KR100859824B1

KR100859824B1 - 고양이 칼리시바이러스 질병에 대한 불활성화 백신

Info

Publication number: KR100859824B1
Application number: KR1020027000615A
Authority: KR
Inventors: 플레에르베; 구트브로즈실뱅가브리엘
Original assignee: 메리알
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2008-09-23
Also published as: DK1194450T3; ATE280182T1; BR0012500A; HUP0202389A3; JP2003505400A; BR0012500B1; PL352461A1; EP1194450B1; PL205298B1; FR2796282A1; JP4841775B2; KR20080012405A; HU228430B1; PT1194450E; CA2378802C; AU6576400A; DE60015127T2; AR024770A1; FR2796282B1; MXPA02000536A

Abstract

본 발명은 특히 고양이의 칼리시바이러스 질병에 유효한 불활성화된 면역원성 제제 및 백신에 관한 것으로, 동물용 약품으로 수용가능한 담체 또는 부형제 내에 수용되는 수탁번호 CNCM I-2166호로 CNCM에 기탁된 431 FCV 바이러스 균주 또는 그의 등가물 중의 하나를 기본으로 하고, 바람직하게는 다른 FCV 균주 유래의 FCV 바이러스, 특히 수탁번호 CNCM I-2167호로 CNCM에 기탁된 G1 균주 유래의 FCV 바이러스와 조합된다. 본 발명은 또한 수탁번호 CNCM I-2282호로 기탁된 하이브리도마 및 상기 하이브리도마에 의해 제조된 단일 클론 항체에 관한 것이다.

고양이 칼리시바이러스, 불활성화 백신, 하이브리도마, 단일 클론 항체, G1 균주, 교차-혈청 중화.

Description

고양이 칼리시바이러스 질병에 대한 불활성화 백신 {INACTIVATED VACCINE AGAINST FELINE CALICIVIRUS DISEASE}

본 발명은 면역원성 제제 및 백신을 제조하기 위한 고양이 칼리시바이러스의 특정 균주의 용도에 관한 것으로, 특히 고양이 칼리시바이러스증에 대한 불활성화 또는 서브유닛(subunit) 백신에 관한 것이다. 이들 면역원성 제제 및 백신은 또한 다가(multivalent) 면역원성 제제 및 백신을 제조하기 위하여, 다른 고양이 병원체를 기본으로 제조된 면역원성 제제 또는 백신과 조합할 수 있다.

고양이 칼리시바이러스(FCV)는 1957년에 최초로 발표되었다(Fastier L.B. Am.J. Vet. Res. 1957. 18, 382-389). 고양이 칼리시바이러스는 고양이 헤르페스바이러스와 함께 고양이의 상부 기도의 바이러스성 질병의 두 가지 주된 원인 중 하나이다. FCV 바이러스는 15% 내지 25% 수준의 FCV 보균율 및 70% 내지 100%의 항-FCV 혈청이환율(seroprevalence rate)로 다수의 동물을 감염시킨다(Coutts 외, Vet. Rec. 1994. 135. 555-556; Ellis T.M. Australian Vet. J. 1981. 57. 115-118; Harbour 외, Vet. Rec. 1991. 128. 77-80; Reubel 외, Feline Dendistry 1992. 22. 1347-1360). 초기의 고열 단계 후에, 이들 호흡기 질병은 일반적으로 구강 궤양(입천장, 혀, 입술, 코), 비염, 결막염, 가능하게는 식욕감퇴와 무기력증 을 동반한다. FCV 바이러스는 또한 폐렴, 장염 및 관절통(절름발이 증후군)을 야기할 수 있다.

FCV 바이러스는 수평적으로만 전염된다. 즉, 회임기간 동안 어미 고양이로부터 새끼 고양이로 수직적인 전염은 없다(Johnson R.P. Res. Vet. Sci. 1984. 31. 114-119). FCV는 감염된 동물과 건강한 동물간의 접촉에 의해 또는 재채기하는 동안 기도를 통해 전염된다(Wardley RC. Arch. Virol. 1976. 52. 243-249).

고양이 칼리시바이러스는 Caliciviridae과(科)의 나출된 바이러스로서, 크기가 약 7.7 킬로베이스 페어(kilobase pairs; kbp)인 단일 가닥의 포지티브 RNA를 보유한다(Radfor 외, Proc. 1^st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 93-99).

많은 RNA 바이러스와 마찬가지로, FCV 바이러스 집단에는 많은 이질성이 존재한다. 70년대 초 이후 교차-혈청(cross-serum) 중화 실험에 의해 입증된 항원 변형에 의해 FCV들을 여러 개의 바이러스 균주 또는 유사종으로 분류할 수 있다(Radford 외, Proc. 1^st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 93-99).

여러 개의 FCV 균주가 동정 및 분리되었는데, 특히 균주 F9(수탁번호 VR-782로 American Type Culture Collection, 즉 ATCC에 기탁된 것), 균주 2280(ATCC VR-2057), 균주 KCD(ATCC VR-651) 및 균주 CFI(ATCC VR-654) 등이 그것이다.

FCV에 대한 백신 접종은 70년대 말기 이래 약독화 FCV 균주, 주로 Bittle에 의해 1958년에 미국에서 분리된 균주 F9(Bittle 외, Am. J. Vet. Res. 1960. 21. 547-550) 또는 시험관내 또는 생체내 경로로 F9 유래 균주("F9-유사")로부터 도입 되었다.

또한 불활성화 백신을 이용할 수 있다. 그것들은 주로 균주 255 및 2280을 이용하는데, 각각 미국에서 1970년에 폐렴 감염된 고양이(Kahn 및 Gillepsie. Cornell Vet. 1970. 60. 669-683; Powvey 외. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1980. 177. 347-350) 및 1983년에 절름발이 증상의 고양이(Pedersen 외. Fel. Prac. 1983. 13. 26-35; Pedersen N.C. 및 Hawkins K.F. Vet Microbiaol. 1995. 47. 141-156)에서 분리한 것이다.

시간에 따른 항원의 변동 때문에 균주 F9, 255 또는 2280과 같은 60년대 내지 70년대에 분리된 백신 균주에 대항하여 제조된 항혈청들은 매우 적은 수의 90년대의 분리주를 중화시킨다. 예를 들면, 항-F9 혈청은 1990-1996년 기간의 아메리카 분리주의 43%를 중화시키는 것에 반해, 1980-1989년 기간에 대해서는 56%, 1958-1979년 기간에 대해서는 86%를 중화시키며, 1990-1996년 기간의 영국 분리주는 10%만을 중화시킨다(Lauritzen 외. Vet. Microbiol. 1997. 56. 55-63). 따라서, 오래된 FCV 균주 유래의 약독화 및 불활성화 백신은 현재에는 최근의 FCV 균주에 대한 충분한 방어효과를 제공하지 못한다.

본 발명의 목적은 고양이에게서 교차-중화 범위가 넓은 항체를 유발하는 새로운 FCV 균주를 검출하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 고양이 칼리시바이러스증에 대항하는 이들 FCV 균주 유래의 면역원성 제제 및 백신을 제조하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고양이 칼리시바이러스증 및 적어도 다른 하나의 고양이 병원체에 대항하는 다가 면역원성 제제 및 다가 백신을 제조하는 것이다.

본 출원인은 고양이 칼리시바이러스에 감염된 증상을 나타내는 고양이에 대해 프랑스, 영국 및 미국에서 채취한 인두 면봉(pharyngeal swab) 표본에 의해 얻어진 4종의 FCV 균주를 선택했다. 그것들은 각각 균주 G1[프랑스 파리 소재 Institut Pasteur의 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(또는 CNCM)에 수탁번호 I-2167로 기탁됨] 및 균주 431(수탁번호 I-2166으로 CNCM에 기탁됨)로서, 모두 1999년 3월 12일에 기탁된 것이다. 후자의 두 균주는 아메리카형으로 RMI6 및 RMI9로 표기된다. 프랑스에서 분리된 FCV G1 균주는 Tohya Y.에 의해 1978년에 영국에서 분리된 것(Tohya Y. 외, Jpn. J. Sci., 1990, 52, 955-961)으로 G1이라고도 불리우는 FCV 균주에 상응하지 않는다.

FCV 431, G1, RMI6 및 RMI9 균주의 선별은 기준 패널의 FCV 분리주에 관한 교차-혈청 중화 시험에 의해 행해졌다. 상기 기준 패널은 고양이 칼리시바이러스 감염 증세를 나타내며 세 곳의 별개의 지리학적 영역 출생인 고양이로부터 채취한 18개 FCV의 잘 알려진 분리주로 이루어진다. 7개의 분리주는 아메리카형으로서, RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 및 RMI9로 동정된다. 7개의 분리주는 프랑스형으로서, A2, F1, G1, G3, F3031, H3-2 및 H1-4로 지정된다. 나머지 4개의 분리주는 영국형으로서, 431, 388b, 337 및 J5로 지정된다.

상기 패널 균주 및 RMI6 및 RMI9 균주는 간단히 요청만 하면 본 출원인으로부터 입수할 수 있다.

그것들은 또한 "Archives of Virology"라는 표제의 논문(Poulet 외, Arch. Virol. 2000년 2월. 145(2). 243-261)에 게시되었으며, 이것은 편집자에게 제출하는 날짜에 인터넷 상에서 온라인으로 입수할 수 있다.

상기 기준 패널의 18개의 FCV 분리주들 사이의 교차-혈청 중화 시험을 진행하는 동안 놀랍게도 분리주 431에 대한 항혈청이 기준 패널의 17개 이종(異種) 분리주 중 14개[이종 혈청 중화 역가(titer)는 고려하지 않음]를 중화시키는 사실을 발견하였다. 비교에 의하면, 소위 "역사적인" 백신 균주 255 및 F9에 대한 항혈청은 18개 패널 중 단지 2개만을 각각 중화시킨다.

이와 같이 예상하지 않게, 본 출원인은 FCV 431 균주가 고양이과의 보호 및 특히 대부분의 FCV 균주에 대한 고양이의 보호에 이용될 수 있는 유력한 균주임을 발견하였다. 본 명세서에 제시된 FCV 균주의 패널 덕분에 당업자는 다른 유력한 FCV 균주를 선별할 수 있다. 동등한 목적으로, 본 발명은 또한 FCV 431 균주를 통해 그에 등가이고, 교차-중화의 범위가 넓은 항체를 갖는 FCV 균주를 포함한다.

FCV 균주에 대한 항혈청이 기준 패널의 18개 이종 분리주 중 적어도 13개를 혈청 중화할 경우, 바람직하게는 기준 패널의 18개 이종 분리주(즉, FCV 431을 포함함) 중 적어도 14개를 혈청 중화할 경우, 더욱 바람직하게는 기준 패널의 18개 이종 분리주 중 적어도 15개를 혈청 중화할 경우에 등가이다.

일반적으로, 이종 혈청 중화 역가가 1.2 log₁₀VN₅₀ 이상일 경우에 FCV 균주는 다른 FCV 균주를 혈청 중화하는 것으로 간주된다(Povey C. 및 Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11, 877-885). 본 출원인은 이 값을 실증성(positivity) 문턱값으로 삼았다. 그러나, 동종 혈청 중화 역가가 2 log₁₀VN₅₀ 이하인 FCV 분리주를 이용하여 얻어진 교차-혈청 중화의 결과는 해석되지 않는다.

FCV 431 균주에 대해 FCV 균주의 등가성(equivalence)을 입증하는 제2의 방법은 FCV 431 균주에 특이적인 단일 클론 항체를 사용하고 간접 면역형광법(indirect immunofluorescence: IIF)으로 후보 FCV 균주를 시험하는 것이다. 본 출원인은 이렇게 해서 431 균주에 대해 특이성이 입증된 여러 개의 단일 클론 항체를 제조하는 데 성공하였다. 그 중 하나를 44라 칭하였다. 예를 들어 단일 클론 항체 44와 같은 431에 대해 특이적인 단일 클론 항체와 함께 면역형광에 반응성이 있을 경우에 등가성이 있다. 이 단일 클론 항체 및 대응하는 하이브리도마는 간단히 신청하면 본 출원인으로부터 입수할 수 있고, 또한 그것들은 Arch. Virol. 2000. 145. 1-19에 게재된 Poulet 등에 의한 논문에 기재되어 있다. 상기 대응 하이브리도마는 또한 수탁번호 I-2282로 1999년 8월 11일자 CNCM에 기탁되었다. 그러나 당업자가 종래의 기술로 단일 클론 항체를 제조할 수 있으며 431 균주에 대해 특이적인 것들을 상기 패널에 상대적으로 선별할 수 있음은 물론이다.

따라서 본 발명의 제1 주제는 고양이 칼리시바이러스 균주 431로부터 제조한 면역원성 제제 및 백신으로서, 바람직하게는 불활성화 형태 또는 서브유닛 형태로, 수의학적으로 수용가능한 매개체(vehicle) 또는 부형제(excipient) 중에, 바람직하 게는 아주번트(adjuvant) 존재 하에 앞에서 정의한 상등체를 포함하는 것이다. 여기서 언급하는 면역원성 제제의 개념은 고양이에게 투여되면 고려 대상인 고양이 병원체에 대항하여 면역반응을 유발할 수 있는 모든 제제를 포함한다. 백신이란 유효한 방어를 유발할 수 있는 제제를 의미하는 것으로 이해해야 한다.

다른 FCV G1, RMI6 및 RMI9 균주는 FCV 431 균주에 대한 상보성을 위해 선택되었다. 즉, 431 및 이들 3종의 FCV 중 하나에 대한 항혈청의 조합체가 기준 패널의 분리주를 100% 혈청중화하며, 다시 말해서 이들 3종의 FCV 균주는 431 항혈청이 혈청중화하지 못하거나 약하게(1.2 log₁₀VN₅₀ 이하의 값으로) 혈청중화하는 기준 패널의 FCV 분리주에 관해서, 2 log₁₀VN₅₀ 이상의 동종 혈청 중화 역가 및 1.2 log₁₀VN₅₀ 이상의 이종 혈청 중화 역가를 갖는다. 본 발명은 또한 FCV 431 균주에 대해 동일한 상보성을 갖는 등가의 FCV 균주를 포함한다. 또한 이들 균주, 특히 G1에 대해 특이적인 단일 클론 항체를 제조하고 선별할 수 있고, 이로써 다른 기준으로 상등체를 결정할 수 있게 된다.

따라서 본 발명의 제2 주제는, 본 발명에 따른 FCV 431의 항혈청 또는 그 상층체 중 하나에 부가하여, 적어도 하나의 다른 FCV 균주, 특히 상보적 균주의 항체로서 특히 G1, RMI6, RMI9 및 그들의 등가물을 포함하는 군으로부터 선택되며, 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제, 선택적으로는 아주번트 중에 있는 항체를 포함하는 면역원성 제제 및 백신이다. 바람직하게는, 다른 FCV 균주(들)로부터 얻은 항체는 불활성화 바이러스 또는 서브유닛을 포함한다.

본 발명의 특징은 특히 면역원성 제제 또는 불활성화 또는 서브유닛 백신을 제조하기 위한 2종의 균주인 FCV 431 및 G1 균주의 조합체이다.

놀랍게도, FCV G1 및 431 균주의 조합체는 유리하게 상승 효과를 일으킨다. FCV G1 및 431 균주의 상보성에 관해 연구하는 과정에서, G1 단독으로, 431 단독으로 또는 두 가지(G1+431) 조합체에 의해 유발되는 면역반응을 비교하였다. 두 가지 FCV G1 및 431 균주의 조합체로 면역화시킨 동물군이 더 나은 임상적 방어의 이점을 나타냈다.

FCV 바이러스의 배양 및 증식은 고양이 세포에서 행하는 것이 바람직하고, 특히 감염 다중도(multiplicity of infection: moi)가 2 내지 0.01 CCID₅₀(cell culture infectious doses 50%)/세포, 바람직하게는 0.5 CCID₅₀/세포인 Crandell-Reese 고양이의 신장 세포(CRFK cell)(수탁번호 CCL-94로 ATCC로부터 입수가능)에서 행하는 것이 바람직하다.

수확하고 청징화한 후, 불활성화 면역원성 제제 또는 불활성화 백신을 제조하고자 하는 대상인 FCV 바이러스를 화학적 처리[예를 들면, 포르말린 또는 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸렌이민, 바이너리 에틸렌이민(BEI)] 및/또는 열처리한다. 본 발명에 따른 바이러스는 브로모에틸아민(BEA)을 사용하기 직전에 형성된 에틸아민을 작용시켜 불활성화하는 것이 바람직하다. 바이러스 입자는 종래의 농축 기술, 특히 한외여과(ultrafiltration)에 의해 농축한 후, 선택적으로 종래의 정제 수단, 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 존재 하의 겔 여과법 또는 선택적 침전법 에 의해 정제될 수 있다. 사전 농축과정 없이 정제를 행할 수도 있다.

면역원성 제제 또는 불활성화 또는 서브유닛 백신을 제조하기 위해서, 바이러스 입자를 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제 내에 장입할 수 있고, 선택적으로 아주번트로 보충할 수 있다. 항체의 양은 특히 단위 투여량당 약 10⁵ 내지 약 10¹⁰ CCID₅₀ , 바람직하게는 단위 투여량당 약 10⁸ 내지 약 10 ⁹ CCID₅₀의 예비활성화 역가와 같다.

본 발명에 따른 면역원성 제제 및 백신에 아주번트를 보충하기 위해서, 아주번트로서 (1) 수산화알루미늄, (1) 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 중합체 등을 사용할 수 있고, 면역원성 제제 또는 백신을 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼 형태, 특히 M. Powell의 편저인 "Vaccin Desing, The Subunit and Adjuvant Approach"(Plenum Press 1995) 147쪽에 기재된 에멀젼 SPT 및 동일 서적 183쪽에 기재된 에멀젼 MF59의 형태로 제형화할 수 있다.

상기 오일-인-워터 에멀젼은 특히 액체 파라핀 경유(유럽 약전 타입); 스쿠알란, 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 특히 식물유, 에틸올레에이트, 프로필렌 글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리(카프릴레이트/카프레이트), 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 알콜 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다. 에멀젼을 형성하기 위해 상기 오일은 유화제와 혼합하여 사용된다. 바람직한 유화제로서는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜의 에스테르, 및 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체, 특히 Pluronic^(R) 공중합체, 특히 L121 등이 있다.

아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐에테르로 가교결합되어 있다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 명칭으로 알려져 있다(Pharmeuropa vol. 8, No.2, 1996년 6월). 당업자는 또한 미국특허 US-A-2,909,462(본 명세서에 참고자료로 인용됨)를 참고할 수 있는데, 동 특허에는 최소한 3개, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록시기를 가지며, 그 중 적어도 3개의 하이드록시기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 가진 불포화 지방족 라디칼로 치환되어 있는 폴리하이드록시화 화합물로 가교결합되어 있는 아크릴계 중합체가 기재되어 있다. 바람직한 라디칼은 예를 들면 비닐, 알릴, 및 다른 에틸렌계 불포화기와 같이 2개 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것이다. 불포화 라디칼은 그 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. Carbopol^(R)(미국 오하이오주 소재 BF Goodrich사 제품)이란 상품명으로 판매되는 제품이 특히 적합하다. 상기 제품은 알릴 수크로오스 또는 알릴펜타에리스리톨과 가교결합되어 있다. 그 중에서 언급할 만한 것은 Carbopol^(R) 974P, 934P 및 971P이다.

말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 말레산 무수물과 에틸렌 의 공중합체로서 선형 또는 예를 들면 디비닐 에테르와 가교결합된 EMA^(R) 공중합체(Monsanto사)가 바람직하다. 참고자료로는 J. Fields 외, Nature, 186: 778-780, 1960년 6월 4일 간행본이 있다(본 명세서에 참고자료로 인용됨). 구조적 관점에서 볼 때, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 EMA^(R) 공중합체는 하기 식으로 표현되는 기본 단위로 형성되는 것이 바람직하다:

상기 식에서,

- R¹ 및 R²는, 동일하거나 상이할 수 있고, H 또는 CH₃를 의미하고,

- x = 0 또는 1, 바람직하게는 x = 1

- y = 1 또는 2이되, x + y = 2임.

EMA^(R) 공중합체에 있어서 x = 0이고 y = 2이며, 카보머에 있어서 x = y = 1이다.

최종 백신 조성물에서의 중합체 농도는 0.01% 내지 1.5% W/V, 보다 구체적으로는 0.05% 내지 1% W/V, 바람직하게는 0.1% 내지 0.4% W/V일 것이다.

물론, 불활성화 바이러스와 본 발명에 따른 동일한 FCV 균주의 서브유닛 및/또는 본 발명에 따른 다른 FCV 균주의 서브유닛을 조합할 수 있다.

본 발명의 특징은 또한, 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제 및 바람직하게는 아주번트, 특히 앞에서 설명한 것 중 하나에 들어있는 하나의 불활성화 고양이 칼리시바이러스 밸런시(valency), 적어도 FCV 431 균주 및 그 등가물을 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 다른 FCV 균주, 특히 본 발명에서 의미하는 범위 내에서 상보적이며 특히 G1, RMI6 및 RMI9 중에서 선택되는 균주, 다른 하나의 고양이 병원체에 대한 적어도 1 밸런시를 포함하는 다가 백신이다. 마찬가지로 서브유닛을 기본으로 한 다가 백신도 제조할 수 있다.

상기 고양이 병원체는 특히 고양이 비기관염 바이러스(feline rhinotrachitis virus) 또는 고양이 헤르페스바이러스(feline herpesvirus: FHV), 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus: FeLV), 고양이 범백혈구감소증 바이러스(feline panleukopenia virus) 또는 고양이 파르보바이러스(feline parvovirus: FPV), 고양이 감염성 복막염 바이러스(feline infectious peritonitis virus: FIPV), 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 광견병 바이러스(rabies virus), 및 Chlamydia로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 FCV 백신은 사용 직전에 약독화된 생 백신, 불활성화 백신, 서브유닛 백신, 재조합 백신 또는 폴리뉴클레오티드 백신의 형태일 수 있는 다른 고양이 밸런시(feline valency)와 혼합될 수 있다.

따라서 본 발명의 특징은 또한, 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제 내에 바람직하게는 아주번트와 함께 들어 있는, 별도로 포장된 본 발명에 따른 FCV가 및 적어도 다른 하나의 고양이 병원체의 밸런시를 포함하는 다가 백신 키트 또는 박스이다. FCV 밸런시는 다른 고양이 밸런시용, 특히 약독화되고, 재조합 또는 냉동건조 형태로 제공되는 폴리뉴클레오티드 밸런시용 용제로서 작용할 수 있다.

본 발명의 특징에 따라, 선택적으로 추출 전 또는 추출 후에 불활성화하면서 바이러스로부터 캡시드를 추출함으로써 면역원성 제제 또는 서브유닛 백신을 제조할 수 있다. 따라서, 이러한 제제 및 백신은 유일한 활성 성분 또는 그 외의 것으로서, 주로 캡시드 단백질 및 선택적으로 아단편(subfragment)을 함유하는 추출 산물, 선택적으로 불활성화되고, 본 발명에 따른 균주, 특히 그 등가물을 포함하는 균주 431로부터 제조되고, 선택적으로 다른 FCV 균주, 특히 G1 또는 등가물로부터 제조된 추출 산물을 포함한다. 이들 서브유닛 백신 및 제제는 예를 들면 앞에서 설명한 바와 같은 아주번트로 보충하는 것이 유리하다. 또한 전체의 불활성화 백신 또는 제제 및 서브유닛 백신이나 제제를 혼합할 수도 있다.

본 발명의 특징은 또한 G1 균주, 특히 불활성화된 것 또는 추출의 서브유닛을 기본으로 한 면역원성 제제 또는 백신이다.

본 발명의 특징은 또한 고양이 칼리시바이러스에 의해 유발되는 질병에 대항하는 고양이의 면역 방법이다.

이 면역화 방법은 본 발명에 따른 조합된 다가 백신, 서브유닛 백신 또는 불활성화 FCV 백신을 고양이에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 백신의 투여는 특히 비경구 경로로, 바람직하게는 피하 또는 근육내 경로로 행해질 수 있다.

당업자는 주사 회수 및 각각의 백신 접종 프로토콜에 사용할 백신의 투여량 을 정밀하게 규정할 수 있다.

투여 용량은 특히 0.2 내지 2ml, 바람직하게는 대략 1ml일 수 있다.

이하에서 비제한적인 실시예로서 주어진 구현예의 도움 하에 교차-혈청 중화 역가를 나타내는 표인 유일한 도면을 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1: 바이러스 분리주 및 하이브리도마

고양이 칼리시바이러스 감염 증상을 나타내는 고양이로부터 채취한 인두 면봉을 통해 고양이 칼리시바이러스(FCV)를 획득하였다.

FCV 431, 337, J5, 388b, 220 및 393 균주는 영국에서 분리되었고 영국의 글라스고 대학의 O. Jarrett 교수로부터 제공 받았다.

FCV A2, G1, G3, F3031, F1, H3-2 및 H1-4 균주는 본 출원인에 의해 프랑스에서 분리되었다.

FCV RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 및 RMI9 균주는 본 출원인에 의해 미국에서 분리되었다.

상기 인두 표본을 2ml의 Dulbecco's modified Eagle's minimum medium(DMEM, Gibco BRL)에 수집하고, 5% 태아 소 혈청(Bayer Diagnostic) 및 항생제, 특히 겐타마이신 50mg/L를 보충하였다. 시험하기 위해 대기하는 동안 각 분리주를 -70℃로 냉동하였다. 431 2 0 17 E9 T로 동정된 하이브리도마로부터 얻은 단일 클론 항체 44는 FCV 431 균주에 대해 특이적이다.

실시예 2: 바이러스 분리주의 증폭

고양이 신장선의 세포(Crandell-Reese Feline Kidney or CRFK No. ATCC CCL-94, Crandell 외, In Vitro 1973. 9. 176-185)를 5% 태아 소 혈청을 보충한 DMEM 배지를 사용하여 96-웰 플레이트 또는 25-㎠ Falcon(Falcon사)에서 ml당 100,000개의 세포를 담아 배양한다. 상기 세포를 CO₂ 5% 함유하는 대기 중 37℃에서 배양한다. 3일 후, 세포층은 융합상태(confluence)에 도달한다. 이 때 배지를 겐타마이신 50mg/L 보충한 무혈청 DMEM 배지로 교체하고, FCV 바이러스 분리주(실시예 1)의 융해된 일정 부분을 FCV 바이러스의 제한 희석 클로닝을 위해 웰당 4배 연속 희석액을 100㎕용량의 비율로 또는 Falcon당 1ml의 비율로 첨가하였다.

세포병변 효과(ECP)가 완결되면(배양 시작 후 24∼28시간), 바이러스 현탁액을 수확하고 -70℃에서 냉동시킨다. 일반적으로 바이러스 배치(batch)를 제조하는 데에는 3회 내지 4회의 연속적인 통과가 필요하다. 바이러스 배치는 -70℃에 저장된다.

실시예 3: 혈청의 제조

FCV 바이러스 각각에 대해, 해당 FCV 바이러스 10^6.0 CCID₅₀을 새끼 고양이에게 구비(oronasal) 경로로 접종하여 제조하였다. 특정 병원체가 없는(SPF) 새끼 고양이는 생후 10주 내지 14주된 것이었다. 상기 감염 후 1개월 되었을 때 각 동물의 혈청을 수집하였다. 혈청을 가열 불활성화(56℃에서 30분)하고, 분배하고, 분취하여 -20℃에 저장하였다.

실시예 4: 시험관내 교차-혈청 중화

고양이 칼리시바이러스증의 징후를 나타내는 고양이에 대해 인두 면봉에 의해 얻어진 18개의 필드 분리주들 사이에 교차-혈청 중화 시험을 행했다. 그 중 7개는 프랑스를 지리적 기원으로 하는 것으로서, A2, F3031, G1, G3, F1, H3-2 및 H1-4로 동정된 분리주이다. 4개는 영국을 지리적 기원으로 하는 것으로, J5, 337, 388b 및 431로 동정된 분리주이다. 마지막으로 7개는 미국을 지리적 기원으로 하는 것으로, RMI1, RMI2, RMI3 RMI5, RMI6, RMI7 및 RMI9로 동정된 분리주이다.

각각의 분리주에 관하여 얻어진 혈청(실시예 3)을 그것이 가진 18개의 분리주를 중화하는 능력에 관하여 시험하였다. 혈청은 96-웰 세포 배양 플레이트에서 DMEM 배지를 사용하여 3회 연속적으로 희석하였다. 선택된 바이러스 균주를 약 100 CCID₅₀ 함유하는 배지 0.05ml를 실시예 2에서와 같이 제조된 희석 혈청 0.05ml에 첨가하였다. 이 혼합물을 5% CO₂를 함유하는 분위기 하의 배양기 내에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.

다음에 ml당 약 100,000개의 세포를 함유하는 CRFK 세포의 현탁액 0.15ml를 각각의 혼합물에 첨가하였다. 5% CO₂를 함유하는 분위기 하에 37℃에서 4일간 배양한 후 위상 대조 현미경으로 세포병변 효과를 관찰하였다. 각 혈청의 중화 역가를 Kaerber법에 따라 계산하였다. 그 역가는 웰의 50%에 대해 세포병변 효과를 억제하는 최대 희석의 형태로 주어지고, 상용대수(log₁₀)로 표현된다. 이렇게 해서 확인된 최소 역가는 0.7log₁₀ VN₅₀이었다. 각 혈청을 최소한 2회, 바람직하게는 3회 적정하였다.

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실시예 5: 간접 면역형광(IIF) 시험

시험하고자 하는 FCV 바이러스에 감염시킨 단일층으로 배양된 CRFK 세포를 함유하는 96-웰 플레이트에서 IIF 시험을 행한다.

5% 태아 소 혈청을 함유하는 F15 배지(Gibco BRL, Cat # 045-1075) 중에 ml당 90,000개의 세포를 함유하는 CRFK 세포의 현탁액을 웰당 200㎕의 용량으로 96-웰 플레이트에서 배양한다. 융합상태에서, 320 CCID₅₀의 FCV를 F15 배지 100㎕에 접종한다. 첫번째 CPE 초점이 나타나면 세포를 칼슘 또는 마그네슘이 없는 냉각된 PBS(PBS, Sigma사)로 세정한 다음, 5% v/v 물을 함유하는 냉각된 아세톤으로 -20℃에서 30분간 고정한다. 건조 후, 감염되고 고정된 세포를 pH 7.6인 50mM TRIS-HCl 완충액 중에 약 1/5000으로 희석한 항-FCV 431 단일 클론 항체 44(하이브리도마 431 2 0 17 E9 T)에 해당하는 웰당 100㎕의 복수(ascitic fluid)에 37℃에서 30분간 접촉시킨다.

PBS 중에서 2회 세정한 후, 플루오레스세인 이소티아네이트(Biosys, 2mg/ml로 접합된 FITC)와 접합되고 pH 7.6의 50mM TRIS-HCl 완충액 중에 1/150으로 희석된 염소 항-마우스 IgG 항체를 동일한 조건 하에 배양하여 항체의 부착을 가시화한다. 판독은 UV광 조사 하에 광학 현미경으로 이루어진다.

이 단일 클론 항체를 패널의 분리주 각각에 관해 시험한다. 그것은 FCV 431로 감염된 CRFK 세포에만 부착된다.

이 시험은 FCV 431 균주의 등가물을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이들 등가물은 단일 클론 항체 44가 부착하는 것이다.

실시예 6: 상승 효과

생후 9개월되고 백신접종하지 않은 SPF 새끼 고양이 32마리를 무작위로 각각 8마리씩 4군(A 내지 D로 식별함)으로 나누고, 각 군을 별도의 상자에 넣는다. 바이러스 현탁액을 해동시키고(실시예 2) 원하는 역가를 얻기 위해 PBS 중에 희석한 후, B군에 대해서는 1ml의 FCV G1 접종물을 10^3.3 CCID₅₀/ml의 비율로, C군에 대해서는 1ml의 FCV 431 접종물을 10^3.5 CCID₅₀/ml의 비율로, D군에 대해서는(상이한 주사 위치에) 0.5ml의 FCV G1 접종물을 10^3.3 CCID₅₀/ml 및 0.5ml의 FCV 431 접종물을 10^3.5 CCID₅₀/ml의 비율로 피하 주사하여 백신 접종한다. A군은 대조군으로 삼는다.

A군 내지 D군 각각의 절반을 두 개의 군 즉 1군과 2군으로 무작위 분배하고 별도의 상자에 넣었다. 백신 접종 후 31일째(d31)에 상기 동물들에 항원투여(challenge)한다.

1군의 동물들에 대한 항원투여는 역가가 10^7.2 CCID₅₀/ml인 공격용 바이러스 균주 FCV 220 1ml를 구비 경로(입을 통해 0.5ml, 각각의 콧구명을 통해 0.25ml씩)로 투여함으로써 행한다.

2군의 동물들에 대한 항원투여는 역가가 10^6.8 CCID₅₀/ml인 항원투여 바이러스 균주 FCV 393 1ml를 구비 경로(입을 통해 0.5ml, 각각의 콧구명을 통해 0.25ml씩)로 투여함으로써 행한다.

바이러스성 균주 FCV 220 및 393을 선택한 이유는 그것들이 교차-혈청 중화에 있어서 바이러스 균주 FCV G1 및 431로부터 이격되어 있기 때문이다.

상기 두 상자 사이의 일체의 교차 오염을 주의깊게 방지한다. 두 군의 동물들에 대한 임상적 감시는 직장 온도 및 동물들에 대한 임상 시험(일반적 상태, 혀와 입천장의 궤양의 유무, 결막염의 유무, 절름발이 유무, 동물의 사망 등)을 행함으로써 이루어진다.

각 동물에 대한 종합적 임상 점수는 각 군에 대해 얻어진 하기 등급에 따른 임상적 징후의 점수를 합하여 계산되었다:

- 직장 온도:

0 - 39℃ 미만

1 - 39℃ 이상, 39.5℃ 미만

2 - 39.5℃ 이상, 40℃ 미만

3 - 40℃ 이상

- 일반적 상태:

0 - 정상적 행태

1 - 탈진

- 혀 및 입천장의 궤상(여러 개가 있을 경우, 모든 궤양 중 몇개의 직경):

0 - 궤양이 없음

1 - 직경 1 내지 5mm

2 - 직경 6 내지 10mm

3 - 직경 10mm 초과

- 치은염:

0 - 치은염 없음

1 - 치은염 있음

- 비염:

0 - 비염 없음

1 - 심한 코 분비를 수반한 비염

2 - 점액 내지 점액농성 코 분비를 수반한 비염

- 결막염:

0 - 결막염 없음

1 - 심한 분비를 수반한 결막염

2 - 점액농성 분비를 수반한 결막염

- 절름발이:

0 - 절름발이 없음

1 - 절름발이

- 사망

0 - 생존

1 - 사망

얻어진 평균 임상 점수는 하기와 같다:

군/항원투여	FCV 220	FCV 393
대조 (A군)	31	30
FCV G1 (B군)	5	23
FCV 431 (C군)	6	18
FCV G1 + FCV 431 (D군)	2	9

이렇게 얻어진 결과는 최량의 균주에 관해 얻어진 평균 값과 두 가지 균주의 조합에 관해 얻어진 평균 값 사이의 현저한 차이를 나타냄으로써 FCV G1 및 FCV 431 균주 사이의 상승 효과를 나타낸다(Kruskal-Wallis 테스트).

실시예 7: 불활성화 백신의 제조

2리터 용량의 롤러 플라스크에서 락트알부민 가수분해물(Gibco BRL) 2.5% 및 태아 소 혈청(Gibco BRL) 5%를 보충한 변성 이글스(Eagle's) 배지(MEM, Gibco BRL) 중에서 37℃에서 CRFK 세포를 배양한다. ml당 약 100,000개의 세포를 함유하는 MEM 배지 중의 세포 현탁액 300ml를 각각의 롤러 플라스크에 첨가한다. 3일 후, 세포층은 융합상태가 된다. 이어서 세포 배지를 무혈청 MEM 배지로 교체하고 세포당 0.5 CCID₅₀의 감염 다중도로 FCV 바이러스를 첨가한다. 세포층 전체에서 세포변성 효과가 얻어질 때까지 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 상기 바이러스 배양을 유지시킨다. 바이러스 현탁액을 수확한 후, 공극률이 1.5㎛인 백필터(bag filter)로 청징화한다. 수확 시의 FCV 바이러스 역가는 8.5±0.3 log₁₀ CCID₅₀/ml이다.

상기 바이러스를 22℃에서 18시간 동안 농도가 약 8mM인 에틸렌이민으로 불활성화시킨다.

상기 에틸렌이민은 사용 직전에, 증류수 200ml에 수산화나트륨 펠렛 28g을 용해하고 약 1.2M 용액에 대응하는 브로모에틸아민(BEA) 68.1g을 첨가하여 제조한다(H. bahnemann, Arch. Virol., 1975, 47, 47-56). 불활성화 바이러스 현탁액은 컷오프가 100kDa인 Ultrasette-형 한외여과 카트리지(Filtron)로 100배 농축한 후 -70℃에서 냉동시킨다.

해동 후 불활성화 바이러스 현탁액을 PBS 완충용액(NaCl 8g/l; KCl 0.2g/l; KH₂PO₄ 0.2g/l; Na₂HPO₄, 2H₂O 1.44g/l) 중에 1/33로 희석한다. 동일한 방법으로 백신을 제조한다: 불활성화 바이러스의 희석액으로 이루어지는 수상 167ml를 올레산 무수 만니톨 7% w/v, 에틸렌 옥사이드(EO) 분자를 평균 11개 함유하는 에톡시화 올레산 8% w/v, 및 액체 파라핀 경유(유럽약전 타입) 85% w/v를 함유하는 오일상 83ml 중에서 Silverson turbine 유화제를 이용하여 32℃에서 2분간 유화시킨다. 이어서 백신을 5℃에 보관한다.

백신을 제조하는 다른 방법은 600bar의 압력과 30∼40℃의 온도에서 스쿠알란 5% w/v, Pluronic^(R) L121 2.5% w/v, Tween 80 0.2% w/v, 및 해동 후 PBS 완충용액으로 1/46로 희석한 불활성화 바이러스 현탁액 92.3% v/v의 혼합물을 모델 Y110 고압 호모지나이저(Microfluidics Corp.)로 3회 통과시킴으로써 에멀젼으로 형성하는 방법이다. 이후 백신은 5℃에 보관한다.

또 다른 방법은 생리 식염수(NaCl 9g/l) 중에 Carbopol^(R) 974P를 0.4% w/v 함유하는 용액을 제조하는 방법이다. pH는 수산화나트륨으로 7.3∼7.4로 조정된다. 이어서, 이 Carbopol 용액을 해동 후 1/25로 희석한 불활성화 FCV 바이러스 현탁액과 동일 부(parts)로 혼합한다. 이어서 백신은 5℃에 보관한다.

에멀젼의 수상 또는 Carbopol^(R)과 혼합한 수상은 FCV 431 균주 또는 FCV G1 균주 중 어느 하나에 상응하는 농축된 불활성화 바이러스 현탁액, 또는 동일 부의 FCV 431 및 G1 균주의 혼합물의 PBS 희석액으로 이루어진다.

실시예 8: 불활성화 FCV 431의 면역원성의 조절

생후 약 9주일된 백신 접종하지 않은 SPF 새끼 고양이 19마리를 무작위로 12마리의 제1군과 7마리의 제2군으로 나누고, 각 군을 별도의 상자에 넣었다.

실시예 7에서 설명한 바와 같은 무수 만니톨 올레에이트, 에톡시화 올레산 및 액체 파라핀 경유로 이루어진 아주번트를 구비한 백신을 제조한다.

고양이들에게 A군에 대해서는 FCV 431 접종물 1ml를 10⁷ CCID₅₀/ml로 피하 주사로 2회(D0 및 D28) 접종한다. B군은 대조군으로 삼는다.

상기 동물들은 1차 백신 접종 후 42일째(D42)에 10⁶ CCID₅₀/ml의 역가를 가진 FCV 431 공격용 바이러스 균주 1ml를 구비 경로를 통해(입을 통해 0.5ml, 각각의 콧구명을 통해 0.25ml씩) 투여함으로써 항원투여시킨다.

항체를 중화시키는 항-FCV 431의 레벨 및 임상적 점수를 모니터하였다. 각 동물에 대한 종합적 임상 점수는 실시예 6에 제시된 등급에 따른 임상적 징후의 점수를 합하여 계산되었다.

얻어진 결과는 다음과 같다:

log₁₀VN₅₀/ml로 표현한 항-FCV 431 중화 항체 역가:

군	D0 시의 항체	D28 시의 항체	D42 시의 항체
FCV 431 백신 (A군)	0.24	1.61	2.87
대조군 (B군)	0.24	0.24	0.24

D42 내지 D56 기간에 걸친 평균 임상 점수:

군	임상 점수
FCV 431 백신 (A군)	0.7
대조군 (B군)	33.7

이들 결과는 동종의 항원투여에 대한 탁월한 임상적 방어 및 양호한 혈청 병변을 나타낸다.

첨부된 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명은 이상과 같은 설명에 제시된 특정 구현예로 한정되지 않으며, 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않는 변형들을 포함하는 것임을 명확히 이해해야 할 것이다.

Claims

수탁번호 CNCM I-2166으로 CNCM에 기탁된 균주 431의 FCV 바이러스로부터 제조되고, 수의학적으로 수용가능한 매개체(vehicle) 또는 부형제(excipient)를 포함하는, 고양이 칼리시바이러스증(feline calicivirosis)에 대한 면역원성 제제.
삭제
삭제
제1항에 있어서,

다른 FCV 균주로부터 얻어지는 불활성화 FCV 바이러스 또는 서브유닛을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제4항에 있어서,

상기 다른 FCV 균주가 수탁번호 CNCM I-2167로 CNCM에 기탁된 균주 G1인 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서,

다른 고양이 병원체에 대한 하나 이상의 밸런시(valency)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제6항에 있어서,

상기 다른 고양이 병원체가 고양이 헤르페스바이러스(feline herpesviruses: FHV), 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus: FeLV), 고양이 범백혈구감소증 바이러스(feline panleucopenia virus: FPV), 고양이 감염성 복막염 바이러스(feline infectious peritonitis virus: FIPV), 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 광견병 바이러스(rabies virus), 및 클라미디아(Chlamydia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서,

아주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제8항에 있어서,

상기 아주번트가 수산화알루미늄인 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제8항에 있어서,

상기 아주번트가 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 또는 말레산 무수물의 중합체 및 알케닐 유도체의 중합체인 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서,

상기 면역원성 제제가 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼인 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서,

캡시드 단백질 추출물을 기본으로 한 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제1항에 기재된 FCV 균주로부터 얻어지는 캡시드 단백질 추출물을 기본으로 하고, 수의학적으로 수용가능한 매개체(vehicle) 또는 부형제(excipient)를 포함하는, 고양이 칼리시바이러스증(feline calicivirosis)에 대한 면역원성 제제.
제1항에 따른 면역원성 제제 및 다른 고양이 병원체 중 하나 이상의 밸런시를 별도 포장된 상태로 포함하는 다가(multivalent) 백신 접종 키트.
제10항에 있어서,

상기 아주번트가 카보머(carbomer)인 것을 특징으로 하는 면역원성 제제.
제14항에 있어서,

상기 면역원성 제제는 아주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 백신 접종 키트.
제1항에 따른 면역원성 제제 및 다른 고양이 병원체 중 하나 이상의 밸런시를 별도 포장된 상태로 포함하는 다가(multivalent) 백신 접종 박스.
제17항에 있어서,

상기 면역원성 제제는 아주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 백신 접종 박스.
수탁번호 CNCM I-2166으로 CNCM에 기탁된 균주 431의 FCV 바이러스로부터 제조되고, 수의학적으로 수용가능한 매개체(vehicle) 또는 부형제(excipient)를 포함하는, 고양이 칼리시바이러스증(feline calicivirosis)에 대한 불활성화 또는 서브유닛(subunit) 백신.
제19항에 있어서,

다른 FCV 균주로부터 얻어지는 불활성화 FCV 바이러스 또는 서브유닛을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제20항에 있어서,

상기 다른 FCV 균주가 수탁번호 CNCM I-2167로 CNCM에 기탁된 균주 G1인 것을 특징으로 하는 백신.
제19항에 있어서,

다른 고양이 병원체에 대한 하나 이상의 밸런시(valency)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제22항에 있어서,

상기 다른 고양이 병원체가 고양이 헤르페스바이러스(feline herpesviruses: FHV), 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus: FeLV), 고양이 범백혈구감소증 바이러스(feline panleucopenia virus: FPV), 고양이 감염성 복막염 바이러스(feline infectious peritonitis virus: FIPV), 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 광견병 바이러스(rabies virus), 및 클라미디아(Chlamydia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제19항에 있어서,

아주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제24항에 있어서,

상기 아주번트가 수산화알루미늄인 것을 특징으로 하는 백신.
제24항에 있어서,

상기 아주번트가 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 또는 말레산 무수물의 중합체 및 알케닐 유도체의 중합체인 것을 특징으로 하는 백신.
제19항에 있어서,

상기 백신이 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼인 것을 특징으로 하는 백신.
제19항에 있어서,

캡시드 단백질 추출물을 기본으로 한 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제19항에 기재된 FCV 균주로부터 얻어지는 캡시드 단백질 추출물을 기본으로 하고, 수의학적으로 수용가능한 매개체(vehicle) 또는 부형제(excipient)를 포함하는, 고양이 칼리시바이러스증(feline calicivirosis)에 대한 백신.
제19항에 따른 백신 및 다른 고양이 병원체 중 하나 이상의 밸런시를 별도 포장된 상태로 포함하는 다가(multivalent) 백신 접종 키트.
제26항에 있어서,

상기 아주번트가 카보머(carbomer)인 것을 특징으로 하는 백신.
제30항에 있어서,

상기 백신은 아주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 백신 접종 키트.
제19항에 따른 백신 및 다른 고양이 병원체 중 하나 이상의 밸런시를 별도 포장된 상태로 포함하는 다가(multivalent) 백신 접종 박스.
제33항에 있어서,

상기 백신은 아주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 백신 접종 박스.