CN114790448B - 一株猪δ冠状病毒强毒株及其在疫苗制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域，具体涉及一株猪δ冠状病毒强毒株和该毒株在疫苗制备中的应用。本发明从临床发生腹泻仔猪的小肠内容物中分离到一株PDCoV，命名为猪δ冠状病毒DHeB1株，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202217，该PDCoV DHeB1具有更高的增殖滴度、更强的致病性和更好的免疫原性，可用于制备PDCoV灭活疫苗。

Description

一株猪δ冠状病毒强毒株及其在疫苗制备中的应用
技术领域
本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一株猪δ冠状病毒强毒株和该毒株在疫苗制备中的应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)属于冠状病毒科、δ冠状病毒属，由中国香港学者于2011年从猪粪便中检测到，但当时并未对其进行深入的研究，也未说明其临床意义。2014年，美国俄亥俄州的猪场首次暴发PDCoV感染，并迅速蔓延到20多个州。至此，PDCoV开始受到研究者的关注。随后，韩国、加拿大、中国、越南、老挝、泰国等 10多个国家或地区相继报道了PDCoV感染的发生与流行。目前，PDCoV感染在多个养猪国家广泛存在，给养世界猪业造成了较大的经济损失。
PDCoV对不同品种和日龄的猪均易感，但对仔猪的危害最大，感染仔猪主要表现为呕吐、腹泻、脱水甚至死亡，其它日龄猪感染后临床症状较轻或呈隐性感染。但泰国学者在2015年报道的病例证实PDCoV感染不仅能导致新生仔猪的大量死亡(死亡率高达64.27％)，而且也能导致母猪的死亡(死亡率为27.63％)，引起世界养猪业的高度关注(Janetanakit et al.Porcine Deltacoronavirus,Thailand,2015.Emerg Infect Dis,2016,22:757- 759.)。
最近的研究发现，PDCoV除了感染猪以外，还可以感染鸡、牛、小鼠、火鸡，甚至可以感染人，是一种潜在的人兽共患病病原。但目前尚无针对该病的疫苗和特效药物，因此开展病毒的分离鉴定和疫苗的制备对预防和控制PDCoV感染十分重要。
申请公布号为CN 110747175A的中国发明专利申请，从猪肠道组织中分离，并经传代纯化获得一株猪δ冠状病毒P DC-SX19，其微生物保藏号为CGMCC No.18332。该分离株能够在传代细胞上稳定增殖，产生典型细胞病变。虽然该猪δ冠状病毒分离株具有优异的免疫原性，采用该分离株制备的疫苗能够诱导仔猪产生中和抗体，但是该猪δ冠状病毒株致病力低，并不是制备PDCoV灭活疫苗的优选毒株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株猪δ冠状病毒强毒株DHeB1株，该毒株具有较高的增殖滴度、致病性和免疫原性。
本发明的另一个目的在于提供PDCoV DHeB1株用于制备猪δ冠状病毒疫苗，所述疫苗优选为灭活疫苗。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
从临床发生腹泻仔猪的小肠内容物中分离到一株PDCoV，命名为猪δ冠状病毒DHeB1株，将该猪δ冠状病毒强毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V202217。经与发明人所在实验室分离的另两株PDCoV(DHN株和DJX株)以及现有的PDCoV进行比较，发现PDCoV DHeB1具有更高的增殖滴度、更强的致病性和更好的免疫原性，是制备PDCoV灭活疫苗的优选毒株。该毒株的分离鉴定过程如下：
1.猪δ冠状病毒DHeB1株的分离鉴定：无菌收集经RT-PCR检测为PDCoV阳性的仔猪小肠内容物，处理后接种LLC-PK1细胞单层，经细胞病变观察、RT-PCR检测和间接免疫荧光(IFA)检测证实获得PDCoV，将其命名为PDCoV DHeB1株。
2.猪δ冠状病毒DHeB1株在细胞中的增殖能力：分别测定PDCoV DHeB1株第6 代、第11代和第15代病毒的TCID50，并与发明人所在实验室之前分离的PDCoV DHN株和DJX株(均为2020年分离)第11代毒的TCID50进行比较。发现本发明的PDCoV DHeB1株第11代毒的平均TCID50为107.8/mL，明显高于PDCoV DHN株和DJX株第11代毒的TCID50(分别为107.0/mL和107.3/mL)。
3.猪δ冠状病毒DHeB1株对仔猪的致病性：将PDCoV DHeB1和DHN株及DJX株以相同的剂量分别经口服感染5日龄健康仔猪，通过临床症状和病理变化观察对3株病毒的致病性进行比较分析。结果发现PDCoV DHeB1能引起所有感染仔猪发生腹泻、小肠肠壁变透明、变薄，小肠内充满水样液体，并最终死亡，而另两株病毒感染的仔猪虽有不同程度的发病，但其症状和病理变化明显轻于PDCoV DHeB1株感染仔猪，说明PDCoV DHeB1株对仔猪的致病性明显高于PDCoV DHN株和DJX株。
4.猪δ冠状病毒灭活疫苗的制备与评价：将PDCoV DHeB1、DHN株和DJX株第11 代毒的病毒含量均调整为107.0TCID50/mL，加入甲醛灭活后，分别与Montanide ISA 201混合后乳化制成灭活疫苗，经检验合格后对其安全性进行评价，结果显示3种疫苗以1mL/头单剂量接种、2mL/头单剂量接种和1mL/头单剂量2次接种对仔猪均是安全的。免疫原性检测显示PDCoV DHeB1株灭活疫苗诱导的PDCoV中和抗体明显高于PDCoV DHN株和DJX 株，并以DHN株诱导的中和抗体水平最低。说明PDCoV DHeB1株具有最好的免疫原性。
本发明的有益效果为：
本发明成功分离了一株致病性强的猪δ冠状病毒，命名为PDCoV DHeB1株，该毒株的增殖滴度高，免疫原性好，可用于制备灭活疫苗，有效预防临床PDCoV感染。其中，本发明的PDCoV DHeB1株在首免后14天的中和抗体水平达到了1:32，在首免后66天诱导的中和抗体水平最高可达1:656，表明本发明分离的PDCoV DHeB1株具有优异的免疫原性。
附图说明
图1为PDCoV DHeB1株第11代接种LLC-PK1细胞产生的细胞病变。图中，A为未接种病毒的正常细胞对照，B为DHeB1株第11代接种细胞12h产生的细胞病变，C为 DHeB1株第11代接种细胞24h产生的细胞病变。
图2为PDCoV DHeB1株PCR鉴定检测结果。图中，M：DL2000 Marker；1： PDCoVDHeB1；2：阴性对照。
图3为PDCoV DHeB1株IFA鉴定检测结果。
图4为仔猪攻毒后临床观察结果。图中，A为PDCoV DHeB1株攻毒仔猪，B为 PDCoVDHN株攻毒仔猪，C为PDCoV DJX株攻毒仔猪，D为未攻毒仔猪。
图5为仔猪攻毒后剖检观察结果。图中，A为PDCoV DHeB1株攻毒仔猪小肠，B为PDCoV DHN株攻毒仔猪小肠，C为PDCoV DJX株攻毒仔猪小肠，D为未攻毒仔猪小肠。
图6为仔猪免疫后中和抗体检测结果。
保藏信息
保藏时间：2022年3月9日；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏编号：CCTCC NO:V202217；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学；
分类命名：猪δ冠状病毒DHeB1株。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例1：猪δ冠状病毒DHeB1株的分离鉴定
1.病料的采集与处理
无菌收集经RT-PCR检测为PDCoV阳性的仔猪小肠内容物(仔猪来源于河北某猪场)，加入等体积的无血清MEM培养液(购自GIBCO公司)，混匀后于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心10min，取上清至另一无菌离心管中，加入终浓度为500U/mL的青霉素和 500μg/mL的链霉素，于2～8℃下作用过夜，再用0.22μm滤膜过滤除菌，得到病料悬液，置-70℃以下保存或直接接种细胞。
2.病毒的分离与传代
将6孔细胞培养板中的LLC-PK1细胞单层用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液洗2 次，取300μL处理好的病料悬液接种一孔，同时补加300μL含15μg/mL胰酶的无血清 MEM培养液，于37℃5％CO2培养箱中吸附1h，吸弃接种物，加入2mL含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液，于37℃5％CO2培养箱中继续培养。每日于显微镜下观察两次，出现细胞病变后及时收集样品于-80℃反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清再接种细胞。对获得的病毒在LLC-PK1细胞连续传至第15代，观察其在细胞上增殖的稳定性。
处理好的病料样品接种LLC-PK1细胞后24h，可观察到局部的细胞病变(cytopathic effect,CPE)。随着培养时间延长，发生病变的细胞逐渐增多，至接种后48h细胞完全病变，主要表现为细胞圆缩、聚集、裂解、脱落。将获得的病毒液处理后再接种细胞，并在细胞上连续传至第15代，发现随着传代次数的增加，细胞发生病变的时间逐渐缩短，传至第6代时，在病毒接种后24h发生病变的细胞即超过了90％，第6代以后细胞完全病变的时间稳定在20～24h，如图1所示。说明所分离的病毒能够在LLC-PK1细胞上稳定传代。
3.病毒的鉴定
对在LLC-PK1细胞上增殖稳定的病毒，采用RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)的方法进行鉴定。
RT-PCR鉴定：取200μL病毒液，加入1mL Trizol，颠倒混匀，室温静置5～10 min。加入200μL氯仿，盖紧盖子，在震摇器上涡旋震摇15sec，充分混匀后，冰浴10 min；4℃12000rpm离心5min，小心转移80％的上层清亮液体(约500μL～600μL) 到一个新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，4℃12000 rpm离心10min；吸弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心5min，吸弃上清，沉淀于室温晾干(5～10min)后用20μL DEPC水溶解，-70℃以下保存备用或直接进行RT-PCR反应。测定RNA的浓度后，按照诺唯赞反转录试剂盒说明书将1μgRNA反转录为cDNA，利用PDCoV M基因的特异性引物F(5’-CATCTAAGAAGGACGCAGTT- 3’)和R(5’-TGAAGTGGTTATGGTGTGAA-3’)进行PCR扩增，PCR反应体系为10× Buffer 5μL、dNTPs(10mM)1μL、上游、下游引物(20pmol/μL)各1μL、TaqDNA聚合酶 0.5μL、cDNA 1μL、ddH2O 40.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后进入循环：94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取10μLPCR产物于0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
IFA鉴定：用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液将24孔细胞培养板中的LLC- PK1细胞单层洗2次，将PDCoV病毒液接种于24孔板中，于37℃5％CO2培养箱中吸附 1h，吸弃接种物，加入1mL含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液，于37℃5％CO2培养箱中继续培养。待60％～70％细胞出现CPE后，吸弃孔中的培养液，用PBS洗细胞单层 2次，加入1mL 4％的多聚甲醛室温固定15min，吸弃多聚甲醛，加1mL预冷的甲醇透化10 min。PBS洗3次，用含5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭45min，PBS洗3次，加入适当稀释的抗PDCoV N蛋白的单克隆抗体，37℃作用1h，PBS洗3次，每次5min，加 FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃作用45min，加入1:2000稀释的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行核染色15min，PBS洗3次。在倒置荧光显微镜(Olympus FV10)下观察并拍照。
结果：利用PDCoV M基因的特异性引物对分离的病毒进行RT-PCR扩增，获得了大小约440bp的特异性片段，与预期结果一致，如图2所示。
IFA检测结果如图3所示，分离病毒接种的细胞孔出现了特异性荧光，而空白对照没有荧光出现，说明分离的病毒能与PDCoV N蛋白的单抗发生特异性反应。
上述RT-PCR和IFA结果证实分离的病毒为PDCoV，将其命名为PDCoV DHeB1 株，并对该毒株在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏编号为CCTCC NO:V202217。
实施例2：猪δ冠状病毒DHeB1株在细胞中的增殖能力
在证实所分离的病毒为PDCoV后，分别测定第6代、第11代和第15代病毒的TCID50，每一代病毒做3个重复。
测定TCID50的具体操作步骤为：在EP管或青霉素瓶中用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液将病毒液作连续10倍稀释，从10-1至10-9；用含7.5μg/mL胰酶的无血清 MEM培养液将96孔板中的LLC-PK1细胞单层洗2次，取10-4至10-9稀释度的病毒液接种到洗好的LLC-PK1细胞孔中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔100μL；同时设8孔正常细胞对照，细胞对照孔的LLC-PK1细胞单层同样先用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM 培养液洗2次，再在每孔中加入100μL含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液；将96孔板置37℃、含5％CO2的培养箱培养96h，每天观察并记录细胞病变。按Reed-Muench法计算TCID50。同时测定发明人所在实验室之前分离的PDCoV DHN株和DJX株(均为2020年分离)第11代毒的TCID50。
结果：在整个观察期，细胞对照孔细胞正常。PDCoV DHeB1株第6代病毒的平均TCID50为107.0/mL，第11代病毒平均的TCID50为107.8/mL，第15代病毒的平均TCID50为108.5/mL。PDCoV DHN株和DJX株第11代毒的平均TCID50分别为107.0/mL和107.3/mL。上述结果说明PDCoV DHeB1株在LLC-PK1细胞上具有较高的增殖滴度。
实施例3：猪δ冠状病毒DHeB1株对仔猪的致病性
将PDCoV DHeB1株、DHN株和DJX株第11代病毒的TCID50均调整为107.0/mL，经口服感染PDCoV抗原抗体均为阴性的母猪所产5日龄仔猪，每组5头，每头10mL，同时设5 头对照仔猪，每头口服10mL MEM培养液。于攻毒后每天观察仔猪的精神状态、采食及排便情况，共观察10d，并于攻毒后60h每组各处死1头仔猪，剖检观察病理变化。
结果：PDCoV DHeB1株攻毒组仔猪在攻毒后18h即有1头出现水样腹泻，在攻毒后24h内所有仔猪均出现水样腹泻，持续3～5天，4头仔猪均死亡(攻毒后60h剖杀的仔猪在剖杀时处于濒死的状态)，60h剖检发现仔猪肠壁透明、变薄，小肠内充满水样内容物； PDCoVDHN株攻毒组仔猪在攻毒后54h有1头出现轻微腹泻，其余仔猪在整个观察期精神状态、采食及排便均正常，攻毒后60h对腹泻仔猪进行剖检，发现肠壁变薄，小肠内含有未消化的黄色内容物；PDCoV DJX株攻毒组仔猪在攻毒后36h和48h各有2头出现水样腹泻，其中2头持续腹泻2～3天后逐渐恢复，1头死亡，1头腹泻最严重的仔猪于攻毒后60h 剖杀，观察发现其肠壁透明、变薄，小肠内含有水样内容物及未消化的黄色内容物，另1头仔猪在整个观察期间只出现了轻微的腹泻，并很快恢复；对照组仔猪在整个观察期精神状态、采食及排便均正常，剖检观察肠道无明显病变。PDCoV DHeB1株、DHN株、DJX株攻毒后临床观察情况和剖检情况分别如图4、5所示。
上述结果说明PDCoV DHeB1株对5日龄仔猪的致病性很强，其次是DJX株，DHN 株对5日龄仔猪的致病性较弱。
实施例4：猪δ冠状病毒灭活疫苗的制备与评价
1.疫苗的制备
根据测定的TCID50，将PDCoV DHeB1株、DHN株和DJX株第11代毒的病毒含量均调整为107.0TCID50/mL，加入终浓度为0.2％体积比的甲醛，充分混合后于37℃灭活48h。将灭活好的病毒液分别与Montanide ISA 201(购自SEPPIC公司，法国)佐剂按照1:1的比例(质量比)混合后乳化，乳化完全后即为灭活疫苗，分装于20mL疫苗瓶中，封盖后保存于2～ 8℃。对制备的疫苗的外观、剂型、稳定性、黏度、无菌和甲醛残留检测均符合要求。
2.疫苗的安全性
将PDCoV抗原抗体均为阴性的母猪所产3～5日龄健康仔猪随机分为A～J共9组，每组5 头。A、B、C组经颈部肌肉接种制备的PDCoV DHeB1株灭活疫苗，D、E、F组经颈部肌肉接种制备的PDCoV DHN株灭活疫苗，G、H、I组经颈部肌肉接种制备的PDCoV DJX株灭活疫苗，其中A、D、G组每头接种1mL；B、E、H组每头接种2mL；C、F、I组每头接种1mL，14d后以相同剂量再接种一次。J组不接种作为对照。接种后连续观察仔猪的临床表现及接种部位的变化，共观察14d(接种2次的仔猪于第二次接种后观察14d)。结果显示，疫苗接种后仔猪的精神状态、体温、食欲、排便等均正常，疫苗注射部位无肿胀、坏死等不良反应，说明制备的3种PDCoV灭活疫苗对3～5日龄仔猪均是安全的。
表1疫苗安全性检测的实验设计
Figure BDA0003557124990000071
“—”：表示不接种。
3.疫苗的免疫原性
选取PDCoV抗原抗体均为阴性的母猪所产3～5日龄健康仔猪20头，随机分为4组，每组 5头，第一组、第二组、第三组分别接种PDCoV DHeB1株灭活疫苗、DHN株灭活疫苗和DJX株灭活疫苗，接种方式为颈部肌肉注射，接种剂量为1mL/头，14d后以相同剂量加强免疫一次；第四组不接种疫苗作为空白对照。于首次接种后7d、14d、24d、38d、52d、66d 分别采血，分离血清，测定PDCoV中和抗体。
中和抗体检测结果如图6所示：PDCoV DHeB1株灭活疫苗免疫仔猪后14d即诱导产生了较高水平的中和抗体，加强免疫后10d(首免后24d)中和抗体水平明显升高，并在加强免疫后52d(首免后66d)达到高峰；而PDCoV DHN株和DJX株诱导的中和抗体明显低于DHeB1株，并以DHN株诱导的中和抗体水平最低。上述结果说明PDCoV DHeB1株具有最好的免疫原性。
表2 3～5日龄仔猪免疫后中和抗体检测结果
Figure BDA0003557124990000072
Figure BDA0003557124990000081
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (10)

1.一株猪δ冠状病毒强毒株，其特征在于，所述猪δ冠状病毒强毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202217，分类命名：猪δ冠状病毒DHeB1株。
2.权利要求1所述的一株猪δ冠状病毒强毒株在制备猪δ冠状病毒疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。
4.一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的猪δ冠状病毒强毒株或其培养物的灭活抗原和药学上可以接受的载体。
5.根据权利要求4所述的一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，所述猪δ冠状病毒强毒株或其培养物的灭活抗原为猪δ冠状病毒强毒株全病毒灭活抗原。
6.根据权利要求5所述的一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，灭活前病毒含量为107.0TCID50/mL。
7.根据权利要求5所述的一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为Montanide ISA 201佐剂。
8.权利要求4所述的一种用于预防猪δ冠状病毒的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，将PDCoV DHeB1株的病毒含量调整为107.0TCID50/mL，在病毒液中加入甲醛灭活后，将灭活好的病毒液与Montanide ISA 201佐剂混合后乳化，乳化完全后即得灭活疫苗，分装于疫苗瓶中，封盖后保存于2～8℃。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述甲醛灭活是在病毒液中加入终浓度0.2%体积比的甲醛，混匀后于37℃灭活48h。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述乳化是将灭活好的病毒液与Montanide ISA 201佐剂按照1:1的质量比混合后乳化。
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