KR20150100920A

KR20150100920A - 마이코플라스마 백신의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150100920A
Application number: KR1020157020447A
Authority: KR
Inventors: 다이애나 엠. 머피 조단; 브라이언 토마스 마르틴손; 크리스틴 마가렛 뮐렌탈러; 악셀 노이바이어; 아룬 브이. 아이어
Original assignee: 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-09-02
Also published as: CA2896298A1; MX361273B; KR102153275B1; ES2738100T3; EP2938747B1; BR112015012711A2; TWI660736B; US10512680B2; PL2938747T3; JP6449364B2; MX2015007730A; PT2938747T; US20160136254A1; BR112015012711B1; EA201500701A1; US9273281B2; US20140186394A1; PH12015501333A1; HUE045015T2; AU2013370983B2

Abstract

본 발명은, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은, 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 면역원성 조성물, 및 대상체에게 상기 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는 대상체의 면역화 방법에 관한 것이다.

Description

마이코플라스마 백신의 제조 방법{METHOD OF MAKING A MYCOPLASMA VACCINE}

마이코플라스마 속(Mycoplasma genus)의 세균은 몰리쿠테스(Mollicutes) 부류에 속하며, 피르미쿠테스(Firmicutes) 계통으로부터 유도되는 유기체의 그룹을 나타낸다. 몰리쿠테스는 가장 작은 자율 복제 유기체이며, 이들은 세포벽이 없다는 점에서 다른 진정세균과는 구조적으로 상이하다. 이들의 단일 막의 표면은, 복잡한 면역적격 숙주와 관련하여 적응과 생존을 매개함에 있어서의 중요한 접점인 것으로 고려된다. 또한, 몰리쿠테스는 작은 게놈 및 제한된 수의 대사 경로를 갖는다. 따라서, 마이코플라스마 속의 구성원들은 "최소의 자기-복제 유기체(minimal self-replicating organism)"로서도 나타낸다. 그러나, 이러한 겉보기의 단순성에도 불구하고, 마이코플라스마 세균의 대다수는 사람 및 광범위한 동물의 병원체이다. 병독성이 주로 독소, 인바신(invasin) 및 세포용해소(cytolysin)에 의해 결정되는 다른 병원성 세균과는 대조적으로, 병원성 마이코플라스마 세균은 이러한 전형적인 일차 병독성 인자들을 갖지 않는 것으로 밝혀진다[Chambaud , I. et al, 2001, Nucleic Acids Res. 29: 2145-2153, Fraser et al, 1995, Science 270: 397-403]. 병원성 마이코플라스마가 숙주 세포 손상, 염증 및 질환을 야기하도록 하는 분자 메커니즘 및 이펙터(effector)에 대한 입수가능한 지식은 현재 거의 존재하지 않는다.

병원성 마이코플라스마 세균은 주로 사람 및 동물에서의 비정형성 폐렴, 비뇨생식기 감염 및 관절염을 야기한다[참조: Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.; Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605]. 징후의 재활성화 또는 악화가 반복되어 만성 질환으로 서서히 바뀌고, 따라서, 조기 진단과 함께, 악화 또는 재활성화의 조기 치료, 예방 또는 치료가 중요한 것으로 공지되어 있다. 엠. 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)는 국지유행성(enzootic) 폐렴의 병인학적 작용제(aetiological agent)이다. 돼지에서 이는 감소된 체중 증가 및 불량한 사료 효율로 인해 가장 흔하고 경제적으로 중요한 질환 중 하나이다. 상기 질환은, 수주 동안 지속되는 폐내 병변, 만성 기침, 윤기 없는 피모 상태(dull hair coat), 지연된 성장 및 수척한 외형(unthrifty appearance)을 야기한다. 폐 병변, 특히, 복부의 첨엽 및 심엽(ventral apical and cardiac lobe)에서의 폐 병변은 상피 세포의 과형성 및 단핵 세포의 혈관주위 축적 증가 및 세기관지주위 축적 증가를 특징으로 한다. 돼지의 호흡기관의 다른 통상적인 마이코플라스마인 엠. 하이오리니스(M. hyorhinis)는 새끼 돼지에서의 다발장막염 및 관절염을 야기할 수 있다. 엠. 하이오시노비애(M. hyosynoviae)는 일반적으로 편도선 내에 위치하며, 관절염성 질환을 야기하여 경제적 손실을 초래할 수 있다. 엠. 하이오 시노비애는 관절 및 인두/편도 샘플로부터 단리되며, 혈액 및 관절액에서 항체를 유도할 수 있다. 엠. 보비스(M. bovis)는 병원성이 더 높은 마이코플라스마 세균 중 하나인 것으로 고려되며, 전세계적으로 유의한 경제적 손실을 야기한다. 마이코플라스마 세균은 모든 연령의 소에서 심각한 임상 징후를 야기한다. 엠. 보비스는 소에서의 폐렴, 유방염 및 관절염을 야기하는 것으로 밝혀진 가장 빈번한 마이코플라스마 병원체이고, 이의 병인적 역할은 암소 및 황소에서의 이염, 각결막염, 활액막염 및 생식 장애와도 관련되어 왔다.

마이코플라스마는 세포벽이 없기 때문에, 이들은, 세포벽 합성을 표적으로 하는 페니실린 또는 다른 베타-락탐 항생제와 같은 다수의 통상적인 항생제에 의한 영향을 받지 않는다. 실제 사용 중인 마이코플라스마 감염을 위한 치료학적 제제는 마크롤라이드 기반 항생제, 또는 신규한 퀴놀론 기반 항생제, 또는 테트라사이클린 기반 항생제와 같은 몇몇 항생제이지만, 이러한 항생제는 약물-내성 균주의 출현과 같은 큰 역 효과(adverse effect)들을 갖고, 이는, 마이코플라스마 감염이 심각해지게 하고, 한편, 충분한 치료 효과가 예상되지 않으며, 만성 질환으로 전이되는 원인이 된다. 또한, 백신접종은, 마이코플라스마 감염을 제어하는 효과적인 방법이다. 그러나, 백신의 제조에 필요한 마이코플라스마의 유의하게 높은 수율은 일반적으로 단지 복합 배지에서의 배양에 의해 수득된다[Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605; Gabridge M.G. et al. 1976, Cultivation of mycoplasma in a modified tissue culture medium, Applied and Environmental microbiology. 31, 986-989; Sotoodehnia A. Et al 2007, Preparation of agalactia vaccine in fermentor, Archieves of razi institute, 62, 45-48; Dahlia et al., 2009 Isolation of Mycoplasma hyosynoviae from penumonic lung of swine, Tropical Biomedicine 26:341-345]. 배양되는 마이코플라스마 세균에 따라, 복합 배지에는 10 내지 30% 혈청이, 그리고, 때때로 효모 추출물이 보충된다. 따라서, 혈청은 고가이기 때문에, 마이코플라스마 세균의 배양은 비용 집약적이다. 추가로, 동물 복지의 관점에서도 복합 배지 중의 혈청의 감소가 유리할 것이다. 따라서, 마이코플라스마 감염을 예방하는데 효과적인 면역원성 조성물의 제조를 위해, 혈청-감소된 배양 시스템에서의 마이코플라스마의 유의하게 높은 수율의 배양이 요구된다. 또한, 돼지 특이적 마이코플라스마 세균은, 일반적으로, 돼지 특이적 혈청을 함유하는 복합 배지에서 배양된다[참조: Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605]. 그러나, 돼지 특이적 혈청은 다른 돼지-특이적 병원체를 함유할 수 있거나 돼지 특이적 병원체에 대한 항체를 함유할 수 있고, 이는, 제조되는 면역원성 조성물의 면역원성의 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 마이코플라스마 감염을 예방하는데 효과적인 면역원성 조성물의 제조를 위해, 돼지 혈청 불포함 배양 시스템에서의 마이코플라스마의 유의하게 높은 수율의 배양도 요구된다.

본 발명의 설명

본 발명의 양상을 기술하기 전에, 본원에서 그리고 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수 형태들 "한", "하나" 및 "상기"는 본문에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들면, "한 또는 하나의 항원"에 대한 언급은 복수개의 항원을 포함하고, "세포"에 대한 언급은, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 하나 이상의 세포 및 이의 등가물에 대한 언급 등이다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 숙련가가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미들을 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들, 장치들 및 재료들이 아래에 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보들은, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보들에 보고된 바와 같은 세포주들, 벡터들 및 방법들을 기술하고 개시할 목적으로 인용에 의해 본원에 포함된다. 본원에서, 본 발명이 종래 발명으로 인해 이러한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

본 발명은 선행 기술에 내재하는 문제들을 해결하며, 최신 기술에서의 뚜렷한 진보 사항을 제공한다.

일반적으로, 본 발명은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.

유리하게, 본 발명에 의해 제공된 실험 데이터는, 마이코플라스마 세균이 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 내에서 생성될 수 있음을 개시한다.

용어 "면역원성 조성물"은, 상기 면역원성 조성물이 투여된 숙주에서 면역학적 반응을 도출하는 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물을 말한다. 이러한 면역학적 반응은, 본 발명의 면역원성 조성물에 대한 세포-매개된 및/또는 항체-매개된 면역 반응일 수 있다. 숙주는 "대상체"로서도 기술된다. 바람직하게, 본원에 기술되거나 언급된 모든 숙주 또는 대상체는 동물이다.

통상적으로, "면역학적 반응"으로는 다음의 효과들 중 하나 이상이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다: 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시되는, 항체, B 세포, 보조 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게, 숙주는 보호성 면역학적 반응 또는 치료학적 반응을 나타낼 것이다.

"보호성 면역학적 반응"은, 감염된 숙주에 의해 일반적으로 나타나는 임상 징후의 감소 또는 결여, 보다 빠른 회복 시간 및/또는 보다 짧은 감염 지속기간 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물에서의 더 낮은 병원체 역가(pathogen titer)에 의해 입증될 것이다.

숙주가 보호성 면역학적 반응을 나타내어, 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 경우, 상기 면역원성 조성물은 "백신"으로서 기술된다.

본원에서 사용된 "항원"은, 이러한 항원 또는 이의 면역학적 활성 구성성분을 포함하는 관심의 면역원성 조성물 또는 백신에 대해 숙주에서 면역학적 반응을 도출하는 구성성분들을 나타내지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항원 또는 면역학적 활성 구성성분은, 숙주에게 투여되었을 때 숙주에서 면역학적 반응을 도출할 수 있는 전체 미생물(불활성화되거나 변형된 살아있는 형태) 또는 이의 임의의 단편 또는 분획일 수 있다. 항원은 초기 형태의 완전한 살아있는 유기체일 수 있거나 이러한 유기체를 포함할 수 있고, 또는 항원은 소위 변형된 생 백신(MLV: modified live vaccine) 형태의 약독화된 유기체일 수 있거나 이러한 유기체를 포함할 수 있다. 항원은 상기 유기체의 적절한 요소(element)(아단위 백신)들을 추가로 포함할 수 있고, 이에 의해 이들 요소는, 전체 유기체 또는 이러한 유기체의 성장 배양물을 파괴시키고, 목적하는 구조물(들)을 수득하는 후속적 정제 단계들에 의해, 또는 적합한 시스템, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만 세균, 곤충, 포유동물 또는 다른 종의 적절한 조작에 의해 유도되는 합성 프로세스에 의해, 그리고, 임의로 후속적 단리 및 정제 절차에 의해, 또는 적합한 약제학적 조성물(폴리뉴클레오티드 백신접종)을 사용하여 유전 물질의 직접적 혼입에 의해 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 프로세스를 유도함으로써 생성된다. 항원은 소위 사 백신(KV: killed vaccine)으로 적절한 방법들에 의해 불활성화된 전체 유기체를 포함할 수 있다. 상기 유기체가 세균인 경우, 상기 사 백신은 박테린(bacterin)이라고 칭한다.

용어 "치료 및/또는 예방"은, 집단(herd)내 특정 마이코플라스마 감염 발병률의 저하 또는 특정 마이코플라스마 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임상 징후의 중증도의 감소를 말한다. 따라서, 용어 "치료 및/또는 예방"은, 또한, 본원에서 제공되는 면역원성 조성물의 유효량을 투여받은 동물의 그룹에서, 이러한 면역원성 조성물을 투여받지 않은 동물 그룹에 비해, 특정 마이코플라스마 세균에 감염된 집단내 동물의 수의 감소(= 특정 마이코플라스마 감염 발병률의 저하) 또는 일반적으로 마이코플라스마 감염과 관련되거나 이에 의해 야기되는 임상 징후의 중증도의 감소를 말한다.

"치료 및/또는 예방"은, 일반적으로, 상기 치료 및/또는 예방을 필요로 하거나 이러한 치료/예방으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체 또는 대상체들의 집단에게 본 발명의 면역원성 조성물의 유효량을 투여함을 포함한다. 용어 "치료"는, 상기 대상체 또는 상기 집단의 적어도 몇몇 동물이 이미 이러한 마이코플라스마에 감염되고, 여기서, 이러한 동물이, 이미 이러한 마이코플라스마 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 몇몇 임상 징후를 나타낼 때 상기 면역원성 조성물의 유효량을 투여함을 말한다. 용어 "예방"은, 대상체가 마이코플라스마에 감염되기 전에 상기 대상체에게 투여하거나, 적어도 이러한 동물이 또는 동물 그룹 내의 동물들이 이러한 마이코플라스마 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임의의 임상 징후를 나타내지 않을 때 투여함을 말한다.

본원에서 사용된 용어 "유효량"은 대상체에서 면역 반응을 도출하거나 도출할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 유효량은, 집단내 특정 마이코플라스마 감염의 발병률을 저하시키거나 특정 마이코플라스마 감염의 임상 징후의 중증도를 감소시킬 수 있다.

바람직하게, 임상 징후는, 치료되지 않았거나 본 발명 이전에 입수가능했던 면역원성 조성물로 치료되었지만 후속적으로 특정 마이코플라스마 세균에 의해 감염된 대상체에 비해, 발병률 또는 중증도에서 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 저하된다.

본원에서 사용된 용어 "임상 징후"는 대상체의 마이코플라스마 세균으로부터의 감염의 징후를 말한다. 감염의 임상 징후는, 선택된 병원체에 좌우된다. 이러한 임상 징후의 예로는 호흡 곤란, 다발장막염(예를 들면, 복막염, 늑막염, 심막염), 관절염(파행 및 관절 부종), 이염, 거친 피모 상태(roughened hair coat), 미열, 우울증, 식욕 감퇴, 및 균혈증이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 임상 징후로는, 살아있는 동물로부터 직접 관찰가능한 임상 징후도 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 살아있는 동물로부터 직접 관찰가능한 임상 징후의 예로는 콧물 및 눈물, 무기력, 기침, 천명, 두근거림(thumping), 고열, 체중 증가 또는 감소, 탈수, 설사, 관절 부종, 파행, 소모증(wasting), 창백한 피부, 수척(unthriftiness), 및 설사 등이 포함된다.

대상체에서의 특정 마이코플라스마 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 임상 징후의 발병률의 감소 또는 중증도의 감소는, 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물의 하나 이상의 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 실시예 2 및 실시예 3에 의해 입증된 바와 같이, 본원에서 제공되는 면역원성 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 단일 용량의 투여 후에 효과적인 것으로 증명되었다.

용어 "감염" 또는 "감염된"은 병원체, 즉, 엠. 하이오리니스 또는 엠. 하이오 리니스 및 엠. 하이오시노비애 또는 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오뉴모니애 및 엠. 하 이오시노비애에 의한 대상체의 감염을 말한다.

용어 "마이코플라스마"는 당해 분야의 숙련가에 의해 공지되어 있다. "마이코플라스마"는, 예를 들면, 문헌[참조: Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.; Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605]에 기술된 바와 같은 세균 속을 말한다. 세균은, 이들의 생화학적 및 미생물학적 성질 뿐만 아니라 이들의 형태학에 기초하여 분류될 수 있다. 이들 분류 기준은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 일반적으로, 마이코플라스마 감염은 본 설명의 별항에 기술된 임상 징후와 관련이 있다.

본원에서 사용된 용어 "마이코플라스마"는, 엠. 하이오리니스 또는 엠. 하이 오리니스 및 엠. 하이오시노비애 또는 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오뉴모니애 및 엠. 하이오시노비애를 말한다. 그러나, 용어 마이코플라스마는 엠. 보비스도 포함한다. 엠. 하이오리니스의 완전한 게놈 서열은, 예를 들면, 문헌[Liu, W. et al., J. Bacteriol. 2010, vol. 192 (21), 5844-45 doi: 10.1128/JB.00946-10. Epub 2010 Aug 27]에 의해 또는 문헌[Calcutt MJ. et al., 2012, J. Bacteriol. Vol. 194 (7), 1848 doi: 10.1128/JB.00033-12]에 의해 예시적으로 제공된다. 엠. 하이오시 노비애의 단리물은, 예시적으로 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection)에 수탁 번호 ATCC 25591 또는 ATCC 27095 하에 기탁되어 있다. 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 단리물은 예시적으로 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 ATCC 25095, ATCC 25617, 및 ATCC 25934 하에 기탁되어 있다. 마이코플라스마 하이오뉴모니애 J-균주의 게놈 DNA는 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 ATCC 25934D 하에 기탁되어 있다. 마이코플라스마 보비스의 단리물은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며, 몇몇 단리물들은 예시적으로 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 ATCC 25025, ATCC 25523, 및 ATCC 27368 하에 기탁되어 있다.

용어 "배양"은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 상기 용어는 유기체 외부의 배양물에서의 세포 증식에 관한 것이다. 특히, 용어 "배양"은 세포 시스템에서의 유기체 외부의 세포 증식에 관한 것이다.

용어 "세포 시스템"은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 특히, 용어 "세포 시스템"은 미생물, 예를 들면, 마이코플라스마 세균의 배양을 위한 시험관내 세포 배양 시스템이다. 이러한 세포 시스템은, 숙주 세포, 및 유기체 외부에서의 이러한 세포의 증식에 적합한 세포 배양 배지를 포함한다. 특히, 숙주 세포는 마이코플라스마 세균으로의 감염에 민감할 수 있거나 민감하지 않을 수 있다. 이러한 숙주 세포는, 불활성화된 형태의 또는 세포 단편으로서의 생 세포로서 존재할 수 있다. 바람직하게, 이러한 숙주 세포는 진핵생물 세포 시스템의 진핵생물 세포이다.

용어 "진핵생물 세포 시스템"은, 1차 진핵생물 세포 및 식물 또는 동물과 같은 다세포 유기체로부터 유도된 진핵생물 세포를 포함한다. 추가로, 진핵생물 세포 시스템은, 진핵생물 단일 세포 유기체(미생물이라고도 칭함), 예를 들면, 세균 또는 효모를 포함하는 진균을 포함한다. 그러나, 진핵생물 세포는 마이코플라스마 세균과는 상이한 것으로 이해된다. 본원에 기술된 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 진핵생물 숙주 세포로는 마딘-다비 개 신장 상피 세포(MDCK: Madin-Darby Canine Kidney Epithelial cell)(예를 들면, 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 ATCC CCL-34 또는 ATCC CRL-2285 하에 기탁된 마딘-다비 개 신장 상피 세포) 또는 맥코이 세포(McCoy cell)(예를 들면, 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 ATCC CRL-1696 하에 기탁됨)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 "세포 불포함 배양 시스템"은, 마이코플라스마 세균 외에는 어떠한 세포도 포함하지 않는 배양 시스템을 말한다.

용어 "혈청 감소된"은, 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양을 위해 첨가되는 혈청의 양이, 세포 불포함 배양 시스템에서의 동일한 종의 마이코플라스마 세균의 배양에 사용되는 혈청의 양에 비해 감소됨을 말한다. 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양을 위한 혈청의 양은, 세포 불포함 배양 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양을 위한 혈청의 양에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100% 감소한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 마이코플라스마 세균은, 가장 바람직하게는 임의의 혈청이 결여된 진핵생물 세포 시스템에서 배양된다는 것을 이해해야 한다.

진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양을 위한 혈청의 바람직한 양은 약 0 내지 10%(v/v), 더욱 바람직하게는 약 1 내지 9%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 8%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 7%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 6%(v/v), 가장 바람직하게는 약 2 내지 5%(v/v)의 혈청 농도를 포함한다.

MDCK 세포를 포함하는 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양을 위한 혈청의 바람직한 양은 약 0 내지 6%(v/v), 더욱 바람직하게는 약 1 내지 5%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 2 내지 4%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 2 내지 3%(v/v), 가장 바람직하게는 약 2%(v/v)의 혈청 농도를 포함한다.

맥코이 세포를 포함하는 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양을 위한 혈청의 바람직한 양은 약 0 내지 10%(v/v), 더욱 바람직하게는 약 1 내지 9%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 2 내지 8%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 3 내지 7%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 4 내지 6%(v/v), 가장 바람직하게는 약 5%(v/v)의 혈청 농도를 포함한다.

본 발명의 한 양상에 따르면, 진핵생물 세포 시스템의 진핵생물 세포는 마이코플라스마 세균으로 감염되어야 함을 이해해야 한다. 마이코플라스마 세균에 의한 진핵생물 세포의 감염 및 후 항온배양(post incubation) 기간의 조건은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 그러나, 바람직하게는, 형질감염 후 세포를 21일 이하, 더욱 바람직하게는 약 2일 내지 약 14일, 더욱 바람직하게는 약 2일 내지 약 8일, 더욱 더 바람직하게는 약 3일 내지 5일의 기간에 걸쳐 항온배양한다. 바람직한 항온배양 조건은 약 32 내지 42℃, 더욱 바람직하게는 약 34 내지 40℃, 더욱 더 바람직하게는 약 35 내지 39℃, 더욱 더 바람직하게는 약 36 내지 38℃, 가장 바람직하게는 약 37℃의 온도를 포함한다. 바람직한 항온배양 조건은, 또한, 약 2% 내지 8%, 더욱 바람직하게는 약 3% 내지 7%, 더욱 더 바람직하게는 약 4% 내지 6%, 가장 바람직하게는 약 5%의 CO₂-농도를 포함한다. 바람직하게는, 형질감염 후에 특성 변화, 예를 들면, 세포 밀도 동향, 후-감염 기간 동안의 세포병변 효과를 포함하는 생존력 감소 및 pH-변화로 인한 배지의 색 변화에 대해 진핵생물 세포를 관찰한다.

용어 "수득하는"은 항원의 수거, 단리, 정제 및/또는 제형화(예를 들면, 피니싱, 불활성화 및/또는 블렌딩)를 포함한다.

용어 "수거"는, 형질감염된 진핵생물 세포 시스템으로부터 마이코플라스마 세균의 항원을 수집하거나 회수하는 것을 말한다. 당해 분야에 공지된 임의의 통상적인 방법, 예를 들면, 임의의 분리 방법을 사용하여 상기 마이코플라스마 항원을 회수할 수 있다. 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법들은, 원심분리, 또는 소정 공극 크기를 갖는 반투과성 막을 사용하는 것과 같은 여과를 포함한다.

용어 "단리"는 마이코플라스마 항원의 단리 단계를 포함한다. 감염된 진핵생물 세포 시스템으로부터 마이코플라스마 세균의 항원을 단리하는 방법들은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들 방법은, 동결 해동 사이클, 및 초음파 처리 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 물리적 및/또는 화학적 방법들을 포함한다.

단리물로부터의 항원의 "정제" 방법들은, 예를 들면, 문헌[Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angel, eds., IRL Press at Oxford University Press]에 기술된 방법들에 의해 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들 방법으로는 원심분리 및/또는 여과, 침전, 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 공유결합 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 등에 의한 분리가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 항원은, 정제된 순수한 형태로 수득될 수 있거나, 다른 세포 물질들 또는 배양 배지 등을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않을 수 있다. 상기 단리 및/또는 정제 후, 항원은 적어도 80%, 바람직하게는 80% 내지 90%, 더욱 바람직하게는 90% 내지 97%, 가장 바람직하게는 97% 초과의 순도 내지 어떠한 오염물도 갖지 않는 절대 순수 형태를 나타낸다.

추가의 양상에 따르면, 본원에서 사용된 "수득하는"은 또한 완충제 첨가, 불활성화, 및 중화 단계 등과 같은 추가의 피니싱 단계들을 최종 제형화 프로세스의 부분으로서 포함할 수 있다.

임의의 통상적인 "불활성화" 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 불활성화는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 화학적 및/또는 물리적 처리에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 불활성화 방법들은, 이원성 에틸렌이민(BEI)으로 고리화된 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드(BEA) 용액의 첨가를 포함하는, 고리화된 이원성 에틸렌이민(BEI)의 첨가를 포함한다. 바람직한 추가의 화학적 불활성화제로는 트리톤 X-100, 나트륨 데옥시콜레이트, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, β-프로피오락톤, 티메로살, 페놀 및 포름알데하이드(포르말린)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 불활성화는 중화 단계도 포함할 수 있다. 바람직한 중화제로는 티오황산나트륨, 및 중아황산나트륨 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 포르말린 불활성화 조건은 약 0.02%(v/v) 내지 2.0%(v/v), 더욱 바람직하게는 약 0.1%(v/v) 내지 1.0%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 0.15%(v/v) 내지 0.8%(v/v), 더욱 더 바람직하게는 약 0.16%(v/v) 내지 0.6%(v/v), 가장 바람직하게는 약 0.2%(v/v) 내지 0.4%(v/v)의 포르말린 농도를 포함한다. 항온배양 시간은 마이코플라스마 종의 내성에 좌우된다. 일반적으로, 불활성화 프로세스는, 적합한 배양 시스템에서 마이코플라스마 성장이 검출될 수 없을 때까지 수행된다.

추가의 양상에 따르면, 본 발명의 불활성화된 박테린 구성성분은, 예를 들면, 문헌[Nature, 1974, 252, 252-254] 또는 문헌[Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13]에 기술된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 리포솜 내에 혼입될 수 있다. 다른 양상에 따르면, 본 발명의 불활성화된 박테린 구성성분은 폴리사카라이드, 펩타이드, 또는 단백질 등, 또는 이들의 조합물과 같은 적합한 생물학적 화합물들에 접합될 수 있다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 마이코플라스마 면역원성 조성물이다.

본 발명의 한 양상에서, 마이코플라스마 세균의 배양에 사용되는 혈청은 돼지-혈청을 포함하지 않는다. 용어 "돼지-혈청을 포함하지 않는"은, 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양 프로세스 동안에 돼지-혈청이 첨가되지 않는다는 것을 의미한다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 혈청은 돼지-혈청을 포함하지 않는다. 추가의 양상에 따르면, 모든 상기 마이코플라스마 항원은 돼지-혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 생성된다.

추가의 양상에서, 마이코플라스마 세균의 배양은 혈청의 부재 하에 수행된다. 이는, 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양 동안에 혈청이 첨가되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청의 부재 하에 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 추가의 양상에 따르면, 모든 상기 마이코플라스마 항원은 혈청의 부재 하에 생성된다.

본 발명의 한 양상에서, 마이코플라스마 항원은 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 마이코플라스마 항원은 전체 불활성화된 박테린이다. 추가의 양상에 따르면, 상기 면역원성 조성물 내의 모든 상기 마이코플라스마 항원은 전체 불활성화된 박테린이다. 상기 불활성화된 마이코플라스마 항원은, 상기 기술된 방법의 단계 b)가 불활성화 단계를 포함함으로써 수득될 수 있다. 따라서, 추가의 양상에 따르면, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하고, 상기 마이코플라스마 항원을 불활성화시키는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법이 제공된다.

상기 전체 불활성화된 박테린은, 바람직하게는 본원에서 상기 기술된 방법에 의한 전체 마이코플라스마 세균의 불활성화에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하고, 상기 마이코플라스마 항원을 불활성화시키는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 마이코플라스마 항원은 완전한 마이코플라스마 세균이다.

바람직하게, 상기 마이코플라스마 세균은, 상기 기술된 바와 같은 포르말린으로 불활성화된다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하고, 상기 마이코플라스마 항원을 포르말린으로 불활성화시키는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 마이코플라스마 항원은 완전한 마이코플라스마 세균이다. 바람직하게, 상기 포르말린은 상기 기술된 바와 같은 농도로 사용된다.

본 발명의 한 양상에서, 진핵생물 세포 시스템은 MDCK 세포주를 포함한다. MDCK(마딘-다비 개 신장 상피 세포) 세포주는 성체 암컷 코커 스패니얼(cocker spaniel)의 신장 조직으로부터 유도되었다. 그러나, MDCK 세포주는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 진핵생물 세포 시스템은 MDCK 세포주를 포함한다. 또한, 상기 마이코플라스마 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린일 수 있다.

본 발명의 추가의 양상에서, 상기 진핵생물 세포 시스템은 맥코이 세포주를 포함한다. 맥코이 세포주는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 진핵생물 세포 시스템은 맥코이 세포주이다. 또한, 상기 마이코플라스마 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린일 수 있다.

본 발명의 한 양상에서, 마이코플라스마 세균은, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오시노비애 및 엠. 보비스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 마이코플라스마 세균은, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오시노비 애 및 엠. 보비스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린일 수 있다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 추가의 양상에서, 마이코플라스마 세균은, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오시노비애 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 마이코플라스마 세균은, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리 니스, 엠. 하이오시노비애 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린일 수 있다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 엠. 하이오뉴모니애 세균을 배양하는 단계; b) 상기 엠. 하이오뉴모니애 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 엠. 하이오뉴모니애의 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 엠. 하이오뉴모니애 박테린이다. 상기 엠. 하이오뉴 모니애 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 엠. 하이오뉴모니애 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 엠. 하이오리니스 세균을 배양하는 단계; b) 상기 엠. 하이오리니스 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 엠. 하이오리니스의 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 엠. 하이오리니스 박테린이다. 상기 엠. 하이오리니스 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 엠. 하이오리니스 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 엠. 하이오시노비애 세균을 배양하는 단계; b) 상기 엠. 하이오시노비애 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 엠. 하이오시노비애의 항원은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 엠. 하이오시노비애 박테린이다. 상기 엠. 하이오시 노비애 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 엠. 하이오시노비애 박테린일 수 있음이 이해된다.

추가의 양상에 따르면, 상기 면역원성 조성물은, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오시노비애 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마이코플라스마 항원을 포함한다. 상기 마이코플라스마 면역원성 조성물의 제조에 사용되는 상기 기술된 바와 같은 마이코플라스마 종들 중 적어도 하나의 세균(예를 들면, 엠. 하이오뉴모니애 또는 엠. 하이오리니스 또는 엠. 하이오시노비애)은, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 본 발명에 따라 배양된다. 바람직하게는, 상기 마이코플라스마 면역원성 조성물의 제조에 사용되는 모든 상기 마이코플라스마 세균은, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 본 발명에 따라 배양된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하 이오리니스 및 엠. 하이오시노비애로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한, 엠. 하이오뉴모니 애, 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오시노비애 및/또는 이들의 임의의 조합의 마이코플라스마 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 모든 상기 마이코플라스마 세균은, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 본 발명에 따라 배양된다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 적어도 엠. 하이오뉴모니애 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니 스, 엠. 하이오시노비애 및/또는 이들의 임의의 조합의 마이코플라스마 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 모든 상기 엠. 하 이오뉴모니애 세균은, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 본 발명에 따라 배양된다. 바람직하게, 상기 엠. 하이 오뉴모니애 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 엠. 하이오뉴모니애 박테린이다. 상기 엠. 하이오뉴모니애 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 적어도 엠. 하이오리니스 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오시노비애 및/또는 이들의 임의의 조합의 마이코플라스마 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 모든 상기 엠. 하이오리니스 세균은 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 본 발명에 따라 배양된다. 바람직하게, 상기 엠. 하이오리니스 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 엠. 하이오리니스 박테린이다. 상기 엠. 하이오리니스 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 적어도 엠. 하이오시노비애 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니 스, 엠. 하이오시노비애 및/또는 이들의 임의의 조합의 마이코플라스마 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 모든 상기 엠. 하이오시노비애 세균은 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 본 발명에 따라 배양된다. 바람직하게, 상기 엠. 하이오 시노비애 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 엠. 하이오시노비애 박테린이다. 상기 엠. 하이오시노비애 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 한 양상에서, 상기 면역원성 조성물은 단일-용량 투여용으로 제형화된다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 단일-용량 투여용으로 제형화된다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

유리하게, 본 발명에 의해 제공된 실험 데이터는, 본 발명의 면역원성 조성물의 단일 용량 투여가 보호성 면역 반응을 확실하게 그리고 효과적으로 자극하였음을 나타낸다. 구체적으로는, 엠. 하이오리니스 및 엠. 하이오뉴모니애에 대해 측정가능한 항체 반응이 나타났다.

본원에서 사용된 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 기니아 피그, 토끼, 햄스터, 돼지, 양, 개, 고양이, 말, 원숭이 또는 소와 같은 포유동물, 또한, 바람직하게는 사람을 나타낸다.

본 발명의 한 양상에서, 대상체는 돼지이다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 돼지이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 추가의 양상에서, 상기 대상체는 소이다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 소이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 추가의 양상에서, 상기 대상체는 고양이이다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 고양이이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 추가의 양상에서, 상기 대상체는 개이다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 개이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제, 흡수 지연제, 항원보강제(adjuvant), 면역 자극제, 및 이들의 조합물을 포함한다.

본 발명의 한 양상에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 항원보강제이다.

본원에서 사용된 "항원보강제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예를 들면, Quil A, QS-21(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 캠브리지 바이오테크 인크.(Cambridge Biotech Inc.)), GPI-0100(미국 앨라배마주 버밍햄 소재의 갈레니카 파마슈티칼스, 인크.(Galenica Pharmaceuticals, Inc.)), 유-중-수 유화액, 수-중-유 유화액, 수-중-유-중-수 유화액을 포함할 수 있다. 상기 유화액은, 특히, 경질 액체 파라핀 오일(유럽 약전 타입); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히, 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 수득된 오일; 직쇄 알킬 그룹을 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 구체적으로는 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지된 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히, 이소스테아르산 에스테르에 기초할 수 있다. 상기 오일은 유화액을 형성하기 위해 유화제와 배합하여 사용된다. 상기 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히, 임의로 에톡실화된, 소르비탄 에스테르, 만니드 에스테르(예를 들면, 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜 에스테르, 폴리글리세롤 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, 플루로닉(Pluronic) 제품들, 특히, L121이다. 문헌[Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)] 및 문헌[Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 예를 들면, 문헌["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147페이지에 기술된 SPT 유화액, 및 상기 동일 문헌의 183페이지에 기술된 유화액 MF59를 사용하는 것이 가능하다. 추가의 적합한 항원보강제로는 다른 많은 것들 중에서 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인크.(Ribi Inc.)), 블록 공중합체(미국 조지아주 애틀란타 소재의 사이트알엑스(CytRx)), SAF-M(미국 캘리포니아주 에머리빌 소재의 키론(Chiron)), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘(Avridine) 지질-아민 항원보강제, 이. 콜라이로부터의 열-불안정성 엔테로톡신(재조합형 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(몬산토(Monsanto))가 포함된다. 이들 중합체를 물에 용해시켜서 산 용액을 생성하고 이를 바람직하게는 생리학적 pH로 중화시켜서 항원보강제 용액을 수득하고, 상기 용액에 면역원성 조성물, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 자체를 혼입시킬 것이다.

항원보강제의 추가의 예는, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택된 화합물이다. 유리한 항원보강제 화합물들은, 특히, 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르와 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 용어 카보머로 공지되어 있다[Pharmeuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]. 당해 분야의 숙련가들은, 또한, 3개 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 폴리하이드록실화 화합물과 가교결합된 이러한 아크릴 중합체를 기술한 미국 특허 제2,909,462호를 언급할 수 있으며, 바람직하게는 3개 이상의 하이드록실의 8개 이하의 수소 원자가 탄소 원자수 2 이상의 불포화 지방족 라디칼에 의해 대체된다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 라디칼, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌 불포화 그룹이다. 불포화 라디칼은 그 자체가 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. 상품명 CARBOPOL^®(미국 오하이오주 소재의 비에프 굿리치(BF Goodrich)) 하에 시판되는 제품들이 특히 적절하다. 이들은, 폴리알케닐 에테르 또는 디비닐 글리콜과 가교결합된 또는 알릴 수크로스와 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합된 아크릴산의 중합체이다. 이들 중, CARBOPOL^® 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. 가장 바람직한 것은 CARBOPOL^® 971P의 사용이다.

바람직하게, 항원보강제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10㎎의 양으로 첨가된다. 더욱 더 바람직하게, 항원보강제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10㎎의 양으로 첨가된다. 더욱 더 바람직하게, 항원보강제는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5㎎의 양으로 첨가된다. 더욱 더 바람직하게, 항원보강제는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5㎎의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게, 항원보강제는 용량당 약 1㎎의 양으로 첨가된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항원보강제는, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 사포닌, 유-중-수 유화액, 수-중-유 유화액, 수-중-유-중-수 유화액, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체, RIBI 항원보강제 시스템, 블록 공중합체, SAF-M, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민, 이. 콜라이로부터의 열-불안정성 엔테로톡신(재조합형 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314, 뮤라밀 디펩타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 항원보강제이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 한 양상에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 수-중-유-중-수 유화액 또는 카보머이다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 수-중-유-중-수 유화액 또는 카보머이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 한 양상에서, 수-중-유-중-수 유화액은 Montanide ISA207 VG이다. Montanide ISA207 VG는, 비광유 중 용액 중의 무수 만니톨의 올레산 에스테르로 구성된 항원보강제이며, 수-중-유-중-수 백신 유화액을 달성하도록 고안된다. Montanide ISA207 VG는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있고, 사용 가능하다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 Montanide ISA207 VG 또는 CARBOPOL^®이다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명은, 또한, 마이코플라스마 항원의 면역원성을 증가시키기 위한 상기 기술된 바와 같은 방법에 관한 것이다. 유리하게, 본 발명에 의해 제공된 실험 데이터는, 상기 기술된 방법에 의해 제공된 마이코플라스마 세균 항원이, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 항원에 비해 증가된 면역원성을 갖는다는 것을 나타낸다. 구체적으로, MDCK 기반 엠. 하이오리니스 백신은 더 이른 혈청-전환 개시, 더 많은 수의 혈청-양성 돼지 및 더 높은 혈청학적 역가를 나타냈다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 항원의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 한 양상에서, 항원은, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 항원에 비해 증가된 면역원성을 갖는다. 따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는, 항원의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 동일한 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 비해 증가된 면역원성을 갖는다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본원에서 사용된 용어 "증가된 면역원성"은, 관심 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 의해 야기된 면역학적 반응이, 동일한 항원을 포함하는 참조 면역원성 조성물에 비해 증가됨을 의미하며, 여기서, 상기 참조 면역원성 조성물의 항원은, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로 제조된다.

용어 "증가된"은, 세포 매개된 및/또는 항체 매개된 면역 반응이, 동일한 항원을 포함하는 참조 면역원성 조성물에 의해 도출된 세포 매개된 및/또는 항체 매개된 면역 반응에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 100% 증가됨을 의미하며, 여기서, 상기 참조 면역원성 조성물의 항원은, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로 제조된다. 세포 매개된 및/또는 항체 매개된 면역 반응을 측정하는 방법은 당해 분야의 숙련가의 일반적인 지식에 속한다. 특히, 관심 면역원성 조성물의 세포 매개된 면역 반응을 참조 조성물의 세포 매개된 면역 반응과 비교하거나, 관심 면역원성 조성물의 항체 매개된 면역 반응을 참조 조성물의 항체 매개된 면역 반응과 비교하는 것은 당해 분야의 이러한 숙련가에게 명백하지만, 관심 면역원성 조성물의 세포 매개된 면역 반응을 참조 조성물의 항체 매개된 면역 반응과 비교하거나, 그 반대로 비교하는 것은 명백하지 않다. 또한, 세포 매개된 면역 반응은, 예를 들면, 관심 면역원성 조성물/항원에 의한 세포독성 T-세포의 활성화를 측정함으로써 측정할 수 있다. 항체 매개된 면역 반응은, 예를 들면, 이러한 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여한 경우에 생성된 항원 특이적 항체의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 세포 매개된 및/또는 항체 매개된 면역 반응은, 예를 들면, 마우스 모델, 고양이 모델, 소 모델 또는 돼지 모델을 사용하여 측정할 수 있다. 그러나, 실시예 4 및 실시예 5에 기술된 검정에서 엠. 하이오리니스 및 엠. 하이오뉴모니애에 대한 면역학적 반응을 검출하기 위한 참조 검정으로서 사용될 것이다.

용어 "동일한 항원"은, 항원들의 성질이 동일함을 의미한다. 따라서, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템에서 생성된 면역원성 조성물의 마이코플라스마 항원이 엠. 하이오리니스의 전체 불활성화된 박테린인 경우, "동일한 항원"은, 세포 불포함 시스템의 마이코플라스마 항원도 엠. 하이오리니스의 전체 불활성화된 박테린임을 의미한다. 추가로, 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템에서 생성된 면역원성 조성물의 마이코플라스마 항원이 특정한 방법에 따라 제조되거나 정제된 경우, "동일한 항원"은, 세포 불포함 시스템의 마이코플라스마 항원이 동일한 방법에 따라 제조되거나 정제됨을 의미한다.

용어 "참조" 면역원성 조성물은, 본 발명에 따른 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양에 의해 수득되지 않은 면역원성 조성물을 말한다.

오히려 용어 "참조" 면역원성 조성물은, 동일한 항원을 사용하여, 혈청이 보충된 세포 불포함 배양 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양에 의해 수득된 면역원성 조성물을 말한다. 혈청이 보충된 세포 불포함 배양 시스템에서의 마이코플라스마 세균의 배양은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 혈청 기원 및 혈청 농도는 배양되는 마이코플라스마 세균 및 수득하고자 하는 마이코플라스마 세균의 수율에 좌우된다. 엠. 하이오리니스, 엠. 하이오뉴모니애 및 엠. 하이오시노비애는, 일반적으로는 높은 수율을 얻기 위해 10 내지 20%(v/v) 돼지 혈청 및 5 내지 10%(v/v) 효모 추출물이 보충된 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된다. 그러나, 혈청 농도는 가변적일 수 있고, 효모 추출물은 제거될 수 있고, 혈청의 기원은, 예를 들면, 소 태아 혈청 등으로 바뀔 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명은, 상기 정의된 바와 같은 면역원성 조성물의 제조 방법 또는 항원의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 본 발명은, 또한, 상기 기술된 바와 같은 방법들에 의해 수득가능한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 따라서, 추가의 양상에서, 본 출원은, 본 발명에 따르는 그리고 본원에 기술된 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 이러한 방법은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본 발명의 한 양상에서, 상기 면역원성 조성물은, 항원을 포함하는 참조 면역원성 조성물에 비해 증가된 면역원성을 나타내며, 상기 참조 면역원성 조성물의 항원은 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로 제조된다.

따라서, 추가의 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물을 제공한다. 추가의 양상에 따르면, 이러한 면역원성 조성물은, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로 제조된 동일한 항원을 포함하는 참조 면역원성 조성물에 비해 증가된 면역원성을 나타낸다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

추가의 양상에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 진핵생물 세포 시스템의 진핵생물 세포의 구성성분들을 포함한다.

용어 "진핵생물 세포의 구성성분들"은 상기 진핵생물 세포의 전체 세포 및 단편들을 둘 다 포함한다. 용어 "단편"은 진핵생물 세포의 임의의 부분들, 예를 들면, 세포막 또는 세포내 소기관의 부분들을 전체로서 또는 이의 부분으로서 포함한다. 그러나, 용어 단편은, 또한, 지질, 단백질, 당, DNA, 및 RNA 등뿐만 아니라 이들의 조합도 포함하는 상기 진핵생물 세포의 임의의 부분도 포함한다. 추가로, 진핵생물 세포의 구성성분들 및 마이코플라스마 항원은 면역원성 조성물 중에서 개별적으로 또는 서로 부착되어 존재할 수 있거나 이의 조합으로 존재할 수 있다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 상기 진핵생물 세포 시스템의 진핵생물 세포의 구성성분들을 포함한다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

추가의 양상에서, 상기 진핵생물 세포의 구성성분들은 상기 마이코플라스마 항원에 부착된다.

용어 "부착되는"은 상기 마이코플라스마 항원에 대한 상기 진핵생물 세포의 구성성분들의 임의의 상호작용, 연합, 결합, 접착 또는 연결을 말한다. 따라서, 용어 "부착되는"은 직접 또는 간접 결합, 비-가역적 또는 가역적 결합, 물리적 및 화학적 결합, 정전기적 결합, 및/또는 공유결합적 결합을 포함하는 임의의 상호작용을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 진핵생물 세포의 구성성분들은 마이코플라스마 항원에 결합될 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 진핵생물 세포의 구성성분들은 또한 마이코플라스마 항원(들)에 연결될 수도 있음을 이해해야 한다. 이러한 연결은, 포름알데하이드 처리 등과 같은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 몇몇 방법들에 의해 생성될 수 있다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 진핵생물 세포의 구성성분들은 상기 마이코플라스마 항원에 부착된다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

전형적으로, 마이코플라스마 박테린과 같은 세균성 항원이 사용되는 경우, 상기 면역원성 조성물은, 용량당 약 10³ 내지 약 10¹⁰ 집락 형성 단위(CFU)의 세균성 항원, 바람직하게는 용량당 약 10⁴ 내지 약 10⁹CFU의 세균성 항원, 더욱 바람직하게는 약 10⁵ 내지 약 10⁶CFU의 세균성 항원의 양을 함유한다. 불활성화된 박테린이 상기 면역원성 조성물에 사용되는 경우, CFU 값은 불활성화 이전의 마이코플라스마 세균의 양을 나타낸다.

예를 들면, 엠. 하이오뉴모니애의 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은, 바람직하게는 용량당 약 10² 내지 약 10¹⁰CFU, 바람직하게는 용량당 약 10³ 내지 약 10⁹CFU의 양으로, 더욱 더 바람직하게는 용량당 약 10⁴ 내지 약 10⁸CFU의 양으로, 가장 바람직하게는 용량당 약 10⁵ 내지 약 10⁷CFU의 양으로 사용된다. 엠. 하이오리니스의 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 용량당 약 10² 내지 약 10¹⁰CFU, 바람직하게는 용량당 약 10³ 내지 약 10⁹CFU의 양으로, 더욱 더 바람직하게는 용량당 약 10⁴ 내지 약 10⁸CFU의 양으로, 가장 바람직하게는 용량당 약 10⁵ 내지 약 10⁷CFU의 양으로 사용된다. 엠. 하이오시노비애의 항원을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 용량당 약 10² 내지 약 10¹⁰CFU, 바람직하게는 용량당 약 10³ 내지 약 10⁹CFU의 양으로, 더욱 더 바람직하게는 용량당 약 10⁴ 내지 약 10⁸CFU의 양으로, 가장 바람직하게는 용량당 약 10⁵ 내지 약 10⁷CFU의 양으로 사용된다.

따라서, 한 양상에 따르면, 본 출원은, a) 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템 또는 돼지 혈청 불포함 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계; b) 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및 c) 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제공 방법을 제공하며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 용량당 약 10³ 내지 약 10¹⁰ 집락 형성 단위(CFU)의 상기 세균성 항원의 양을 함유한다. 바람직하게, 상기 마이코플라스마 항원 중 하나 이상은, 바람직하게는 포르말린으로 불활성화된, 전체 불활성화된 마이코플라스마 박테린이다. 상기 마이코플라스마 항원 중 단 하나, 일부 또는 전부는 전체 불활성화된 박테린일 수 있음이 이해된다.

본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물의 제공 방법의 다양한 프로세스 단계들은, 본원에 기술된 바와 같이 본 발명을 실시하기 위해 조합될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 이해된다.

실시예

하기 실시예는, 단지 본 발명을 예시하기 위해 의도된 것이다. 이들은 어떠한 방시으로도 특허청구범위의 범주를 제한하지 않을 것이다.

실시예 1

각각 MDCK 세포 또는 맥코이 세포에서의 마이코플라스마 세균의 배양

A. MDCK 세포에서의 엠. 하이오리니스 , 엠. 하이오시노비애 및 엠. 하이오뉴모니애 의 배양

엠. 하이오리니스 :

MDCK 세포의 컨플루언트(confluent) T75 플라스크(들)를 트립신 처리하고, MEM + 5% FBS를 사용하여 5개의 T150 플라스크(1:10 분할) 중에서 계대배양한다. 플라스크들을 대략 95 내지 100%의 컨플루언트 단층이 관찰될 때까지 37℃ + 5% CO₂에서 항온배양한다. 배지를 경사분리(decant)하고, 플라스크를 1xPBS로 2회 세정한다. 4 내지 5㎖의 엠. 하이오리니스를 각각의 플라스크에 첨가한다(MOI = 10 내지 100). 플라스크 중의 컨플루언트 세포를, 상기와 동일한 항온배양 조건 하에 2시간 이상 동안 감염시킨다. 감염 기간 후, 대략 37℃로 미리 승온시킨 충분한 감염 배지(MEM + 2% FBS)를 플라스크당 60㎖의 총 체적으로 각각의 플라스크에 첨가한다. 플라스크를 > 90% CPE까지 항온배양한다(대략 3 내지 7일). 각각의 플라스크로부터 세포 현탁액을 수집하여 함께 풀링(pooled)한다(계대수 = n). 상기 풀링된 재료를 사용하여 선행 감염과 동일한 방식으로 대략 95 내지 100% 컨플루언트 MDCK 세포의 새로운 플라스크를 감염시키고(계대수 = n + 1), 이는, 필요하다고 판단되는 충분한 최종 체적을 달성하는데 사용되는 플라스크의 수를 증가시킨다(계대수 = n + 2, 계대수 = n + 3 등).

엠. 하이오시노비애 :

엠. 하이오시노비애를 다음의 몇몇 변경사항으로 엠. 하이오리니스와 동일한 방식으로 배양한다: 감염 배지는 DMEM + 2% FBS + 1% 아르기닌 용액을 함유하고; 엠. 하이오시노비애는 전형적으로 CPE를 나타내지 않기 때문에, 배지의 색 변화 및 탁도가, 후속 계대로의 계대배양에 대한 주요 지표이다.

엠. 하이오뉴모니애 :

엠. 하이오뉴모니애를 엠. 하이오리니스와 동일한 방식으로 배양한다. 감염에 사용되는 균주에 따라, CPE가 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 따라서, 배지의 색 변화 및 탁도를 후속 계대로의 계대배양에 대한 지표로서 사용할 수 있다.

B. 맥코이 세포에서의 엠. 하이오리니스 , 엠. 하이오시노비애 및 엠. 하이오뉴모니애 를 위한 배양 조건

엠. 하이오리니스 :

10% FBS가 보충된 변형된 EMEM의 교반 플라스크 중의 현탁액 배양물로서 맥코이 세포를 성장시킨다. 새로운 플라스크를 10⁵ 내지 10⁶개 세포/㎖의 최종 농도를 갖도록 씨딩(seeding)하여 세포를 계대배양한다. 엠. 하이오리니스를 위해, 3L 플라스크 중의 10⁵ 내지 10⁶개 세포/㎖ 농도의 500㎖ 세포 현탁액을 1㎖ 10⁷ 내지 10⁸CFU로 씨딩한다. 플라스크를 자기 교반 플레이트 상에서 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 3 내지 7일 동안 항온배양한다. 가시적인 산성 pH 변화 및 탁도 증가에 의해 마이코플라스마 성장을 확인한다. 또한, PFU 검정에 의해 마이코플라스마 성장을 평가하여 카운트(count)를 측정한다.

엠. 하이오시노비애 :

엠. 하이오시노비애를 엠. 하이오리니스와 유사한 방식으로 배양한다. 3L 플라스크 중의 10⁵ 내지 10⁶개 세포/㎖ 농도의 500㎖ 세포 현탁액을 1㎖ 10⁵ 내지 10⁷CFU로 씨딩한다. 이어서, 플라스크를 자기 교반 플레이트 상에서 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 대략 2주 동안 항온배양한다. 카운트를 측정하기 위한 PFU 검정에 추가하여, pH 변화와 탁도 증가 둘 다를 사용하여 성장을 측정한다.

엠. 하이오뉴모니애 :

엠. 하이오뉴모니애를 엠. 하이오리니스 및 엠. 하이오시노비애와 유사한 방식으로 배양한다. 3L 플라스크 중의 10⁵ 내지 10⁶개 세포/㎖ 농도의 500㎖ 세포 현탁액을 1㎖ 10⁵ 내지 10⁷CFU로 씨딩한다. 플라스크를 자기 교반 플레이트 상에서 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 대략 2주 동안 항온배양한다. 카운트를 측정하기 위한 PFU 검정에 추가하여, pH 변화와 탁도 증가 둘 다를 사용하여 성장을 측정할 수 있다.

C. 각종 혈청 타입을 사용한 마이코플라스마 종의 배양

상이한 종 유래의 혈청에서 마이코플라스마 종이 배양될 수 있는지를 평가하기 위해, MDCK 세포를 엠. 하이오리니스로 감염시키고, 소 태아 혈청, 돼지 혈청, 토끼 혈청, 닭 혈청 또는 말 혈청 중에서 배양한다. 각각의 혈청 타입에 대해, MDCK 세포 중의 엠. 하이오리니스의 배양을, 상기 기술된 바와 같이 수행한다(즉, 세포 성장의 경우 5% 혈청 및 감염의 경우 2% 혈청). 엠. 하이오리니스를 감염 후 4일째에 표준 방법에 따라 수거한다. CCU(색 변화 단위) 검정을 수행하여 엠. 하 이오리니스의 생존 역가(live titer)를 측정한다. 추가로, qPCR(정량적 실시간 폴리머라제 사슬 반응)을 수행하여 엠. 하이오리니스의 총 게놈 함량을 측정한다. 예시적인 실험을 표 1에 나타낸다.

표 1은, CCU 검정 또는 qPCR에 의해 측정된 역가들이 각종 혈청 타입에 대해 유사하다는 것을 입증한다. 추가로, 웨스턴 블롯 데이터(나타내지 않음)는 이러한 데이터를 뒷받침한다. 따라서, 엠. 하이오리니스는, 배양에 사용되는 혈청 타입과는 관계 없이 MDCK 세포에서 배양될 수 있다.

실시예 2

백신의 제조

최종 계대배양물이 수거될 준비가 되었을 때(>90% CPE가 존재함), 모든 플라스크를 >2시간 동안 < -60℃ 동결기 내에 위치시키고, 37℃에서 신속하게 해동시키고, 용해물을 수집하여 풀링하고, 수회 상하로 피펫팅하여 균질화시킴으로써 모든 플라스크에 대해 단일 동결-해동 사이클을 수행한다. 일반적으로, 이어서, 10 내지 20% 글리세롤을 상기 현탁액에 첨가하고 균질화시킨다. 상기 현탁액을 작업 체적(working volume)들로 분취한다. 스톡(stock)을 필요할 때까지 < -60℃에서 유지시킨다.

상기 스톡의 적절한 체적을 0.2% 포르말린으로 불활성화시킨다. 과량의 포르말린을 백신 블렌딩시에 중아황산나트륨으로 중화시킨다. 백신을 Montanide™ ISA 207 VG 항원보강제 또는 CARBOPOL^® 항원보강제와 블렌딩한다. 백신을 2 내지 7℃에서 보관한다.

실시예 3

백신의 유효성의 평가

백신의 효능은, 돼지에 투여된 후에 항체 반응을 유도하는 능력(뿐만 아니라 ELISA에 의한 역가)에 기초하여 평가된다.

동물 관리 :

동물은 연구 개시 전에 양호한 건강 및 영양 상태에 있다. 무작위배정 절차 이전에 건강 조사를 수행한다. 연구 지속기간 내내 비-의료용 사료(non-medicated feed)가 사용된다. 사료 공급량은 시설 표준 작업 절차에 따라 시험 동물의 연령, 상태 및 종에 적절하다. 물은 연구 내내 임의로(ad libitum) 제공된다.

돼지에게 투여된 후의 엠. 하이오리니스 및 엠. 하이오뉴모니애 백신의 유효성의 평가

엠. 하이오리니스 :

0일째에 그리고 다시 21일째에, 6주±5일령의 통상의 새끼 돼지에게 엠. 하 이오리니스 백신 2㎖ 용량(7.1 내지 7.3 log10 CCU/용량)을 근육내로 투여한다. 엠. 하이오리니스를 상기와 같이 제조하며; 즉, 상기 기술된 바와 같이 MDCK 세포에서 배양한다. 백신을 Montanide ISA207VG 또는 CARBOPOL^®로 항원보강한다. PBS를 위약으로서 사용한다. 돼지를 전반적인 건강 상태에 대해 매일 관찰한다. 백신접종 이전, 0일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째 및 42일째에 혈액을 수집한다. 혈청을 BIVI R&D 간접 ELISA에 의해 엠. 하이오리니스 특이적 항체에 대해 시험한다. BIVI R&D ELISA에 대해, > 0.200의 S/P 비가 양성으로 간주된다.

표 2에 나타낸 예에서, 엠. 하이오리니스 ELISA는 강력한 항체 반응을 나타낸다. 엠. 하이오리니스-MDCK + Montanide ISA207VG로 백신접종된 동물의 6/6(100%)가 제1 용량 후 2주(14일)째에 양성이었다. 모든 동물들이 42일째에 걸쳐 양성으로 남아있었으며, 제2 용량 후 1주(28일)째에 역가의 증폭이 있었다. 엠. 하이오리니스-MDCK + Carbopol^®로 백신접종된 동물도 또한 항체 반응을 나타낸다.

맥코이 세포에서 배양된 엠. 하이오리니스를 사용하여, 백신접종 후에 유사한 항체 반응 결과가 달성되었다(데이터는 나타내지 않음). 단일 용량 투여 후에 유사한 결과가 수득되었다(데이터는 나타내지 않음).

엠. 하이오뉴모니애 :

0일째에 그리고 다시 21일째에, 6주±5일령의 통상의 새끼 돼지에게 엠. 하이오뉴모니애 백신 2㎖ 용량(8.0 내지 8.5 log10 CCU/용량)을 근육내로 투여한다. 백신을 Montanide ISA207VG로 항원보강한다. PBS를 위약으로서 사용한다. 돼지를 전반적인 건강 상태에 대해 매일 관찰한다. 엠. 하이오뉴모니애 항체의 존재에 대해 시험하기 위해, 백신접종 이전, 0일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째 및 42일째에 혈액을 수집한다. 한 예에서, 시판되는 IDEXX ELISA를 사용하였다. IDEXX ELISA에 대해, > 0.400의 S/P 비가 양성으로 간주되었다.

표 3에 나타낸 예에서, 엠. 하이오뉴모니애 ELISA는 강력한 항체 반응을 나타냈다. 엠. 하이오뉴모니애 MDCK + ISA207로 백신접종된 동물의 경우, 14일째에 3/6(50%)의 동물이 양성이었고, 21일째에 5/6(83.3%)가 양성이었으며, 28일째, 35일째 및 42일째에 6/6(100%)이 양성이었다.

단일 용량 투여 후에 유사한 결과가 수득되었으며, 데이터는 나타내지 않았다.

실시예 4

진핵생물 세포주에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 백신 대 세포 불포함 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 백신의 유효성

8주±5일령의 54마리의 CD/CD 동물을 6개의 그룹으로 나눈다. 그룹 V1 및 V2는, 각각 MDCK 세포 및 CM(복합 배지; 예를 들면, 돼지 혈청 및 효모 추출물을 함유하는 프로테오스 펩톤 기반 배지 또는 프리스(Friis) 기반 배지)에서 배양된 엠. 하이오리니스의 불활성화된 MHRN001 단리물을 투여받고; 그룹 V3 및 V4는, 각각 MDCK 세포 및 CM에서 배양된 엠. 하이오리니스의 불활성화된 MHRN002 단리물을 투여받는다. 모든 백신은 Montanide ISA207VG로 항원보강되며; 용량 및 경로는 2×2㎖ 용량의 근육내 주사로서, 하나의 용량은 0일째에 그리고 제2 용량은 21일째에 주어진다. 그룹 CC(대조군 그룹)는 항원-불포함 위약(PBS)을 동일한 방식으로 투여받는다. 그룹 SC(엄격한 대조군 그룹)는, 연구 내내 치료제를 투여받지 않고, 이는, 엄격한 대조군 동물로서 기능한다. 42일째, 43일째 및 44일째에, 그룹 V1 내지 V4 및 CC의 돼지를 병독성 엠. 하이오리니스로 챌린징한다. 용량 및 투여 경로는 각각 40㎖ 복강내, 15㎖ 정맥내 및 15㎖ 비내이다. 엠. 하이오리니스-특이적 ELISA 시험을 위해 0일째로부터 연구 종료일(58일째)에 걸쳐 매주 혈액을 수집한다. R&D 엠. 하이오리니스 ELISA에 대해, > 0.200의 S/P 비가 양성으로 간주되었다. 표 4에 나타낸 예시적인 연구에서, 그룹 SC의 모든 돼지는 연구 내내 음성으로 남아있었고, 이는, 엠. 하이오리니스에 대한 노출의 결여를 나타냈다. 그룹 V1 내지 V4 및 CC는 0일째 및 7일째에 음성이었다. 그러나, 혈청학적 결과는 CM 기반 백신과 MDCK 기반 백신에서 서로 달랐다. CM 기반 백신에 비교하는 경우, MDCK 기반 백신은 보다 이른 혈청-전환 개시, 보다 많은 수의 혈청-양성 돼지 및 보다 높은 혈청학적 역가를 나타냈다.

세포 배양물-기반 백신과 세포 불포함 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터의 백신을 비교하기 위해 적정 실험을 수행한다.

엠. 하이오리니스를 각각 상기 기술된 바와 같이 맥코이 세포에서 배양하거나 CM(복합 배지)에서 배양한다.

희석되지 않은 항원(전체), 1:10 항원 및 1:100 항원을 사용하여 맥코이 항원으로 백신을 제조하며, 상기 항원은 모두 항원보강제로서의 Montanide ISA207VG와 1:1로 블렌딩된다. 동일한 방식으로 CM 유도된 항원을 사용하여 백신을 제조한다.

돼지(백신접종시 3주령)를 0일째에 단일 2㎖ 용량으로 IM 투여에 의해 백신접종한다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 예시적 연구로부터의 그룹 평균은 챌린징 이전(0일째 내지 21일째)에 모두 "음성"이었지만, "맥코이 + ISA 전체" 및 "맥코이 + ISA 1:10"은 양성으로 향하는 경향의 반응을 나타냈다. 챌린징 후 1주(28일)째에, CM 1:100을 제외하고는 모든 백신접종 그룹이 반응하였다.

표 5로부터, 각각의 항원 타입(맥코이, CM)은 표준 적정 효과(전체 > 1:10 > 1:100)를 나타낸다는 것이 명백하다. 추가로, 표 5로부터, "맥코이 + ISA 전체" 및 "맥코이 + ISA 1:10" 백신접종군은, "CM + ISA 전체" 항원보다 더 높은 평균 점수를 갖고, 이는 42일째의 종료시까지 내내 유효하다는 것이 명백하다. 챌린징 후에 양성(S/P ≥0.200) 평균을 갖는 그룹은 "맥코이 + ISA 전체" 및 "맥코이 + ISA 1:10" 그룹이다. 맥코이 전체 백신 및 1:10 희석은 챌린징-전과 챌린징-후 둘 다에서 CM 전체 백신보다 더 높은 혈청-반응을 나타냈다. 추가로, 맥코이 1:100으로 백신접종된 동물은, 또한, 위약(비-백신접종) 그룹 및 CM 1:100 그룹(CM 1:100 반응 또는 이의 결여는 비-백신접종 그룹과 동등하였음)과는 구별가능한 반응을 입증하였다. 상기 적정 실험은, 세포 배양물-기반 백신이, 세포 불포함 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터의 백신에 비해 더 우수한 혈청학적 결과를 갖는다는 것을 입증하였다.

Claims

대상체에서의 마이코플라스마(mycoplasma) 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법으로서,
a. 혈청-감소된 진핵생물 세포 시스템에서 마이코플라스마 세균을 배양하는 단계;
b. 상기 마이코플라스마 세균의 항원을 수득하는 단계; 및
c. 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하는 단계
를 포함하는, 대상체에서의 마이코플라스마 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 면역원성 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈청이 돼지 혈청을 포함하지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이코플라스마 세균이 혈청의 부재 하에 배양되는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 마이코플라스마 면역원성 조성물인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 항원에 비해 증가된 면역원성을 갖는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 전체 불활성화된 박테린(whole inactivated bacterin)인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 전체 불활성화된 박테린이, 포르말린 불활성화된 박테린인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵생물 세포 시스템이 MDCK 세포주를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵생물 세포 시스템이 맥코이(McCoy) 세포주를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이코플라스마 세균이, 엠. 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae), 엠. 하이오리니스(M. hyorhinis), 엠. 하이오시노비애(M. hyosynoviae), 이들의 임의의 조합, 및 엠. 보비스(M. bovis)로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이코플라스마 세균이, 엠. 하이오뉴모니애, 엠. 하이오리니스 및 엠. 하이오시노비애로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 단일-용량 투여용으로 제형화되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 돼지인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 소인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 고양이인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 개인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가, 용매, 분산 매질, 피복제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제, 흡수 지연제, 항원보강제(adjuvant), 면역 자극제, 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 사포닌, 유-중-수 유화액, 수-중-유 유화액, 수-중-유-중-수 유화액, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체, RIBI 항원보강제 시스템, 블록 공중합체, SAF-M, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘(Avridine) 지질-아민, 이. 콜라이(E. coli)로부터의 열-불안정성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin)(재조합형 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314, 뮤라밀 디펩타이드 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원보강제인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 수-중-유-중-수 유화액 또는 카보머인, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항원의 면역원성을 증가시키기 위한, 방법.
제20항에 있어서, 상기 항원이, 세포 불포함 배양 시스템에서 배양된 마이코플라스마 세균으로부터 수득된 항원에 비해 증가된 면역원성을 갖는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 면역원성 조성물.