cerdas vacunadas con placebo (T01).

Tras el desafío, se registraron trastornos digestivos de leves a graves, incluidos vómitos y diarrea amarilla acuosa, en el 90,5% de los lechones de las cerdas vacunadas con placebo; en los lechones de las cerdas vacunadas con el virus muerto del PEDV se observaron trastornos digestivos en el 48,4% de los lechones y variaron de leves a moderados. Tras el desafío, el 66,7% de los lechones de las cerdas vacunadas con placebo experimentaron una pérdida de condición física general de leve a grave y/o deshidratación, mientras que estos signos sólo se registraron en el 3,2% de los lechones de las cerdas vacunadas con el virus muerto del PEDV y sólo se observó una deshidratación leve en estos animales.

La pérdida de peso corporal se detectó alguna vez después del desafío en el 42,9% de los lechones de las cerdas vacunadas con placebo, variando de leve a grave, mientras que se detectó en el 6,5% de los animales de las cerdas vacunadas con el virus muerto del PEDV como un grado leve.

El resumen y la distribución de la frecuencia de los signos clínicos relacionados con el PEDV registrados tras la desafío con una cepa heteróloga del PEDV (aislado español, Calaf14) sugieren que se obtuvo una protección derivada de los anticuerpos maternos para los lechones nacidos de cerdas vacunadas con la vacuna inactivada contra el PEDV. En conclusión, los resultados sugieren que la vacuna inactivada contra el PEDV que contiene un aislado de PEDV de los Estados Unidos como antígeno, es capaz de conferir una protección cruzada parcial a los lechones nacidos de cerdas vacunadas, frente al desafío con un nuevo aislado heterólogo de PEDV español. Por lo tanto, los resultados sugieren la idoneidad de la PEDV Vaccine, Killed Virus, fabricada por Zoetis, que contiene un aislado de PEDV de los EE. UU. como antígeno, para reducir el impacto de un brote producido por nuevos aislados de PEDV de la UE.

Tabla 1A-Fase de vacunación

A las 5 semanas antes de la fecha prevista de parto, se administró una dosis del CP a las cerdas T01 por vía IM, y se revacunaron 3 semanas después. Además, 5 semanas antes de la fecha prevista de parto se administró una dosis de la PIV a las cerdas T02 por vía IM, y se volvieron a vacunar 3 semanas después.

Tabla-1 B Fase de desafío

Entre los 4 y 6 días de edad, todos los cerdos de cada camada fueron desafiados con PEDv Calaf14 y entre 3 y 4 días después del desafío (fin del estudio), fueron sacrificados y se les practicó necropsia.

Definición de Día 0: El día 0 se estableció como el día de la primera vacunación (5 semanas antes del parto). "IVP" significa el producto de vacuna experimental, es decir, el material muerto de Colorado 2013, tal como se formuló anteriormente. CP significa el material de control (adyuvantes más diluyente) sin virus/antígeno viral.

Aleatorización: Las cerdas se agruparon en dos partidas de acuerdo con la fecha prevista de parto. La partida 1 incluía tres cerdas y la partida 2 cinco. Las cerdas de cada partida se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales de acuerdo con los procedimientos internos locales (función "random" del programa Microsoft Excel: número aleatorio asignado a cada animal, reordenado en orden decreciente, y distribución secuencial al grupo de tratamiento).

Vacuna: Como ya se ha mencionado, la vacuna utilizada es Zoetis PEDV vaccine, killed virus, "PEDV CO 2013 (NVSL)" adyuvada con 5% de Rehydragel y 5% de Amphigen, y fue formulada sobre la base de un título de preinactivación de 7,2 TCID50/ml (es decir, 7,5 TCID50/dosis) para su uso en dosis intramusculares de 2 ml. El material de la vacuna de control contenía 5% de Rehydragel y 5% de Amphigen formulado con diluyente en lugar de antígeno PEDv. Las vacunaciones se realizaron por vía intramuscular en el día 0 (lado derecho del cuello) y en el día 21 (lado izquierdo del cuello).

Información adicional sobre el material de desafío: El material de desafío se recuperó a partir de un homogeneizado intestinal clarificado de un lechón neonato de una granja local española, y se diluyó justo antes de la inoculación para lograr una concentración adecuada, es decir, un título objetivo de 107 a 108 copias del genoma del PEDV/10 ml de dosis, lo que requiere una dilución de aproximadamente 1000 veces del homogeneizado intestinal, y la dosis de 10 ml se administró por sonda esofágica (virus denominado Calaf14).

Mortalidad relacionada con enfermedad PEDV

Cuando la mortalidad se debió a los signos clínicos asociados a la enfermedad del PEDV, se resumió como mortalidad relacionada con el desafío. Los resultados se detallan en la Tabla 2.

De un total de 21 lechones de T01, 5 fueron sacrificados debido a los signos clínicos relacionados con el PEDV, por lo que se registró un 23,8% de mortalidad asociada al desafío para el grupo de tratamiento T01. Ningún cerdo murió o fue sacrificado debido a signos consistentes con otra enfermedad.

No se detectó ninguna mortalidad asociada a la desafío del PEDV en el grupo de tratamiento T02.

El estado físico general y la deshidratación, los trastornos digestivos, la temperatura, la pérdida de peso, la depresión y la pérdida de apetito fueron los signos clínicos asociados a la enfermedad del PEDV que se consideraron relacionados con el desafío, y se recopilan en la Tabla 3. Los trastornos digestivos, incluidos los vómitos y la diarrea amarilla acuosa, se registraron en el 90,5% de los animales del grupo de tratamiento T01, mientras que se observaron en el 48,4% de los lechones del grupo T02. Un caso de T01 experimentó graves trastornos digestivos que alcanzaron los criterios de valoración que justificaron su sacrificio por razones de bienestar. Tras el desafío, el 66,7% de los lechones del grupo de tratamiento T01 experimentaron una pérdida de la condición física general y/o deshidratación, mientras que sólo se registró en el 3,2% de los lechones del T02. La deshidratación notificada para los lechones de T01 varió de leve a grave (de 1 a 3 puntuaciones notificadas) y sólo se notificó una deshidratación leve en un lechón de T02. Ninguno de los lechones del grupo de tratamiento T02 experimentó pérdida de apetito después de la prueba, mientras que el 14,3% (3 de 21) de los lechones de T01 sí lo hicieron. La pérdida de peso se definió como variable de eficacia secundaria. Se observó depresión tras el desafío en el 66,7% de los lechones del grupo de tratamiento T01. El estado depresivo variaba de leve a moderado. También se observó depresión en el 9,7% de los lechones de T02. Se registraron valores de temperatura anormales (Ta>40,5°C oTa<37,0°C) alguna vez después del desafío en el 9,5% de los lechones de T01. Ninguno de los lechones del grupo de tratamiento T02 presentó valores de temperatura anormales.

En resumen, los resultados de los datos clínicos de este estudio indican que la vacuna inactivada contra el PEDV que contiene un aislado de PEDV estadounidense como antígeno, es capaz de conferir al menos una protección cruzada parcial a los lechones nacidos de cerdas vacunadas, frente al desafío con un nuevo aislado heterólogo de PEDV español, Calf14. Por lo tanto, los resultados sugieren la idoneidad de la PEDV Vaccine, Killed Virus, fabricada por Zoetis, que contiene un aislado de PEDV de los Estados Unidos como antígeno, para reducir el impacto de un brote producido por un nuevo aislado de PEDV de la UE

Ejemplo de referencia 8: Aislamiento, propagación e inoculación de cerdos CDCD con PDCoV USA/Indiana/2014/8501010 y NVSL PDCoV USA/Michigan/8977/2014

Se utilizó aproximadamente 1 cm3 de tejido para la extracción del virus PDCoV. El tejido se cortó en trozos finos utilizando un bisturí y unas tijeras estériles en una placa de Petri estéril. El trabajo se realizó en una cabina de bioseguridad para garantizar las condiciones asépticas. Se añadieron dos ml de PBS estéril a la placa de Petri para recoger el tejido y se transfirió el material a un tubo cónico de 15 ml. El tejido se homogeneizó con un TissueRuptor de Qiagen al 80% del máximo pulsando durante un total de 30 segundos. La homogeneización se realizó en una cubeta de hielo para disminuir el efecto del calor sobre el virus PDCoV. El material homogeneizado se filtró a través de un filtro de 0,45 pM y se utilizaron 60 pl de material para el aislado del ARN y la qPCR del PDCoV para confirmar la presencia del virus del PDCoV. El material filtrado que contenía el virus PDCoV se diluyó nuevamente 1:2 en PBS estéril, y luego se filtró a través de un filtro de 0,20 pM.

El homogeneizado de PDCoV filtrado de manera estéril se utilizó para infectar monocapas confluentes de células de testículo porcino (ST) transfiriendo 1 ml de material filtrado a un matraz T-25 que contenía 2,8 x106 células, plantadas 4 días antes de la infección. Los matraces T-25 de células ST confluentes se lavaron 2 veces con PBS estéril y 1 vez con medio PMEM que contenía 20pg/ml de geneticina y 1 pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 4,9 unidades uSP/ml). Se infectaron un total de tres matraces T-25 con una monocapa confluente de células ST durante 1 hora a 37°C en una incubadora con CO25%, con una suave agitación cada 15 minutos para asegurar que el virus se distribuyera uniformemente a todas las células. Se añadieron cinco ml de medio PMEm con 20pg/ml de geneticina, 2mM de L-glutamina y 1pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 4,9 unidades USP/ml), 3pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 14,6 unidades USP/ml) o 5 pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 24,5 unidades USP/ml) a los matraces tratados con el virus. Los matraces se dejaron incubar durante 3 días y se tomaron muestras cada día. Después de 3 días, los matraces se congelaron a -80°C, luego se descongelaron a 37°C y el contenido del matraz se colocó en un tubo cónico de 15 ml y se centrifugó para eliminar los restos celulares. Se recogió el sobrenadante, y este material que contiene el virus se considera como el Pasaje 1 del virus, PDCoV USA/Indiana/2014/8501010. A continuación, se utilizó 1 ml del volumen total de los tres matraces para el paso 2 del virus a tres matraces T-25 separados de células ST confluentes. Se utilizó 1 ml de material de PDCoV de pasaje 1 para infectar un matraz T-25 que contenía 2,8x106 células sembradas de 3 a 4 días antes. Las células se lavaron primero 2 veces con PBS estéril y 1 vez con medio PMEM que contenía 20pg/ml de geneticina y 1pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 4,9 unidades USP/ml). Las células se infectaron durante 1 hora a 37°C en una incubadora con CO25%, agitando suavemente cada 15 minutos para asegurar que el virus se distribuyera uniformemente en las células. Se añadieron a los matraces tratados con el virus 5 ml de medio PMEM que contenía 20pg/ml de geneticina, 2mM de L-glutamina y 1pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 4,9 unidades USP/ml), 3pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 14,6 unidades USP/ml) o 5 pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 24,5 unidades USP/ml), correspondientes a la concentración inicial de tripsina en el momento de la infección. Este procedimiento se repitió hasta el Pasaje 15, conservando la muestra de medio de infección con tripsina de 3pg y 12 ml de PDCoV USA/Indiana/2014/8501010 en cada pasaje.

El material del Pasaje 1 que se muestreó diariamente se utilizó en un ensayo de RT-qPCR basado en el gen del PDCoV para monitorear el crecimiento del virus con los siguientes cebadores: Cebador directo: 5'-ATCGACCACGGCTCCAA-3' (SEQ ID NÚM.:8); Cebador inverso: 5'-CAGCTTGCCCATGTAGCTT-3' (SEQ ID NÚM.:9); y Sonda: 5' /56FAM/- CACACCAGTCGTTAAGCATGCAAGCT/3BHQ_1 / 3' (véase SEQ ID NÚM.:10). Brevemente, se utilizaron 140 pl de cada muestra de virus de punto de tiempo para el aislado de ARN. A continuación, cinco microlitros de ARN extraído se sometieron a la RT-qPCR para determinar el valor final del umbral de ciclo (Ct) y el número de copias de cada muestra. En el día 0, los tres matraces infectados tenían un valor Ct de entre 22 y 23, lo que corresponde a entre 2,34 x105 y 3,24 x105 copias por muestra. Cada día muestreado a partir de entonces da lugar a una disminución del valor Ct, que se correlaciona con un aumento del número de copias virales en cada muestra, lo que indica la replicación y el crecimiento del virus. En la Tabla 4 se resume el valor Ct y los datos correspondientes al número de copias del virus.

Tabla 4. Supervisión del crecimiento del PDCoV USA/Indiana/2014/8501010

Se utilizaron matraces de plástico o botellas de rodillo para el crecimiento y la expansión de los cultivos de células ST. Para la propagación del virus PDCoV se utilizaron matraces de plástico, botellas de rodillo y biorreactores. Las células se lavaron para eliminar el suero antes de la inoculación con el virus. El virus se diluyó en medio PMEM que contenía 20pg/ml de geneticina, 2mM de L-glutamina y 1pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 4,9 unidades USP/ml), y se añadió directamente a la monocapa celular. Cuando se utilizaron biorreactores para la propagación del virus, se transfirieron las células tripsinizadas de los matraces de rodillo y se utilizó un último pasaje celular cultivado en medio de crecimiento celular sin inocular para sembrar el biorreactor. Se prepararon microportadores para los biorreactores y se añadieron a las células ST en el biorreactor. El virus de semilla se diluyó a un volumen apropiado dentro de un intervalo de multiplicidad de infección (MOI) de 0,0001 a 10,0. El crecimiento del virus se supervisó mediante la visualización del CPE de las células infectadas por el virus y mediante RT-qPCR. La cepa del virus NVSL, PDCoV USA/Michigan/8977/2014 (véase SEQ ID NÚM.:12 para el a Dn codificador correspondiente), se pasó al Pasaje 22.

El virus PDCoV causa un efecto citopático observable (CPE). El virus se cosechó cuando el CPE inducido por el virus alcanzó el 50-100% y las células infectadas comenzaron a desprenderse en el medio (pérdida de la monocapa celular superior al 50%). Los recipientes de las botellas de rodillo se sacaron de la incubadora y se inspeccionaron al microscopio para detectar tanto el ECP como la evidencia de contaminación microbiana. Tras el examen, el líquido antigénico se recogió en recipientes estériles adecuados de forma aséptica. Los fluidos del biorreactor se examinaron al microscopio en busca de evidencias de contaminación microbiana y de la presencia de los efectos citopáticos deseados (CPE).

Tras el examen, los fluidos virales se pasaron por un filtro de <100 micrómetro o por un tamiz de malla de acero inoxidable para eliminar los microtransportadores, y se cosecharon en recipientes estériles adecuados de forma aséptica. Los fluidos se almacenaron a 2°C - 7°C durante un máximo de 24 horas hasta su inactivación.

En pruebas separadas, (1) el homogeneizado intestinal original (fuente de PDCoV USA/Indiana/2014/8501010); (2) el pasaje 4 de la cepa PDCoV USA/Indiana/2014/8501010 (ver SEQ ID NÚM.:11 para el ADN codificador correspondiente), y (3) el pasaje 10 de la cepa PDCoV USA/Michigan/8977/2014 (ver Se Q ID NÚM.:12 para el ADN codificador correspondiente), se inyectaron en cerdos CDCD (derivados de la cesárea, privados de calostro) de 3 días de edad para expandir el material vírico, y se evaluó la virulencia del PDCoV en los cerdos mediante el seguimiento de los signos clínicos (diarrea y vómitos), la histopatología y la RT-qPCR del material fecal. Los cerdos se colocaron en corrales asignados en una instalación BSL-2, y cada grupo de tratamiento se alojó en una sala separada para evitar la contaminación cruzada. Los signos clínicos máximos y la excreción fecal aparecieron entre 16 y 24 horas para la cepa PDCoV USA/Indiana/2014/8501010 (véase SEQ ID NÚM.:11), y a los 3 días después de la inoculación para la cepa PDCoV USA/Michigan/8977/2014 (véase SEQ ID NÚM.:12).

Además de ser una vacuna muerta útil, cabe señalar que el Pasaje 10 de PDCoV USA/Michigan/8977/2014 está lo suficientemente atenuado como para definir el umbral mínimo aproximado de un aislado pasado que puede recomendarse para una vacuna viva, aunque sea preferente un número mayor de pasajes.

Ejemplo de referencia 9: Preparación y prueba de una vacuna basada en el deltacoronavirus porcino aislado PDCoV USA/Michigan/8977/2014

El antígeno de PDCoV cosechado se concentró 20 veces antes de la inactivación con una solución de etilenimina binaria (BEI) 5mM. La mezcla se somete a ciclación durante 60-80 minutos a 36 ± 2°C. Tras la adición de inactivante, el antígeno se mezcló exhaustivamente y se transfirió a un recipiente de inactivación durante la duración del proceso (>48 horas, con agitación). La neutralización de los fluidos de antígeno inactivado se facilitó mediante la adición de tiosulfato de sodio 1M estéril, hasta una concentración final de aproximadamente 20 - 25 mM. Los fluidos de producción de antígenos postinactivados/neutralizados se sometieron a pruebas de esterilidad y de integridad de la inactivación, y se almacenaron a 2-7°C para su uso futuro en la formulación de series de vacunas.

Se formuló una vacuna con los siguientes componentes: 7,42 log10TCID50 del virus PDCoV USA/Michigan/8977/2014 (véase SEQ ID NÚM.:12) por dosis de 2 ml; 5% (v/v) de Rehydragel® LV; 25% (v/v) de "20% Amphigen" (es decir, se diluye 4 veces más); y 0,01% (p/v) de merthiolate.

El virus PDCoV USA/Michigan/8977/2014 muerto también fue adyuvado con TXO, y utilizado para la vacunación. TXO proporcionó los siguientes componentes por dosis de 1 ml de vacuna: 50ug "CpG 23877" (véase SEQ ID NÚM.: 8 como se indica en el documento WO2015/042369), 10mg de DEAE-Dextrano, DRAKEOL 6v R (45% p/v), Span-80 (6,3% v/v), Tween-80 (1,45% v/v) y 10mM PBS.

Como se comprende en la técnica, el orden de adición de los componentes puede variar para proporcionar la composición de vacuna final equivalente. Por ejemplo, se puede preparar una dilución adecuada de virus muertos en tampón. A continuación, se puede añadir una cantidad adecuada de solución madre de Rehydragel® LV (con un contenido de hidróxido de aluminio de aproximadamente el 2%), con la mezcla, para permitir la concentración deseada del 5% (v/v) de Rehydragel® LV en el producto final real. Una vez preparado, este material de stock intermedio se combina con una cantidad adecuada de stock de "Amphigen 20%" (como se ha descrito en general, y que ya contiene las cantidades necesarias de Tween 80 y Span 80) para conseguir nuevamente un producto final que tenga un 25% (v/v) de "Amphigen 20%". Por último, se puede añadir una cantidad adecuada de merthiolate al 10%.

Las composiciones de vacuna de la invención permiten la variación de todos los ingredientes, de manera que la dosis total de antígeno puede variar preferentemente por un factor de 100 (arriba o abajo) en comparación con la dosis de antígeno indicada anteriormente, y más preferentemente por un factor de 10 o menos (arriba o abajo). Del mismo modo, las concentraciones de tensioactivos (ya sea Tween o Span) pueden variarse hasta un factor de 10, independientemente unas de otras, o pueden suprimirse por completo, sustituyéndose por concentraciones adecuadas de materiales similares, como es bien sabido en la técnica.

El suero porcino generado a partir de los cerdos vacunados con PDCoV inactivado adyuvado con Amphigen®/ Rehydragel® LV o TXO se probó en un ensayo de neutralización del suero (SN) de la siguiente manera: El suero porcino de cada grupo de tratamiento se agrupó y se inactivó por calor a 56°C durante 30 minutos. Las muestras de suero se diluyeron 2 veces mezclando 500 pl del suero con 500 pl de medio PMEM suplementado con 20pg/ml de geneticina, 2mM de L-glutamina y 1pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 4,9 unidades USP/ml). Se añadieron al suero diluido virus vivos del PDCoV en diluciones que iban de log10TCID50=5,0 a logi0TCID50 =2,0 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de suero/virus se inoculó en placas de 96 pocillos sembradas con células ST confluentes, y se incubó durante 4 días a 37°C y CO25%. Las placas se fijaron entonces con acetona al 80% en una mezcla de agua durante 15 minutos. A continuación, se eliminó la mezcla y las placas se secaron al aire durante 15 minutos para eliminar la acetona restante. Las placas se tiñeron con el anticuerpo primario anti-PDCoV S1 de conejo y con el anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor® 488 de cabra (Jackson ImmunoResearch), antes de la lectura de las placas en un microscopio de fluorescencia. El título de neutralización del suero se calculó determinando la dilución más baja de suero en la que el crecimiento del PDCoV se inhibió al 100%, y aplicando el procedimiento de Spearman-Karber para calcular los valores del título.

Se determinó que el suero de cerdos vacunados con PDCoV inactivado adyuvado con Amphigen®/Rehydragel® LV, o TXO, neutralizó con éxito el crecimiento del virus PDCoV en las células ST en todas las concentraciones de inóculo del virus probadas. En general, el grupo vacunado con el adyuvante PDCoV/TXO inactivado dio títulos de SN más altos (véase Tabla 5) que el grupo adyuvado con Amphigen®/ Rehydragel® LV.

Tabla 5. Títulos de neutralización de suero (SN) de cerdos vacunados con PDCoV inactivado

Ejemplo de referencia 10: Clonación, expresión e inoculación de cerdos con la proteína S1; expresión de la proteína N

La secuencia completa del genoma del Deltacoronavirus porcino aislado USA/IA/2014/8734 ha sido publicada y depositada en GenBank con el número de acceso KJ567050. A partir de esa secuencia, se generó un gen S1 sintético con una etiqueta His 3', y se clonó en un vector de expresión propio para mamíferos. La proteína S1 se expresó en células de riñón embrionario humano (HEK) y se purificó mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). Una dosis de 40pg de proteína S1 purificada fue adyuvada con 5% (v/v) de Rehydragel® LV y 25% (v/v) de "20% Amphigen", o con adyuvante TXO, e inyectada en cerdos para generar una respuesta inmune humoral mediante la producción de anticuerpos contra la proteína S1.

El suero porcino generado a partir de los cerdos vacunados con la proteína PDCoV S1 adyuvada con Amphigen®/ Rehydragel® LV o con TXO se probó en un ensayo de neutralización del suero (SN) de la siguiente manera: El suero porcino de cada grupo de tratamiento se agrupó y se inactivó por calor a 56°C durante 30 minutos. Las muestras de suero se diluyeron 2 veces mezclando 500 pl del suero con 500 pl de medio PMEM, complementado con 20pg/ml de geneticina, 2mM de L-glutamina y 1pg/ml de tripsina TPCK (equivalente a 14,6 unidades USP/ml). Al suero diluido se le añadió el virus PDCoV en diluciones que iban de log10TCID50 =5,0 a log10TCID50=2,0, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de suero/virus se inoculó en placas de 96 pocillos sembradas con células ST confluentes, y se incubó durante 4 días a 37°C y CO25%. A continuación, las placas se fijaron con una mezcla de acetona al 80% en agua durante 15 minutos, tras lo cual se retiró la mezcla, y las placas se secaron al aire durante 15 minutos para eliminar la acetona restante. A continuación, las placas se tiñeron con el anticuerpo primario anti-PDCoV S1 de conejo y el anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor de cabra, antes de leer las placas en un microscopio fluorescente. El título de neutralización del suero se calculó determinando la dilución más baja de suero en la que se inhibió el crecimiento del PDCoV y aplicando el procedimiento de Spearman-Karber para calcular los valores del título.

Se determinó que el suero de cerdos vacunados con la proteína PDCoV S1 con adyuvantes Amphigen®/ Rehydragel® LV o TXO neutralizó con éxito el crecimiento del virus PDCoV en las células ST en todas las concentraciones de inóculo del virus probadas. En general, el grupo vacunado con la proteína S1 del PDCoV con adyuvantes TXO dio títulos de SN más altos (véase el tabla 6) que el grupo adyuvado con Amphigen®/ Rehydragel® LV.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna que comprende virus inactivado de la diarrea epidémica porcina (PEDV), adyuvado como una emulsión de aceite en agua, en la que los componentes adyuvantes incluyen lecitina en aceite mineral liviano e hidróxido de aluminio.

2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que el PEDV inactivado es la cepa USA/Colorado/2013, cuya secuencia genómica está depositada en el GenBank con el número de acceso KF272920.

3. Una composición de vacuna como se define en la reivindicación 1 para uso en la producción de una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra el PEDV en un sujeto porcino que comprende la administración al sujeto de la composición de vacuna de la reivindicación 1, en una cantidad y duración eficaces para producir la respuesta de anticuerpos neutralizantes, en la que el virus inactivado de la composición de vacuna es un aislado de PEDV norteamericano, europeo o asiático, que proporciona protección contra el desafío por un aislado de PEDV norteamericano, asiático o europeo.

4. La composición para uso de la reivindicación 3, en la que el aislado norteamericano, europeo o asiático utilizado en la composición de vacuna es al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a la cepa USA/Colorado/2013 del PEDV a nivel de nucleótidos de longitud completa; o tiene un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la proteína S de la cepa USA/Colorado/2013 del PEDV.

5. La composición para uso de la reivindicación 4, en la que dicha identidad es de al menos 98%.

6. La composición para uso de la reivindicación 4, en la que dicha identidad es de al menos 99%.