CN110960675B

CN110960675B - 仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN110960675B
Application number: CN201911304444.3A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 王遵宝; 李俊辉; 杜久斌; 潘毅平; 李延涛; 孙彦军; 范斌; 王雨朦; 冶莲; 李晓梅
Original assignee: Tiankang Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Tiankang Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN110960675A

Abstract

本发明提供了一种仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗及其制备方法，涉及疫苗技术领域。该仔猪腹泻防控用肚脐贴片的活性成分包括中药制剂和病毒抗原。中药制剂主要由肉桂、丁香和荜茇制备而成；病毒抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原和猪流行性腹泻病毒抗原。该仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗能有效的诱导仔猪免疫应答，防止仔猪腹泻。

Description

仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，尤其是涉及一种仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗及其制备方法。

背景技术

近年来，我国仔猪腹泻十分普遍，是导致仔猪成活率下降的主要原因，每年给中国和其他许多国家养猪业造成巨大经济损失。数据统计显示，30kg以下的仔猪全年平均发病率为46.5％，死亡率10.3％，在养猪业中危害居首位。仔猪腹泻严重威胁着养猪业的健康，导致饲料报酬低，仔猪成活率下降，生产缓慢，生产发育停滞(僵猪)，甚至死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效的预防和防治措施，提高仔猪成活率已经成为广大养殖户最为关心的一个问题。

仔猪腹泻(下痢)是消化道功能絮乱的一个综合症状，往往不是指一种独立存在的疾病，它既可能是由单独一种疾病引起的，也可能是多种致病因子(协同或继发感染)引起，或是其它疾病过程中伴随的一个症状。导致仔猪腹泻的原因有很多，大致可以归纳为病理性腹泻、生理性腹泻、应激性腹泻三大类，其中病理性腹泻又可分为病毒性腹泻、细菌性腹泻和寄生虫性腹泻。猪场常见腹泻主要为病毒性腹泻和细菌性腹泻。

细菌性腹泻由致病性大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、艰难梭菌等引起，大多为继发感染或猪场滥用抗生素导致正常肠道菌群如丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、粪杆菌生长抑制，机会致病菌产生耐药性，大量繁殖产生毒素引起仔猪腹泻。病毒性腹泻主要由传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒和猪丁型冠状病毒单一感染或混合感染引起，在中国近年来由猪流行性腹泻病毒引发的仔猪腹泻最多。

猪病毒性腹泻感染的靶细胞是肠上皮细胞，不同病毒对肠上皮细胞破坏程度不同。消化道表面的SIgA可形成有效的免疫反应，阻断病毒进入肠道上皮细胞。前腹泻疫苗主要以肌肉注射、后海穴注射为主，效果并不很理想，也有通过口服免疫的胶囊、混悬液、包裹颗粒、喷鼻免疫方式，但操作复杂，免疫效果不稳定。主要原因是不能快速地产生有效的、高水平的SIgA中和病毒，阻断其破坏上皮细胞。尽管国内外已研制了多种病毒性、细菌性腹泻相关疫苗，但防控效果存在争议，如何提高腹泻疫苗的免疫效果，也成为众人关注的焦点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，能有效的诱导仔猪免疫应答，防止仔猪腹泻。

本发明的第二目的在于提供上述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，包括中药制剂和病毒抗原；所述中药制剂的制备原料包括肉桂、丁香和荜茇；所述病毒抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原和猪流行性腹泻病毒抗原。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的制备方法，包括将中药制剂、病毒抗原和基材复合，得到所述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，主要的活性成分包括主要由PEDV和TGEV组成的病毒抗原，和主要由肉桂、丁香和荜茇制备得到的中药制剂。病毒抗原辅以具有改善胃肠血液循环，刺激胃液分泌，促进肠粘膜的吸收和提高机体免疫力的中药，用于仔猪出生后保护脐带，能够防止感染，并具有如下有益效果：

(1)经脐进行早期给药、免疫，能够快速诱导黏膜免疫应答，有效防控仔猪病理性腹泻，尤其可有效预防、控制由猪传染性胃肠炎-流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻。(2)使用方便、简单，避免针头注射免疫，提高动物福利，降低了猪场人员的工作强度，更有利于猪场免疫效果的改善。(3)可以有效保护出生仔猪脐带免受外部细菌感染，从而提高乳猪成活率。(4)可改善仔猪胃肠血液循环，刺激胃液分泌，促进肠粘膜的吸收和提高机体免疫力。

本发明提供的上述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，制备方法操作简单，无需特殊设备，适合广泛使用和批量生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例提供的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的示意图；

图2为实施例提供的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中药剂层的俯视图；

图3为效果例1中不同免疫组仔猪抗PEDV中和抗体测定结果；

图4为效果例1中不同免疫组仔猪抗TGEV中和抗体测定结果。

图标：100-基材；210-第一胶粘层；220-第二胶粘层；300-药剂层；310-中药制剂；320-病毒抗原；400-防粘层。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗。脐是胚胎发育过程中腹壁最后闭合处，不仅表皮角质层薄，无任何脂肪组织，屏障作用差，而且含有丰富的血管，渗透性强、吸收快，利于疫苗及药物的透皮吸收，并能够快速、弥散地穿透进入黏膜及血液循环，产生全身效应。

本发明提供的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中主要以中药制剂和病毒抗原作为活性成分。

中药制剂的部分主要由肉桂、丁香和荜茇为原料制成。肉桂、丁香为辛香走窜、通经走络之物。肉桂温中散寒，富含锌元素，有温中补肾、散寒止痛功能，主治腰膝冷痛，虚寒胃痛，慢性消化不良，腹痛吐泻，受寒经闭。丁香味辛，性温，归脾、胃、肺、肾经，有温中降逆，补肾助阳的功效，可用于治疗脾胃虚寒，呃逆呕吐，食少吐泻，心腹冷痛。荜茇为镇痛健胃药，味辛大温，无毒，用于胃寒引起的腹痛、呕吐酸水、腹泻、冠心病心绞痛、神经性头痛及牙痛等。三者均富含挥发油，均能够通过内关穴透皮吸收，有效改善胃肠血液循环，刺激胃液分泌，促进肠粘膜的吸收和提高机体免疫力等作用。

病毒抗原的部分包括猪传染性胃肠炎病毒抗原和猪流行性腹泻病毒抗原。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒属的正义单链RNA病毒，能够引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)。PED它是一种急性接触性肠道传染病，其特征为腹泻、脱水和呕吐。各种日龄的猪均易感，日龄越小，症状越严重，哺乳仔猪发病率高达100％，死亡率达50％～100％。PED多发生于寒冷的冬季，临床特征为呕吐、水样腹泻、脱水。病毒存于病猪的肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，随粪便排出后污染环境、饲料、饮水、交通工具及用具而污染。

猪传染性胃肠炎病毒于冠状病毒属的正义单链RNA病毒，能够引起猪传染性胃肠炎。猪传染性胃肠炎是一种急性高度接触性肠道传染病。临床上以厌食、呕吐、严重腹泻、脱水为特征。多发生于春、冬季，能迅速传播各种年龄的猪。10日龄以内仔猪病死率接近100％，5周龄以上仔猪的死亡率很低。

本发明以猪传染性胃肠炎病毒抗原和猪流行性腹泻病毒抗原作为引起猪免疫反应的主要抗原，一方面，PEDV和TGEV能够有效的激发仔猪的免疫系统，提高仔猪的免疫力，从而提高仔猪对各种病原微生物的抵抗能力，降低仔猪病理性腹泻的发病率。另一方面，以PEDV和TGEV作为免疫原能够引起仔猪对PEDV和TGEV的适应性免疫，提高仔猪对猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的抵抗作用。

本发明提供的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，以病毒抗原辅以具有改善胃肠血液循环，刺激胃液分泌，促进肠粘膜的吸收和提高机体免疫力的中药如肉桂、丁香和荜茇等，能够在仔猪出生后保护脐带，防止感染。该仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗经脐进行早期给药、免疫，能够快速诱导黏膜免疫应答，有效防控仔猪病理性腹泻。该仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗操作方便，可有效降低仔猪腹泻发病率。

在一些优选的实施方式中，按照质量分数计，所述中药制剂的制备原料包括肉桂0.8～1份，例如可以为但不限于为0.8份、0.9份或1份；丁香0.8～1份，例如可以为但不限于为0.8份、0.9份或1份；和荜茇0.01～0.03份，例如可以为但不限于为0.01份、0.02份、0.03份。将肉桂、丁香和荜茇以上述用量制备中药制剂，效果更佳。每头份仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗优选含有中药制剂0.8～1g，例如可以为但不限于为0.8g、0.9g或1g。按照质量分数计，所述中药制剂的制备原料优选包括肉桂0.9～1份、丁香0.9～1份和荜茇0.02～0.03份。

在一些优选的实施方式中，所述中药制剂包括第二粉末和挥发油的混合物；所述第二粉末包括清膏、肉桂粉末、丁香粉末和荜茇粉末的混合物经干燥后，再粉碎得到的粉末；所述清膏主要由肉桂、丁香和荜茇混合后制备得到；所述挥发油包括在制备所述清膏过程中收集得到的挥发油。将药物制备成清膏、挥发油、粉末再混合可有效促进药物向机体的渗透及缓释作用。

在上述实施方式中，将用于制备中药制剂的原料一部分用于制备清膏，另一部分用于制备肉桂粉末、丁香粉末和荜茇粉末。可以理解的是，用于制备清膏和粉末的肉桂、丁香和荜茇的总用量，应符合按照质量分数计，肉桂0.8～1份、丁香0.8～1份和荜茇0.01～0.03份的配比。

用于制备清膏的肉桂优选占肉桂总质量的50～60％，例如可以为但不限于为50％、55％或60％；用于制备清膏的丁香优选占丁香总质量的50～60％，例如可以为但不限于为50％、55％或60％；用于制备清膏的荜茇优选占荜茇总质量的50～60％，例如可以为但不限于为50％、55％或60％。清膏和肉桂粉末、丁香粉末和荜茇粉末混合后优选干燥至含水率不超过5％；第二粉末的优选过100目筛。

在一些优选的实施方式中，所述中药制剂中优选还包括本领域常规的辅料，优选包括渗透剂和/或赋形剂；渗透剂能够提高药物的透皮作用，促进仔猪对药物的吸收；赋形剂能够使药物更好的形成贴片，使药物在使用过程中形成良好的使用感。可选地，所述中药制剂包括渗透剂；可选地，所述中药制剂包括赋形剂；可选地，所述中药制剂包括渗透剂和赋形剂。

渗透剂包括但不限于薄荷脑、甘油、水蔓清、月桂氮酮、氮酮、丙二醇和乙醇中的至少一种；渗透剂可以选自薄荷脑、甘油、水蔓清、月桂氮酮、氮酮、丙二醇和乙醇中的一种；也可以多种联合使用，例如将甘油和氮酮联合使用，或将薄荷脑和丙二醇联合使用等。渗透剂优选包括甘油和氮酮，其中甘油的用量优选为第二粉末质量的0.8～1.2％，氮酮的用量优选为第二粉末质量的0.8～1.2％。在一些可选的实施方式中，所述赋形剂的用量为第二粉末质量的75～85％；例如可以为但不限于为75％、80％或85％。赋形剂包括凡士林、二甲硅油、羊毛脂和蜂蜡中的至少一种；赋形剂可以选自凡士林、二甲硅油、羊毛脂和蜂蜡中的其中；也可以多种联合使用，例如将凡士林和羊毛脂联合使用，或将凡士林和蜂蜡联合使用等。赋形剂优选包括凡士林和羊毛脂，凡士林和羊毛脂的质量比为(1～1.5)：(1～1.5)，更优选按照等比例混合。

本发明提供的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中病毒抗原的形式本发明不做限制，可以为疫苗中抗原的常规形式，包括但不限于减毒活病毒、灭活病毒，以及病毒中具有抗原作用的蛋白、多肽和重组蛋白等。

在一些优选的实施方式中，猪传染性胃肠炎病毒抗原包括灭活猪传染性胃肠炎病毒，含有完整病毒颗粒的灭活病毒免疫原性更佳。灭活前的TGEV的滴度优选为每头份10⁷～10^7.5TCID₅₀/ml，能够得到较高的免疫效果。TGEV优选采用CJ株，TGEV优选采用CJ株，该毒株在新疆分离获得，为当前国内优势流行毒株。

在一些优选的实施方式中，猪流行性腹泻病毒抗原包括灭活猪流行性腹泻病毒，含有完整病毒颗粒的灭活病毒免疫原性更佳。灭活前的PEDV的滴度优选为每头份10⁷～10^7.5TCID₅₀/ml，能够得到较高的免疫效果。PEDV优选采用DB株，该毒株在基于S基因的猪流行性腹泻病毒系统进化树分析结果显示属于G2-a亚群，为当前国内流行毒株。

灭活猪传染性胃肠炎病毒和灭活猪流行性腹泻病毒分别独立的优选为冻干的灭活病毒。冻干能够降低病毒在干燥过程中分子结构的改变，保持抗原表位的有效的免疫原性，同时还能提高病毒抗原的有效期。

在一些优选的实施方式中，仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗包括基材，基材上依次设置第一胶粘层和药剂层，其中药剂层包含中药制剂和涂布于中药制剂远离基材层表面的病毒抗原；病毒抗原优选涂布于中药制剂表面的中心区域，以使贴敷时，病毒抗原可以和仔猪肚脐的位置相对应。所述药剂层远离基材的表面还设置有防粘层，以避免中药制剂和病毒抗原泄露，优选在防粘层和药剂层之间设置第二胶粘层以固定防粘层。基材优选透气的无纺布。第一胶粘层和第二胶粘层分别独立的优选由压敏胶粘剂制成。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的制备方法，包括将中药制剂、病毒抗原和基材复合，得到所述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗。该制备方操作简单，无需特殊设备，适合广泛使用和批量生产。

在一些优选的实施方式中，使用第一胶粘层将药剂层固定于基材表面，然后使用第二胶粘层将防粘层固定于药剂层的另一面；优选将中药制剂固定于基材表面后，在中药制剂表面的中心区域涂布病毒抗原，得到所述药剂层，再使用第二胶粘层固定防粘层。

在一些优选的实施方式中，仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中中药制剂的部分按照如下方法制备得到，用于制备中药制剂的中药原料优选在使用前均经过炮制。

(a)按照配方量将部分肉桂、部分丁香和部分荜茇混合，制备成清膏，并收集制备清膏过程中产生的挥发油；优选将肉桂、丁香和荜茇混合后依次经蒸馏、煎煮、过滤和浓缩后得到清膏。

制备清膏时的优选工艺参数如下：先将部分肉桂、部分丁香和部分荜茇在水中浸泡4～8h再蒸馏，其中水的用量优选为药物质量的4～6倍，更优选为5倍；优选在浸泡前先将部分肉桂、部分丁香和部分荜茇粉碎至过2号筛，再用水浸泡，粉碎可以将肉桂、丁香和荜茇分别粉碎，再将粉末混合，或者先将肉桂、丁香和荜茇混合后再粉碎，本发明对此不作限制。将和水混合的药物粉末放入蒸馏瓶内，通入水蒸气加热蒸馏，蒸馏时间优选3～5小时，收集冷凝管中的油状蒸馏液体，待无油状液体馏出时，继续蒸馏一段时间后停止，通常继续蒸馏10～15min，将药物固形物从蒸馏瓶中取出，将药物固形物从蒸馏瓶中取出再和水混合煎煮，水的用量优选为药物固形物质量的6～8倍，煎煮时间可选的为1～2h，优选1.5h。煎煮优选至少煎煮两次。当煎煮多次时在浓缩前优选将每次煎煮后的煎液合并，然后固液分离，固液分离优选先静置沉淀再常压过滤。浓缩得到的清膏优选在60～65℃的条件下相对密度为1.21～1.25，所述相对密度的参考物质为水。

(b)将剩余部分肉桂、剩余部分丁香和剩余部分荜茇粉碎成粉末，肉桂、丁香和荜茇可以先混合再粉碎成粉末，也可以先分别粉碎成粉末再混合，本发明对此不作限制，得到含有肉桂粉末、丁香粉末和荜茇的第一粉末，第一粉末优选过90目筛。

(c)将清膏和第一粉末混合后干燥，优选干燥至含水量低于5％，然后粉碎成第二粉末，第二粉末优选过100目筛。

(d)将第二粉末和挥发油混合均匀，得到中药制剂，优选先将第二粉末与配方量的渗透剂和赋形剂混合均匀，更优选在55～65℃的温度条件下将第二粉末、渗透剂和赋形剂混合成糊状体，再将挥发油加入到糊状体中。

(e)将步骤(d)得到的糊状体压制成型，然后冷却。

在一些优选的实施方式中，灭活猪传染性胃肠炎病毒和灭活猪传染性胃肠炎病毒分别独立的按照如下方法制备：将病毒使用灭活剂灭活，然后加入阻断剂阻断灭活过程，得到灭活的病毒作为仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中的抗原部分。灭活剂可选择本领域常规的灭活剂，优选使用甲醛，甲醛对病毒的核酸和蛋白均有破坏作用，且甲醛对单链病毒最为有效，适合PEDV和TGEV的灭活。阻断剂可选择本领域常规的阻断剂，当使用甲醛作为灭活剂时，使用亚硫酸钠作为阻断剂。在一些优选的实施方式中，优选以甲醛作为灭活剂，灭活病毒的温度为35～40℃，灭活时间为9～11h，更优选在灭活期间每1～2h搅拌一次，每次4～6min，以使病毒灭活的更均匀。

在一些优选的实施方式中，灭活猪传染性胃肠炎病毒和灭活猪传染性胃肠炎病毒分别独立的经冻干处理。其中优选使用如下配方的冻干保护剂：按照每1000mL冻干保护剂计包括右旋糖酐2.5～3.5g、酶解酪蛋白14～16g、蔗糖4.5～5.5g、脱脂奶粉9～11g、Na₂HPO₄·12H₂O 1.2～1.3g和NaH₂PO₄·2H₂O 1.6～1.65g，余量为水。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例

(一)灭活病毒抗原制备

1.猪传染性胃肠炎病毒(CJ株)制备

将冻存的ST细胞从液氮罐中取出，在37℃水浴中适当晃动，使冻存细胞迅速融化，1000r/min离心5～10min弃去冻存液，加MEM(含10％胎牛血清)重悬细胞，平铺于细胞培养瓶上，置37℃、5％CO₂恒温培养箱培养。当细胞长至单层时用0.25％胰酶消化后进行细胞计数。若细胞数不足，可进行适当传代，直至达到需要的细胞数量，用于病毒扩繁。

取猪传染性胃肠炎病毒(CJ株)第5～10代病毒液，按MOI为10^-4～10^-5接种于弃去上清液的ST细胞，置于5％CO₂的37℃恒温培养箱中感作、吸附，1～2小时后加入含2％胎牛血清的MEM培养液，继续培养24～36小时，待细胞出现70％～80％的CPE时收获病毒，将收获的病毒反复冻融三次，低温5000r/min离心30分钟去除细胞碎片，-80℃保存备用。

选择培养24小时生长状态良好的已长成致密单层的ST细胞一瓶，按常规的消化方式，将消化后吹匀的ST细胞悬液加入96孔细胞培养板，于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养至贴壁，弃上清，用2％的MEM培养液将收获的TGEV CJ株病毒液作连续10倍梯度稀释，每个稀释度各设8个重复孔，分别接种于96孔细胞培养板。在接种后第4日，用倒置显微镜观察判定96孔板的细胞病变(CPE)，按照Reed-Muench法计算病毒含量。

2.猪流行性腹泻病毒(DB株)制备

从液氮罐中取出Vero细胞冻存管，迅速置37℃水浴2～3分钟溶解，以1000r/min离心5～10分钟，去除冻存液，加MEM(含6％胎牛血清)重悬细胞，平铺于细胞培养瓶上，置37℃、5％CO₂培养箱培养，当细胞长至单层时用0.25％胰酶消化后进行细胞计数。若细胞数不足，可进行适当传代，直至达到需要的细胞数量，用于病毒扩繁。

将PEDV DB株毒种接种于生长良好的Vero细胞，按MOI为10^-4～10^-5接种，然后补足MEM(胰酶含量为10μg/ml)维持液，培养72～96小时，当细胞出现80％～90％病变时，收获病毒培养物，冻融离心后分装至无菌容器中，置-70℃以下冷冻保存。

将病毒样品梯度稀释后接种于长满单层Vero细胞的96孔板，弃去细胞生长液，置37℃5％CO₂培养箱中培养。在接种后第5日，用倒置显微镜观察判定96孔板的细胞病变(CPE)。CPE包括细胞聚集、变圆、皱缩、核固缩、细胞呈灶状脱落等，按Spearman Karber方法计算病毒含量。

3.病毒液灭活及冻干方法

分别取病毒滴度10⁷TCID₅₀/ml的猪传染性胃肠炎病毒(CJ株)和猪流行性腹泻病毒(DB株)，按0.1％(体积比)的量加入甲醛溶液，37℃灭活10小时，期间每1～2小时搅拌一次，每次5分钟。灭活后的病毒液加入无菌亚硫酸钠溶液(90.0g/L)，灭活剂与阻断剂体积比为1︰10，室温反应1小时，取样后迅速降温至2～8℃备用。

按表1配制冻干保护剂，注射水中加入称量的原料，同时不停搅拌，逐一溶解，一种溶解完才可溶解另一种，完全溶解后用绢纱过滤，经116℃高压灭菌30min，及时移至2～8℃保存备用。

取检验合格的灭活病毒液与冻干保护剂等体积混合后，用冻干机进行冻干，冻干标准为每头份含灭活前猪传染性胃肠炎病毒(CJ株)和猪流行性腹泻病毒(DB株)各10⁷TCID₅₀/ml。

表1冻干保护剂配方

序号	原料	用量
			1	右旋糖酐	3g
2	酶解酪蛋白	15g
			3	蔗糖	5g
4	脱脂奶粉	10g
			5	Na₂HPO₄.12H₂O	1.285g
6	NaH₂PO₄.2H₂O	1.625g
			7	注射水	定容至1000ml

(二)仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中中药制剂的制备

仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗中中药制剂的部分的制备原料主要包括肉桂、丁香和荜茇，原料药重量配比为肉桂：丁香：荜茇＝1:1:0.02。中药制剂部分的制备方法如下：按配料比称取以上三味中药，经炮制后混匀，取其总量的1/2粉碎，用2号筛过滤后经5倍蒸馏水浸泡4～8h，将混合物放入蒸馏瓶内，通入水蒸气加热蒸馏3～5小时，收集冷凝管中的油状蒸馏液体，待无油状液体馏出时，继续蒸馏12分钟后停止。将药物固形物从蒸馏瓶中取出，加入加6～8倍量的水煎煮两次，每次1.5h，合并煎液，静置沉淀，常压过滤、浓缩至相对密度为1.21～1.25(60℃～65℃)的清膏。将其余中药粉碎成90目的细粉为第一粉末；将清膏均匀地拌入第一粉末中，置于56摄氏度烘箱内，干热除水，使之含水量为3～5％，冷却至室温后粉碎成100目细粉，作为第二粉末，并称重；在第二粉末中加入占第二粉末重量各1％的甘油和氮酮，和占80％的等质量混合的凡士林、羊毛脂混合物，缓慢升温至60℃搅拌成糊状，并将收集的挥发油缓慢加入到糊状体内，边加边搅拌，待成色泽均匀的糊状体后，压制成型，冷却。

(三)仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的制备

本实施例制备得到的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗如图1和图2所示，以无纺布为基材100，用压敏胶粘剂为第一胶粘层210，将中药制剂310固定在基材100后，在其上方中心处1cm直径范围内均匀涂布灭活后冻干的PEDV病毒粉末和TGEV病毒粉末，作为病毒抗原320，病毒抗原320和中药制剂310组成药剂层300，药剂层300表面表面辅以少量压敏胶粘剂制成的第二胶粘层220固定，用防粘纸作为防粘层400轻覆于其上复合制成，每头份仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗含1g中药制剂及各10⁷TCID₅₀/ml灭活后的TGEV和PEDV。

效果例1

用血液、肛拭子中TGEV、PEDV、PDCoV、RV核酸检测为阴性、TGE、PED抗体为阴性(中和抗体效价不大于1：4)的妊娠母猪所产的40头仔猪为供试动物，分为8组，每组5头，用于评价仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的免疫攻毒保护效果，具体试验设计及免疫攻毒方式见表2。

表2试验设计及免疫攻毒方式

(一)血清抗体测定

在仔猪出生后24小时内用商品化的猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联活疫苗、灭活疫苗进行免疫，其中活疫苗组、灭活疫苗组均采用耳后颈部肌肉注射疫苗1头份；仔猪出生后用贴片疫苗撕去防粘纸后贴于仔猪肚脐处即可。分别采集免疫前、免疫后第7、14、21日龄血样，无菌分离血清，测定仔猪血清中抗TGEV、PEDV的中和抗体。

中和抗体检测结果显示，贴片疫苗组(第六、七组)仔猪各阶段血样中抗TGEV、PEDV抗体均高于活疫苗组(第一、二组)和灭活疫苗组(第三、四组)，未免疫组(第七、八组)。抗PEDV和TGEV中和抗体详细结果见图3和图4。

(二)免疫攻毒保护试验

仔猪注射免疫后21日，将试验猪转移至负压动物房，各组完全独立。用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒效检强毒分别进行人工口服感染，具体攻毒剂量及分组见表2。

TGEV强毒人工感染结果显示，猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联活疫苗免疫组(第一组)在攻毒后7日内2/5头发生腹泻；灭活疫苗组(第三组)1/5头发生腹泻，随后康复；贴片疫苗组(第五组)1/5发生轻微腹泻，无猪只死亡；对照组5/5发生腹泻，2/5呕吐，1/5发生死亡(第七组)详见表3。

PEDV强毒人工感染结果显示，猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联活疫苗免疫组(第二组)在攻毒后7日内2/5头发生腹泻；灭活疫苗组(第四组)1/5头发生腹泻，随后康复；贴片疫苗组(第六组)5/5完全保护；对照组5/5发生腹泻，2/5呕吐(第八组)详见表4。

表3TGEV强毒人工感染试验猪攻毒保护与中和抗体相关性分析结果

表4PEDV强毒人工感染试验猪攻毒保护与中和抗体相关性分析结果

效果例2

使用示范例：

在仔猪腹泻流行(仔猪腹泻率15％)的规模化猪场同一圈舍，随机选择2-4胎次妊娠中期母猪60头，采用猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联活疫苗在产前35日经耳后颈部肌肉注射免疫，1头份/头；产前14日经后海穴注射免疫猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联灭活疫苗1头份/头。

供试母猪所产仔猪均分为四组，在出生后24小时内采用活疫苗、灭活疫苗、贴片疫苗进行免疫干预，每组15窝，其余15窝作为对照，不做任何处理。记录各组仔猪发生腹泻情况，统计腹泻发生率、1月龄存活率；在仔猪出生、1月龄时称重、随机采血，测定血清中抗TGEV、PEDV抗体。

各组仔猪出生重差异不显著，1月龄时贴片疫苗组平均体重最大，为7.63kg，对照组最小，为6.89kg，两组间差异有统计学意义。临床发病率、存活率结果显示，对照组仔猪腹泻发病率可达9.37％，1月龄仔猪存活率最低，为95.32％；贴片免疫组腹泻发病率为3.15％，存活率最高。抗TGEV、PEDV抗体测定结果表明，贴片疫苗免疫组两种抗体最高，分别为1：91和1：45，灭活疫苗与活疫苗次之，对照组最低。实验结果如表5所示。

表5

以上结果表明，贴片疫苗的免疫效果优于注射用活疫苗及灭活疫苗，操作方便、安全。使用贴片疫苗可以有效、快速诱导仔猪产生抗TGEV、PEDV的抗体，帮助仔猪抵抗PED强毒攻击，缓解发病症状，避免发生死亡。在临床中有效降低腹泻发病率及致死率，控制疫情蔓延。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，包括中药制剂和病毒抗原；

所述中药制剂的制备原料包括肉桂、丁香和荜茇；

所述病毒抗原由灭活猪传染性胃肠炎病毒和灭活猪流行性腹泻病毒组成；

按照质量分数计，所述中药制剂的制备原料包括肉桂0.8~1份、丁香0.8~1份和荜茇0.01~0.03份；

灭活前的猪传染性胃肠炎病毒的滴度为每头份10⁷~10^7.5TCID₅₀/ml；

灭活前的猪流行性腹泻病毒的滴度为每头份10⁷~10^7.5TCID₅₀/ml；

每头份仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗含中药制剂0.8~1g。

2.根据权利要求1所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，按照质量分数计，所述中药制剂的制备原料包括肉桂0.9~1份、丁香0.9~1份和荜茇0.02~0.03份。

3.根据权利要求2所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述中药制剂包括第二粉末和挥发油的混合物；

所述第二粉末包括清膏、肉桂粉末、丁香粉末和荜茇粉末的混合物经干燥后，再粉碎得到的粉末；所述清膏主要由肉桂、丁香和荜茇混合后制备得到；所述挥发油包括在制备所述清膏过程中收集得到的挥发油。

4.根据权利要求3所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，用于制备清膏的肉桂占肉桂总质量的50~60%；

用于制备清膏的丁香占丁香总质量的50~60%；

用于制备清膏的荜茇占荜茇总质量的50~60%；

所述干燥为干燥至含水率为3~5%；

所述第二粉末过100目筛；

所述中药制剂中还包括渗透剂和/或赋形剂；

所述渗透剂包括薄荷脑、甘油、水蔓清、月桂氮酮、氮酮、丙二醇和乙醇中的至少一种；

所述赋形剂包括凡士林、二甲硅油、羊毛脂和蜂蜡中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述渗透剂包括甘油和氮酮；

甘油的用量为所述第二粉末质量的0.8~1.2%；

氮酮的用量为所述第二粉末质量的0.8~1.2%。

6.根据权利要求4所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述赋形剂的用量为所述第二粉末质量的75~85%；

所述赋形剂包括凡士林和羊毛脂；

凡士林和羊毛脂的质量比为（1~1.5）：（1~1.5）。

7.根据权利要求1所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒抗原包括冻干的灭活猪传染性胃肠炎病毒。

8.根据权利要求1所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，猪传染性胃肠炎病毒包括CJ株。

9.根据权利要求1所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒抗原包括冻干的灭活猪流行性腹泻病毒。

10.根据权利要求1所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，猪流行性腹泻病毒包括DB株。

11.根据权利要求1-10任一项所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗包括基材，基材上依次设置第一胶粘层和药剂层，所述药剂层包含中药制剂和涂布于中药制剂远离基材层表面的病毒抗原。

12.根据权利要求11所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗，其特征在于，所述病毒抗原涂布于中药制剂表面的中心区域；

所述药剂层远离基材的表面还设置有防粘层；

所述防粘层和药剂层之间设置第二胶粘层；

所述基材包括无纺布；

所述第一胶粘层和所述第二胶粘层分别独立的由压敏胶粘剂制成。

13.权利要求1-12任一项所述的仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗的制备方法，其特征在于，包括将中药制剂、病毒抗原和基材复合，得到所述仔猪腹泻防控用肚脐贴片疫苗。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述中药制剂按照如下方法制备：

（a）按照配方量将所述制备原料中的部分肉桂、部分丁香和部分荜茇混合，制备成清膏，并收集制备清膏过程中产生的挥发油：

（b）将剩余部分肉桂、剩余部分丁香和剩余部分荜茇粉碎成粉末，得到含有肉桂粉末、丁香粉末和荜茇粉末的第一粉末；

（c）将所述清膏和所述第一粉末混合后干燥，然后粉碎成第二粉末；

（d）将所述第二粉末和所述挥发油混合均匀，得到所述中药制剂。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤（a）中，将部分肉桂、部分丁香和部分荜茇按照配方量混合后依次经蒸馏、煎煮、过滤和浓缩，制备得到所述清膏。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，先将部分肉桂、部分丁香和部分荜茇在水中浸泡4~8h，再蒸馏；

水的用量为药物质量的4~6倍。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，水的用量为药物质量的5倍。

18.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，先将部分肉桂、部分丁香和部分荜茇粉碎至过2号筛，再用水浸泡。

19.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，蒸馏的时间为3~5h；

将蒸馏后的药物固形物和6~8倍质量的水混合并煎煮；

煎煮的时间为1~2h。

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，煎煮的时间为1.5h。

21.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，至少煎煮两次；

当至少煎煮两次时，浓缩前先合并滤液；

清膏在60~65℃的条件下相对密度为1.21~1.25，所述相对密度的参考物质为水。

22.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述第一粉末过90目筛。

23.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤（c）中所述清膏和所述第一粉末混合后干燥至含水量为3~5%；

所述第二粉末过100目筛。

24.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤（d）中先将所述第二粉末与渗透剂和赋形剂混合，再与所述挥发油混合。

25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，步骤（d）在55~65℃的温度条件下将所述第二粉末、渗透剂和赋形剂混合成糊状体，再将所述挥发油加入到糊状体中；

所述挥发油与其他组分混合时，挥发油边加入边搅拌。

26.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，肉桂、丁香和荜茇在制备所述清膏和所述第一粉末前经过炮制。

27.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，灭活猪传染性胃肠炎病毒和灭活猪流行性腹泻病毒分别独立的按照如下方法制备：将病毒使用灭活剂灭活，然后加入阻断剂阻断灭活过程，得到灭活的病毒。

28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述灭活剂包括甲醛；

所述阻断剂包括亚硫酸钠；

灭活病毒的温度为35~40℃，灭活时间为9~11h；

灭活期间每1~2h搅拌一次，每次4~6min。

29.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，灭活猪传染性胃肠炎病毒和灭活猪流行性腹泻病毒分别独立的经冻干处理；

病毒采用如下冻干保护剂冻干：按照每1000mL冻干保护剂计，所述冻干保护剂包括右旋糖酐2.5~3.5g、酶解酪蛋白14~16g、蔗糖4.5~5.5g、脱脂奶粉9~11g、Na₂HPO₄·12H₂O 1.2~1.3g和NaH₂PO₄·2H₂O 1.6~1.65g，余量为水。

30.根据权利要求13-29任一项所述的制备方法，其特征在于，使用第一胶粘层将药剂层固定于基材表面，然后使用第二胶粘层将防粘层固定于药剂层的另一面。

31.根据权利要求30所述的制备方法，其特征在于，将中药制剂通过第一胶粘层固定于基材表面，然后在中药制剂表面的中心区域涂布病毒抗原，得到所述药剂层，再使用第二胶粘层固定防粘层。