KR20220018508A - 마이코플라즈마 배지 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이코플라즈마 성장을 위한 돼지 혈청 및 동물(주로 소 뇌 및 척수) 기원 성분이 없는 배지 제형에 관한 것이다. 배지 제형은 마이코플라즈마 항원성을 보존하도록 합리적으로 설계되었다. 이러한 배지 제형에서 성장한 마이코플라즈마는 백신, 특히 다가 돼지 백신에 유용하다.

Description

마이코플라즈마 배지 제형

본 발명은 돼지 혈청을 함유하지 않고 최소한의 동물 유래 성분을 갖거나 갖지 않는 배지 제형에 관한 것이다. 배지 제형은 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종, 특히 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)의 성장에 유용하다. 배지 제형은 항원 유전자 발현을 유지하면서 마이코플라즈마 성장을 최적화하도록 합리적으로 설계된다. 개시된 배지 제형에서 성장된 마이코플라즈마는 돼지 백신에 사용하기에 적합하다.

마이코플라즈마는 세포벽이 없고, 일반적으로 운동성이 없으며, 종종 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및 심지어 식물에 기생하거나 병원성인 소형 그람-음성 박테리아이다. 많은 수의 마이코플라즈마 종은 마이코플라즈마과(Mycoplasmataceae) 계통으로 분류된다. 마이코플라즈마는 공생 세균일 수 있으며, 종종 포유류의 점막과 관련하여 발견된다. 하나 초과의 마이코플라즈마 종은 특정 점막 표면에 콜로니화할 수 있다. 마이코플라즈마는 특히 면역저하된 유기체에서 다양한 질환 상태의 원인 인자로 연루되어 있다. 어떤 경우에는, 마이코플라즈마 병원성이 바이러스 또는 다른 박테리아의 존재와 관련될 수 있다. 마이코플라즈마는 2차 감염원으로도 작용할 수 있다.

마이코플라즈마-관련 질환을 통제, 감소 또는 예방하기 위해서는, 효과적인 백신이 필요하다. 이러한 백신에 대한 항원을 생산하려면 마이코플라즈마 배양이 필요하지만, 마이코플라즈마의 특성상 어려움이 있다. 마이코플라즈마는 가장 작은 자기-복제 비-바이러스 유기체이며, 그에 상응하는 작은 게놈을 함유하고 있으며, 총 유전자 수는 약 1000개 미만으로 추정된다. 이 제한된 게놈은 필수 영양소 생산에 필요한 많은 효소가 부족하기 때문에 마이코플라즈마는 성장을 위해 숙주 세포 인자 또는 세포 배양 보충제에 의존한다. 예를 들어, 마이코플라즈마는 종종 구아닌과 시토신 뉴클레오사이드, 및 콜레스테롤 또는 기타 지질의 외부 공급원을 필요로 한다. 따라서, 마이코플라즈마는 항원 발현과 면역원성을 변화시키는 환경의 특성을 반드시 취해야 하며, 마이코플라즈마를 함유한 백신은 마이코플라즈마 성장에 사용되는 과정과 보충제에 따라 효과가 다양하다.

여러 마이코플라즈마 종은 돼지 질환과 관련이 있다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)는 돼지에서 관절염을 일으키는 것으로 생각되고, 마이코플라즈마 수이스(M. suis)는 빈혈을 유발할 수 있으며, 마이코플라즈마 하이오라이니티스(M. hyorhinitis)는 특히 어린 돼지에서 섬유소 다발성 장염을 유발할 수 있다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)("Mhp")는 동물성 폐렴을 유발하고, 돼지 생식 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 및 인플루엔자 바이러스와 함께 돼지 호흡기 질환 복합체(PRDC)의 요인이다.

마이코플라즈마 항원이 예를 들어 PRRS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 돼지 파보바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스 및/또는 돼지 써코바이러스-2(PCV-2)와 같은 하나 이상의 다른 박테리아 또는 바이러스와 결합되는 경우 다가 백신이 종종 바람직하다. 그러나, 마이코플라즈마는 돼지 혈청에서 콜레스테롤 등의 공급원으로 성장할 때 항원으로 가장 효과적이지만, 혈청에는 다른 병원체, 특히 PCV-2에 대한 면역을 방해할 수 있는 항체가 함유되어 있다. 항-PCV2 항체를 줄이거나 없애기 위해, 다른 사람들은 단백질 A/G 컬럼으로 항체를 제거하였지만(예를 들어, 미국 특허 번호 제9,120,859호 참조), 이것은 힘들고 비용이 많이 든다. 저혈청 배양 시스템이 개발되었지만(예를 들어, 미국 특허 번호 제9,273,281호 참조), 이들은 오염된 진핵 세포 인자를 함유할 수 있고 이렇게 배양된 마이코플라즈마는 최적의 면역원성을 갖지 않을 수 있다.

성장은 최적화되지만 오염물질은 감소 또는 제거되고 면역원성은 보존되는, 개선된 마이코플라즈마 배양 방법이 필요하다. 상업적 목적을 위해서는, 이 방법이 비용-효율적이고 쉽게 구현되어야 하며, 바람직하지 않은 오염물질이 제한되어야 한다. 합리적으로 설계된 마이코플라즈마 배양 방법, 이 방법을 수행하기 위한 배지 제형, 및 상기 방법을 사용하여 제조된 마이코플라즈마를 함유하는 백신이 본 명세서에 개시된다.

발명의 개요

본 발명은 염화콜린, 나이아신아미드, 니코틴산, L-메티오닌, L-시스테인, 푸트레신 이염산염, 피로인산티아민, L-아스코르브산나트륨, 스페르민, 피리독살 5'-인산 일수화물, 테트라하이드로엽산, 3'-데포스포코엔자임 및 리보플라빈을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 마이코플라즈마 성장 보충제("MGS")로서 사용될 수 있다. MGS를 사용하여 성장한 마이코플라즈마는 마이코플라즈마 하이오시노비에(M. hyosynoviae); 마이코플라즈마 수이스(M. suis); 마이코플라즈마 하이오히니티스(M. hyorhinitis), 또는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, "Mhp")일 수 있다. MGS를 사용하여 성장한 마이코플라즈마는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)일 수 있다. MGS를 사용하여 성장한 마이코플라즈마는 돼지 동물, 조직 또는 세포 내에서 또는 그 위에서 성장할 수 있는 모든 마이코플라즈마일 수 있다. MGS의 성분은 약 0.5 mg/L 염화콜린; 약 0.025 mg/L 나이아신아미드; 약 0.025 mg/L 니코틴산; 약 0.1 mM L-메티오닌; 약 1.5 mM L-시스테인; 약 0.1 mM 푸트레신 이염산염; 약 0.01 mg/L 피로인산티아민; 약 0.284 mM L-아스코르브산나트륨; 약 0.1 mM 스페르민; 약 0.025 mg/L 피리독살 5'-인산 일수화물; 약 0.05 mg/L 테트라하이드로엽산; 약 0.025 mg/L 3'-데포스포코엔자임 A; 및 약 0.01 mg/L 리보플라빈의 최종 농도로 완전 성장 배지에 존재할 수 있다.

본 발명은 기본 배지, 말 혈청; 및 마이코플라즈마 성장 보충제를 포함하는 배지에 마이코플라즈마를 넣는 단계를 포함하는, 마이코플라즈마를 배양하는 방법을 제공한다. 기본 배지는 Frey 배지와 돼지 뇌심장인퓨젼(p-BHI) 배지에서 선택된다. MGS는 염화콜린, 나이아신아미드, 니코틴산, L-메티오닌, L-시스테인, 푸트레신 이염산염, 피로인산티아민, L-아스코르브산 나트륨, 스페르민, 피리독살 5'-인산 일수화물, 테트라하이드로엽산, 3'-데포스포코엔자임 및 리보플라빈을 포함한다. MGS의 성분은 약 0.5 mg/L 염화콜린; 약 0.025 mg/L 나이아신아미드; 약 0.025 mg/L 니코틴산; 약 0.1 mM L-메티오닌; 약 1.5 mM L-시스테인; 약 0.1 mM 푸트레신 이염산염; 약 0.01 mg/L 피로인산티아민; 약 0.284 mM L-아스코르브산나트륨; 약 0.1 mM 스페르민; 약 0.025 mg/L 피리독살 5'-인산 일수화물; 약 0.05 mg/L 테트라하이드로엽산; 약 0.025 mg/L 3'-데포스포코엔자임 A; 및 약 0.01 mg/L 리보플라빈의 최종 농도로 완전 성장 배지에 존재할 수 있다.

본 발명은 마이코플라즈마를 배양하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법을 사용하여 성장한 마이코플라즈마는 돼지 동물, 조직 또는 세포에서 또는 그 위에서 성장할 수 있는 임의의 마이코플라즈마일 수 있다. 상기 방법을 사용하여 성장한 마이코플라즈마는 마이코플라즈마 하이오시노비에(M. hyosynoviae); 마이코플라즈마 수이스(M. suis); 마이코플라즈마 하이오히니티스(M. hyorhinitis), 또는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, "Mhp")일 수 있다. 상기 방법을 사용하여 성장한 마이코플라즈마는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)일 수 있다.

본 발명은 기본 배지, 말 혈청; 및 마이코플라즈마 성장 보충제를 포함하는 배지에 마이코플라즈마를 넣는 단계를 포함하는, 마이코플라즈마를 배양하는 방법을 제공한다. 말 혈청은 완전 배지에 약 2.5% 내지 약 10% v/v로 존재할 수 있다. 말 혈청은 완전 배지에 약 5% 내지 약 10% v/v로 존재할 수 있다. 말 혈청은 완전 배지에 약 10% v/v로 존재할 수 있다. 말 혈청은 완전 배지에 약 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%로 존재할 수 있다.

본 발명은 기본 배지, 말 혈청; 및 마이코플라즈마 성장 보충제를 포함하는 배지에 마이코플라즈마를 넣는 단계, 마이코플라즈마를 37℃에서 3~15일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 마이코플라즈마를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명은 기본 배지, 말 혈청; 및 마이코플라즈마 성장 보충제를 포함하는 배지에 마이코플라즈마를 넣는 단계, 및 마이코플라즈마를 37℃에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 마이코플라즈마를 배양하는 방법을 제공한다. 마이코플라즈마 배양에는 오비탈 쉐이킹(orbital shaking)이 포함될 수도 있다.

본 발명은 기본 배지, 말 혈청; 및 마이코플라즈마 성장 보충제를 포함하는 배지에 마이코플라즈마를 넣는 단계; 마이코플라즈마를 37℃에서 배양하는 단계; 및 마이코플라즈마를 비활성화하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 기본 배지는 Frey 배지와 돼지 뇌심장인퓨젼(p-BHI) 배지에서 선택된다. MGS는 염화콜린, 나이아신아미드, 니코틴산, L-메티오닌, L-시스테인, 푸트레신 이염산염, 피로인산티아민, L-아스코르브산 나트륨, 스페르민, 피리독살 5'-인산 일수화물, 테트라하이드로엽산, 3'-데포스포코엔자임 및 리보플라빈을 포함한다. 말 혈청은 완전 배지에 약 2.5% 내지 약 10% v/v로 존재할 수 있다. 면역원성 조성물에 포함되는 마이코플라즈마는 돼지 동물, 조직 또는 세포 내에서 또는 그 위에서 성장할 수 있는 임의의 마이코플라즈마일 수 있다. 면역원성 조성물에 포함될 마이코플라즈마는 마이코플라즈마 하이오시노비에(M. hyosynoviae); 마이코플라즈마 수이스(M. suis); 마이코플라즈마 하이오히니티스(M. hyorhinitis), 또는 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, "Mhp")일 수 있다. 마이코플라즈마는 2-브로모에틸아민으로 비활성화될 수 있다.

본 발명은 마이코플라즈마에 의해 유발되는 질환의 예방, 감소 또는 개선용 의약의 제조에 있어서 MGS의 용도를 제공한다. MGS는 염화콜린, 나이아신아미드, 니코틴산, L-메티오닌, L-시스테인, 푸트레신 이염산염, 피로인산티아민, L-아스코르브산 나트륨, 스페르민, 피리독살 5'-인산 일수화물, 테트라하이드로엽산, 3'-데포스포코엔자임 및 리보플라빈을 포함한다. 의약은 면역원성 조성물 또는 백신일 수 있다. 의약은 돼지를 비롯한 인간 및 비인간 동물의 치료에 유용할 수 있다.

도 1. 표시된 배지 제형에서 Mhp의 3-일 배양에 대한 전체-규모 CCU 분석 결과. 데이터는 Acutone을 함유한 3가지 제형이 한 실험에만 포함되었다는 점을 제외하고 3가지 실험 반복의 평균을 나타낸다.
도 2. 전체-규모 CCU 분석에 의해 결정된 대규모-발효기 시스템에서 6가지 다른 배지 제형에서 Mhp의 성장. 0일차 CCU 수준은 접종물에서 추정된다.
도 3. 실험 배지 제형에서 성장한 Mhp로 백신 접종한 다음 독성 Mhp로 공격한 돼지의 폐 병변 점수. 총 폐 병변 점수화는 두개복부 폐 경화(CVPC) 방법을 사용하여 수행되며, 전체 폐에 기여하는 각 폐 엽의 대략적인 부피를 곱하는 폐의 개별 7개 엽(오른쪽 정점, 오른쪽 심장, 오른쪽 꼬리, 왼쪽 꼬리, 왼쪽 심장, 왼쪽 정점 및 중간)에서 폐 병변 백분율의 합으로 정의되는 총 폐 병변 백분율로 표시된다. 상업용 백신 FOSTERA(Zoetis Animal Health)은 양성 대조군으로 제시된다.
도 4. ELISA로 측정한 백신접종 돼지의 혈청 내 PCV-2 중화 항체 역가. ELISA는 INGEZIM CIRCO IgG ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 권장 사항(Professional Veterinary Service, Inc.)에 따라 수행되었다.

하기 논의에서 사용된 바와 같이, 단수("a" 또는 "an")는 달리 명시되지 않는 한 하나 이상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 "마이코플라즈마"는 마이코플라즈마과(Mycoplasmataceae) 계통으로 분류되는 모든 종을 지칭한다. 상기 용어는 단일 유기체 또는 다수의 유기체를 포함하는 배양물을 의미할 수 있다. 이 정의에 특히 포함되는 것은 마이코플라즈마 하이오시노비에(M. hyosynoviae); 마이코플라즈마 수이스(M. suis); 마이코플라즈마 하이오히니티스(M. hyorhinitis), 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, "Mhp")이다. 본원에 사용된 바와 같이, "비활성화된" 마이코플라즈마는 숙주나 배양물에서 더 이상 복제할 수 없는 유기체를 의미한다. 비활성화된 유기체는 살해되거나 죽은 것으로 간주된다. 비활성화는 단백질의 화학적 변경, 세포 구조의 화학적 또는 물리적 변경, 또는 핵산의 화학적 또는 물리적 변경을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.

본원에 사용된 "마이코플라즈마 성장 보충제"("MGS")는 마이코플라즈마 성장에 중요한 것으로 확인된 성분의 합리적으로-설계된 구성을 의미한다. 성분의 식별은 Mhp의 게놈 분석을 기반으로 한다. MGS는 전형적으로 완전한 배지를 준비하는 동안 기본 배지 제형에 추가되는 농축 용액으로 준비된다. 본원에 개시된 MGS는 염화콜린, 나이아신아미드, 니코틴산, L-메티오닌, L-시스테인, 푸트레신 이염산염, 피로인산티아민, L-아스코르브산 나트륨, 스페르민, 피리독살 5'-인산 일수화물, 테트라하이드로엽산, 3'-데포스포코엔자임 및 리보플라빈을 포함한다. 당업자는 이들 성분의 일부 염 형태가 상호교환가능할 수 있음을 인식할 것이다.

본원에 사용된 "완전 배지"는 표시된 유기체 또는 세포의 성장에 필요한 유기 인자를 함유하는 배양 배지를 지칭한다. Mhp의 경우 완전 배지는 최소한 기본 배지, 혈청 및 MGS를 포함한다. "최종 농도"는 완전 배지 중의 표시된 성분의 농도를 의미한다.

본원에 사용된 "Frey" 배지 및 "돼지 뇌심장인퓨젼"("p-BHI") 배지는 표 11 및 12에서 확인된 제형을 의미한다.

본원에 사용된 "면역원성 조성물"은 동물에게 투여될 때 면역 반응을 유발하는 조성물이다. 면역원성 조성물은 적어도 하나의 항원 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 항원은 살아 있거나 비활성화된 전체 바이러스, 박테리아 또는 기타 병원체일 수 있다. 항원은 또한 바이러스, 박테리아 또는 기타 병원체로부터 분리, 정제 또는 부분적으로 정제된 항원 분자일 수 있다. 항원은 폴리펩타이드, 다당류, 핵산 또는 지질, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

본원에 사용된 "백신"은 동물에게 투여될 때 질환 증상에 대한 보호, 내성, 예방 또는 감소를 부여하는 면역원성 조성물이며, 여기서 상기 증상은 병원성 유기체, 예를 들어 박테리아, 특히 마이코플라즈마에 의해 유발된다.

본원에 사용된 용어 "돼지(porcine)" 및 "돼지(swine)"는 소목류(even-toed ungulate) 수이대(Suidae) 과에 속하는 Sus 속의 동물인 돼지를 지칭한다.

용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 그것이 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 변할 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약"은 용어와 관련된 값의 ±10% 변동을 포함하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "치료하고 있는", "치료하는" 또는 "치료"는 기존 증상, 장애, 병태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 억제, 감속, 중지, 감소, 개선 또는 역전시키는 것을 포함한다. 치료는 예방적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다.

하기 실험예는 마이코플라즈마에 유용한 물질을 포함하는 마이코플라즈마 배양 방법 및 그렇게 배양된 마이코플라즈마의 용도를 예시한 것이다. 다른 실시형태 및 용도가 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명이 이러한 특정 예시적인 실시예 또는 바람직한 실시형태에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.

본원에 제시된 연구의 목적은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae)가 돼지 혈청과 소 뇌, 심장 인퓨젼(또는 가능한 경우 임의의 동물 성분)이 없는 배지에서 성공적으로 성장할 수 있는지 확인하는 것이다. 가장 성공적인 제형은 동물에서 효능 연구를 위한 물질을 생산하는 데 사용될 것이다. 새로운 배지 제형의 성공을 평가하기 위한 주요 반응 변수는 색상-변경 단위(CCU) 분석에 의해 추정된 생존 세포 수였다. 가장 유망한 제형에서 성장한 세포의 단백질체학 분석은 돼지 혈청의 부재가 세포의 단백질 발현 프로파일을 유의하게 변경하여 세포의 항원 특성을 감소시키고 백신 제품의 면역원성 효과를 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 수행된다.

제공된 모든 백분율은 달리 명시되지 않는 한 부피당 부피(v/v)이다.

실시예 1

본 연구의 목적은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 균주의 정체를 확인하고 추가 실험을 위한 작업 스톡을 설정하는 것이다.

GL713으로 지정된 Mhp의 북미 균주(활성 성분 PNEUMOSTAR MYCO)는 작업 스톡을 설정하는 데 사용된다. 실시예 1, 4 및 5의 경우, GL713의 X+4 계대의 0.5 mL 분취량을 사용하여 125 mL 배플이 있는 비-통기 폴리카보네이트 플라스크에 10% 돼지 혈청(HyClone 카탈로그 번호 SH30908.04)을 함유하는 25 mL Friis 배지(Teknova)를 접종한다. 오비탈 교반(100 rpm)으로 37℃에서 3일 후, 배양액 12.5 mL를 사용하여 500 mL 플라스크에 10% 돼지 혈청을 함유하는 100 mL Friis 배지를 접종한다. 3일 후, 10% 돼지 혈청과 함께 20% 글리세롤을 함유하는 100 mL Friis 배지를 배양물에 첨가하고 혼합한다. 혼합물을 분취(1 mL)하고 -80℃에서 동결하여 X+5 작업 시드를 확립한다. 제시된 연구 과정 동안, Mhp 배양물은 계대 X+6에서 접종원을 유지하기 위해 10% 돼지 혈청을 함유하는 신선한 Friis 배지에 3~4일마다 전달된다.

GL713 시드의 정체를 확인하기 위해 페놀-클로로포름 방법을 사용하여 게놈 DNA를 분리한다. 분리된 게놈의 품질과 양은 NANODROP(ThermoScientific) 및 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 평가된다. 아가로스 겔 전기영동은 8 kb 이상으로 실행되는 게놈 DNA의 존재를 보여준다. NANODROP 분석은 77.3 ng/uL의 게놈 DNA 수율을 보여준다.

중합효소연쇄반응(PCR) 방법으로 게놈 DNA를 분석하여 16S rRNA 유전자의 정체를 확인한다. 간단히 말해서, 50 uL PCR 반응 혼합물은 25 uL의 GREENTAQ HOT START GREEN PCR 마스터 믹스(ThermoScientific), 1 uL의 정방향 프라이머(5' GTAGAAAGGAGGTGTTCCATCC 3'; 서열번호: 1), 1 uL의 역방향 프라이머(5' ACGCTAGCTGTGTGCTTAAT 3'; 서열번호: 2), 20.0 uL의 H₂O 및 3 uL의 분리된 게놈 DNA를 사용하여 제조된다. PCR 증폭의 경우, 초기 변성 온도 95℃에서 3분간 수행한 후 포화 온도 95℃에서 30초간, 어닐링 온도 60℃에서 30초간, 및 확장 온도 72℃에서 1분간의 35주기를 수행한다. 최종 확장 단계는 72℃에서 10분 동안 진행된다. PCR 산물은 QIAQUICK PCR 정화 키트(Qiagen)를 사용하여 정제되었다. PCR 산물의 품질과 양은 NANODROP 및 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 평가되었다. PCR 증폭 결과 약 1600 bp의 PCR 산물이 나타났으며, 예상 크기는 1503 bp이다.

정제된 PCR 산물을 희석하고 프라이머와 혼합하여 시퀀싱 사전혼합 샘플(GenScript)을 생성한다. PCR 산물은 양쪽 말단끝에서 시퀀싱된다(즉, 정방향 및 역방향 프라이머를 모두 사용). 시퀀싱 후 Basic Local Alignment Search Tool을 이용하여 결과를 분석한 결과, GL713 16S rRNA 서열이 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 232(GenBank 수탁 번호 AE017332)와 99% 일치한 것으로 확인된다.

실시예 2

이러한 연구에 사용하기 위한 GL713의 스톡을 준비하기 위해, GL713의 X+1 계대의 1 mL 분취량을 사용하여 250 mL 배플이 있는 비-통기 폴리카보네이트 플라스크에 10% 돼지 혈청을 함유하는 50 mL Friis 배지를 접종한다. 오비탈 교반(100 rpm)과 함께 37℃에서 4일 후, 20% 글리세롤을 함유하지만 돼지 혈청은 함유하지 않는 15 mL 신선한 Friis 기본 배지를 배양물에 첨가하고 혼합한다. 각각 1 mL의 분취량을 -80℃에서 동결하여 X+2 프리-프리-마스터 시드를 확립한다. 10% 돼지 혈청을 함유하는 100 mL의 Friis를 각각 포함하는 3 x 500 mL 배플 플라스크를 접종하기 위해 1 분취량이 사용된다. 배양물을 100 rpm 오비탈 셰이킹과 함께 37℃에서 5일 동안 인큐베이션한다. 5일째에 3개의 플라스크를 합하여 300 mL 배양물을 생성한다. X+3에서의 프리-마스터 시드는 300 mL 배양물을 20% 글리세롤(돼지 혈청 없음)을 함유하는 300 mL 신선한 Friis 기본 배지와 결합하고 -80℃에서 1.25 mL 분취량에 저장하여 준비한다. 프리-마스터 시드는 전체-규모 CCU 분석을 사용하여 생존 가능성을 테스트하고, 호기성 및 혐기성 조건 및 실온 및 37℃ 모두에서 인큐베이션된 혈액 한천 플레이트를 사용하여 무균성을 테스트한다. 제시된 연구의 과정 동안, 계대 X+4에서 접종원을 유지하기 위해 10% 돼지 혈청을 함유하는 신선한 Friis 배지에 Mhp 배양물이 3~4일마다 전달된다.

X+2 프리-프리-마스터 시드의 전체-게놈 시퀀싱은 GL713의 정체를 추가로 확인하고 Mhp의 잠재적인 대사/영양 능력 또는 결핍을 식별하기 위한 경로 분석을 용이하게 하기 위해 수행된다.

고분자량 게놈 DNA는 페놀-클로로포름 방법을 사용하여 분리된다. 분리된 게놈의 품질과 양은 NANODROP 및 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 평가된다. 아가로스 겔 전기영동은 8 kb 초과의 게놈 DNA의 존재를 보여주며, NANODROP 분석은 377.6 ng/uL의 게놈 DNA 수율을 보여준다. 단리된 DNA는 ACGT, Inc.(Wheeling, IL, 미국). 시퀀싱 후 콘티그(contig)에 주석을 달고, BLAST에 의해 동일성을 위해 분석한다.

GL713의 시퀀싱은 페어드 엔드 시퀀싱에 의해 38,410,897개의 미가공 리드(raw read)를 생성하고, 메이트 페어 시퀀싱으로 3,102,689개의 리드를 생성한다. 최종 어셈블리는 5개의 콘티그(contig)를 나타낸다. GL713의 추정 게놈 크기는 862,838 bp이다. BLAST 분석은 GL713의 게놈 서열이 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 232와 99% 일치함을 보여준다.

실시예 3

이 연구의 목적은 대사 경로 분석을 통해 Mhp의 주요 대사 요구사항을 확인하는 것이다. 실시예 2로부터의 GL713 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 232(GenBank 수탁 번호 AE017332)의 게놈 서열을 하기 네 가지 접근 방식을 사용하여 분석한다:

생물정보학적으로, Mhp 게놈을 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 및 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii) 게놈과 비교함으로써 경로가 확인되고;

마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) GL713 및 232 게놈은 기존 대사 경로에 대해 수동으로 스캔되고;

경로 정보는 공개된 문헌(실리코 및 실험 연구 모두)에서 수집되고;

다른 마이코플라즈마 종, 특히 인간 마이코플라즈마에서 예측된 경로 정보를 Mhp 게놈 서열과 비교한다.

이 분석에 따르면, Mhp는 아미노산 합성을 위한 경로를 포함하지 않는 것으로 보이지만, 막에 여러 아미노산과 펩타이드 운반체가 있다. 따라서, Mhp는 아미노산 및/또는 펩타이드의 외부 공급원이 절대적으로 필요하다.

Mhp는 지질 합성 능력이 제한되어 있으며, 분리 가능한 지방산 생합성 경로가 없다. 따라서, Mhp는 지방산, 글리세롤, 글리세로포스포디에스테르 및 콜린의 외부 공급원이 절대적으로 필요하다. 콜레스테롤은 막 안정성에 필요할 가능성이 있으며, 세포 표면에 흡착될 수 있지만, 콜레스테롤을 활용하는 경로나 수송체는 확인되지 않았다.

Mhp는 DNA 및 RNA 작제물에 대한 퓨린과 피리미딘을 새로 합성하는 능력이 없다. 그러나, Mhp는 펜토스 인산 경로로 공급되는 L-아스코르베이트를 활용하는 경로를 가지고 있으므로 DNA 및 RNA 합성을 위한 포스포-리보스 전구체를 만들 수 있다. 따라서, Mhp는 구아닌, 아데닌, 시티딘, 우라실 및 티미딘의 외부 공급원과 L-아스코르브산염 또는 리보스의 외부 공급원이 필요하다.

Mhp는 글루코스 활용을 위한 완전한 경로를 가지고 있으며; 글루코스가 선호되는 탄소원인 것으로 보인다. 글루코스는 해당 경로로 들어가 피루베이트를 생성하며; 피루베이트는 아세트산염 경로로 들어가 최종 생성물로서 아세트산염을 생성하거나, 락테이트 경로로 들어가 최종 생성물로서 락테이트를 생성한다. 해당 경로와 아세트산염 경로 모두 ATP를 생성하고 락테이트 경로는 ATP 합성에 필요한 NAD를 재생한다. CCU 분석은 글루코스에서 락트산으로의 전환을 기반으로 하며, 이는 pH 변화로 이어지며, 결과적으로 배지에서 페놀 레드의 색상 변화를 초래한다. 따라서, Mhp는 배지에 글루코스가 필요하지만, Mhp는 막에 이러한 모든 탄소 공급원에 대한 수송체가 있기 때문에 만니톨, 프룩토스, 글리세롤, 만노오스, L-아스코르베이트와 같은 대체 탄소 공급원이 가능하다. 하나의 글루코스 공급원은 1~2 mM 글루코스를 함유하는 혈청일 수 있다. 그러나, Mhp는 기능적인 TCA 회로가 없기 때문에, TCA 회로 및 기타 글루코스 집중 경로가 없기 때문에 이. 콜리(E. coli)와 같은 높은 수준의 글루코스가 필요하지 않다.

이렇게 특성화된 모든 마이코플라즈마 종 중에서 Mhp만이 미오-이노시톨(myo-inositol) 이화 경로를 포함하는 것으로 보인다. 따라서, Mhp에서 미오-이노시톨은 탄소원 및 CoA의 전구체 역할을 할 수 있다. 미오-이노시톨의 수송체도 Mhp 막에 존재한다.

적절한 대사 활동에 필요한 보조인자 중 Mhp는 합성 수단이 없는 것으로 보이며, 따라서 테트라하이드로폴레이트, 4-포스포판토텐, 리보플라빈, 피리독살-5-포스페이트 및 피로인산티아민의 외부 공급원이 필요하다. 이와 유사하게, Mhp는 합성 수단이 없는 것으로 보이며, 따라서 이들 분자에 대한 막-통합 수송체가 Mhp에 존재하지만, 폴리아민 스페르민 및 푸트레신의 외부 공급원이 필요하다. 기타 잠재적인 영양 요구사항은 L-시스테인과 메티오닌을 포함한다.

경로 분석에서 얻은 대조 정보를 기반으로, 마이코플라즈마 성장 보충제(MGS)라는 보충제가 설계되었다. 이 보충제의 성분 및 그의 농도는 표 1에 설명되어 있다. 대조 경로 정보는 또한 하기 실시예에서 실험적으로 테스트된 기본 배지 및 기타 성분을 선택하는 데 사용할 수 있다.

실시예 4

본 연구의 목적은 절단 CCU 분석을 사용하여 하기 변수에 대한 반응으로 Mhp GL713의 성장을 평가하는 것이다.

1. 기본 배지: Vegetone 인퓨젼 브로쓰(Infusion Broth)(동물성 성분 없음; Sigma, cat. #41960), AF Friis(동물성 성분 없음; Becton Dickinson 실험 제형, 배치 #CRD17082), AF PPLO(동물성 성분 없음, Becton Dickinson 실험 제형, 배치 #CRD17079), Acutone(동물성 성분 없음, Neogen/Acumedia, cat. #7742A), Friis(소 뇌 심장 인퓨젼 함유; Teknova, cat. #F0485), 돼지 뇌 심장 인퓨젼(돼지 BHI; Becton Dickinson, cat. #BD256120) 및 Frey(췌장 소화액 함유; Becton Dickinson, cat. #212346). 이러한 배지들은 경로 분석으로부터의 정보를 기반으로 Mhp의 기본 영양 요구사항을 제공하도록 선택된다. 백신 제품의 글로벌 등록을 용이하게 하기 위해 동물이 없는 기본 배지가 포함된다.

2. 혈청 공급원: 돼지 및 말. 이전에 닭, 칠면조 및 토끼와 같은 다른 혈청 공급원이 마이코플라즈마 성장에 사용되었지만, 비용 분석에 따르면 이러한 혈청 공급원은 성장 배지 비용을 증가시킬 수 있으므로 테스트되지 않았다. 말 혈청(Sigma, cat. # HI138-500 mL)은 돼지 혈청과 비용면에서 비슷하다.

3. 돼지 혈청 수준: 1, 5 및 10%. 현재 일반적인 배지 제형인 Friis 마이코플라즈마 기본 배지(Teknova)는 성장을 위해 10% 돼지 혈청을 사용한다. 돼지 혈청이 없는 상태에서 Mhp가 성장하지 않는 경우, 배지에서 돼지 혈청을 감소시키면 Mhp 항원 제제에서 오염 항체의 다운스트림 제거가 쉬워질 수 있다.

4. 마이코플라즈마 성장 보충제(MGS): IX 및 2.5X.(표 1).

5. 미오이노시톨: IX, 2X 및 10X(SigmaAldrich). 대사 경로 분석은 Mhp가 미오이노시톨 이화작용을 위한 완전한 경로를 포함하고 있음을 보여주며, 이는 미오이노시톨이 Mhp 성장을 위한 에너지원으로 작용할 수 있음을 시사한다.

6. 피톤(Phytone) 선택: 경로 분석에 따르면, Mhp는 아미노산을 합성할 수 없으며, 아미노산 및 펩타이드에 대한 막 수송체를 암호화하는 유전자를 함유한다. DIFCO SELECT PHYTONE UF(Becton Dickinson, cat. #210931)는 동물성 성분이 없고 아미노산과 펩타이드의 공급원이 풍부하기 때문에, 이 영양소를 추가하면 Mhp 성장을 향상시킬 수 있다.

7. 효모 추출물: 효모 추출물(BD Biosciences)은 Mhp가 성장에 절대적으로 필요한, 펩타이드와 아미노산의 풍부한 공급원이다.

8. pH: 7.6 및 8.0. Wodke 등(Molecular Systems Biology 9: 653, 2013)에서, 저자는 Mhp가 pH 7.5에 비해 pH 8.0에서 더 많은 글루코스를 사용하고 더 많은 단백질을 축적한다는 것을 보여주었다.

9. 난황 추출물: 난황은 콜레스테롤, 지방산 및 아미노산이 풍부한 공급원이다. 이전에, 난황 추출물(SigmaAldrich)은 마이코플라즈마를 성장시키는데 성공적으로 사용되었다(Sasaki 등, Microbiol Immumol. 29(6): 499-507, 1985).

10. 글루코스: 1, 2, 3, 4 g/L. 일반적으로, 혈청에는 약 4 g/L의 글루코스가 함유되어 있으며, 경로 분석 정보에 따르면 글루코스는 Mhp의 주요 탄소원인 것으로 보인다. 따라서, 특히 혈청이 배지 제형에 포함되지 않은 경우, Mhp 성장에 대한 글루코스의 효과가 테스트된다.

11. 글리세롤: Mhp는 탄소원 및 지질 생합성의 전구체 역할을 할 수 있는 글리세롤의 대사 경로를 포함하며, Mhp 성장에 대한 글리세롤의 효과가 테스트되었다.

이러한 실험(실시예 4 및 5)을 위한 접종물을 준비하기 위해, 10% 돼지 혈청을 함유하는 100 mL의 Friis를 2 x 1 mL 냉동 X + 2 스톡이 있는 500 mL 배플 플라스크에 접종한다. Mhp는 3일 동안 성장하도록 허용된 다음, 전체 CCU 분석이 매우 노동과 공간 집약적이기 때문에 절단 CCU 분석을 사용하여 성장을 평가한다. 간단히 말해서, 테스트 샘플을 10배 연속 희석하고, 와류 혼합하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션한다. 최소 2개의 접종되지 않은 튜브가 음성 대조군으로 포함된다. 성장은 pH 이동으로 표시되며, 배지에서 페놀 레드의 색상이 적색에서 황색으로 바뀐다. Mhp 성장은 pH 이동을 유발하는 락트산 축적과 관련이 있다. 평가변수 역가는 Mhp 성장을 나타내는 최고 희석액(마지막)으로 표시된다.

다양한 변수를 사용하여 배지 제형의 시험 중 9 라운드를 수행한다. CCU 분석 결과는 준비 3일 후에 얻으며; 따라서, 어떤 경우에는 이전 실험의 결과가 알려지기 전에 다음 실험이 설정된다. 배양물은 또한 배양 3일차가 끝날 때 혈액 한천에서 무균(즉, 오염) 테스트를 받는다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 배지의 pH를 8.0으로 조정해도 pH 7.6에 비해 Mhp 성장이 향상되지 않고; Vegetone 인퓨젼 브로쓰와 선택 피톤은 Mhp 성장을 지원하지 않고; 말 혈청은 돼지 혈청을 대체하는 것으로 보이ㅁ며; MGS는 Mhp 성장을 향상시킨다는 것이다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 미오-이노시톨이 Mhp 성장을 향상시키는 것으로 보이지 않으며, 돼지 혈청이 포함된 Acutone(동물성 성분 없음)이 대조군보다 더 높은 성장을 지원한다는 것이다. 이 라운드의 결과는 또한 말 혈청이 돼지 혈청을 대체할 수 있고 MGS가 Mhp 성장을 향상시킨다는 것을 확인한다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 글루코스 추가가 Mhp 성장을 향상시키는 것으로 보이지 않으며, MGS가 Fris 기본 배지에서 성장을 향상시키지만 Acutone 기본 배지에서 성장을 향상시키지 않는다는 것이다.

이 변수 테스트에서 도출할 수 있는 결론은 미오-이노시톨 농도를 증가시키는 것이 Mhp 성장을 향상시키는 것으로 보이지 않는다는 것이다. Mhp는 대조군 배지에서보다 돼지 혈청이 있는 Acutone에서 더 잘 성장한 반면, 혈청이 없거나 말 혈청이 있는 경우 Acutone은 Mhp 성장을 지원하지 않는다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 MGS가 Fris 기본 배지에서는 성장을 향상시키지만 Acutone 기본 배지에서는 그렇지 않으며, Acutone은 돼지 혈청이 없는 경우 Mhp 성장을 지원하지 않는다는 것이다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 돼지 혈청 또는 말 혈청을 함유하는 돼지 BHI가 Mhp 성장을 지지하는데 있어서 Friis 배지와 매우 유사하게 작용한다는 것이다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 돼지 혈청 백분율을 1%로 감소시키는 것이 특히 Acutone 및 돼지 BHI에서 Mhp 성장을 방해할 수 있다는 것이다. 이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 또 다른 결론은 돼지 혈청 백분율을 5%로 감소시키는 것이 Mhp 성장을 지원하기 위해 Friis 기본 배지를 사용한 대조군과 매우 유사하게 행동하지만, 5% 돼지 혈청은 Acutone 및 돼지 BHI를 사용한 Mhp 성장을 지원하지 않는다는 것이다. 이 라운드는 Mhp 성장에 대한 MGS의 비효율적인 영향을 설명하는 몇 번 동결 및 해동된 MGS로 수행되었다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 AF Friis 배지는 돼지 혈청이 존재하는 경우 대조군 배지와 유사한 Mhp 성장을 지원하지만, 일반 Friis 배지와 달리 AF Friis 및 AF PPLO 배지는 말 혈청 및/또는 MGS를 사용한 Mhp 성장을 지원하지 않는다는 것이다.

이 변수 테스트 라운드에서 도출할 수 있는 결론은 AF Friis 배지는 돼지 혈청이 존재하는 경우 대조군 배지와 유사한 Mhp 성장을 지원하지만, 일반 Friis 배지와 달리 AF Friis 배지는 말 혈청, MGS 및/또는 효모 추출물을 사용한 Mhp 성장을 지원하지 않는다는 것이다.

실시예 5.

이 연구의 목적은 3개의 독립적인 실험에서 전체-규모 CCU 분석으로 실시예 4에서 확인된 잠재적인 배지 제형을 확인하는 것이다.

이러한 실험을 위한 접종물을 준비하기 위해, 10% 돼지 혈청을 함유한 Friis 100 mL를 2 x 1 mL 냉동 스톡이 있는 500 mL 배플 플라스크에 접종한다. 각 실험 배지 제형에 대해, 25 mL 배양물(최종 부피)에 3일 된 배양물의 20%(즉, 5 mL)를 시드한다. Mhp를 3일 동안 성장시킨 다음, 3개의 독립적인 실험 복제를 통해 전체-규모 CCU 분석을 사용하여 성장을 평가한다. 전체 규모 분석에서 샘플 희석액의 Mhp가 37℃에서 14~15일 동안 성장하도록 허용된다는 점을 제외하고, 전체-규모 CCU 분석은 절단 분석(실시예 4)과 동일한 방식으로 진행된다. 배양물은 또한 배양 3일차가 끝날 때 혈액 한천에서 무균(즉, 오염) 테스트를 받는다.

18개의 다른 배지 제형이 테스트된다:

제형 1: Friis + 10% 돼지 혈청 + MGS

제형 2: 변형된-돼지-BHI + 10% 돼지 혈청 + MGS

제형 3: Friis + 10% 돼지 혈청

제형 4: 변형된-돼지-BHI + 10% 돼지 혈청

제형 5: Friis + 10% 말 혈청 + MGS

제형 6: Friis + 10% 말 혈청

제형 7: Frey + 10% 말 혈청 + MGS

제형 8: 변형된-돼지-BHI + 10% 말 혈청

제형 9: Friis + MGS

제형 10: Frey + MGS

제형 11: 변형된-돼지-BHI + 10% 말 혈청 + MGS

제형 12: Frey + 10% 돼지 혈청

제형 13: 변형된-돼지-BHI + MGS

제형 14: Fey + 10% 말 혈청

제형 15: Acutone + 10% 돼지 혈청 + MGS

제형 16: Friis

제형 17: Acutone + 10% 말 혈청 + MGS

제형 18: Acutone + MGS

이 실험에서 돼지 뇌/심장 인퓨젼(돼지-BHI)은 표 11에 나타낸 바와 같이 제조업체(Becton Dickinson, cat. # BD256120) 지침에서 수정되었다.

도 1에 도시된 바와 같이, 제형 17(Acutone + 10% 말 혈청 + MGS) 및 제형 18(Acutone + MGS)을 제외하고, 제형은 대조군 제형, Friis + 돼지 혈청의 것과 필적하는 Mhp 성장을 지원하였다. 테스트되었지만 도면에 도시되지 않은 다른 배지 제형에는 Becton Dickinson, AF Friis 및 AF PPLO로부터의 두 가지 동물성 무함유 기본 배지가 더 있다. 이들 배지도 또한 돼지 혈청이 없을 때 Mhp 성장을 지원하지 않았다. 혈청이나 MGS가 없는 Friis 배지가 Mhp 성장을 상당히 잘 지원했지만; Friis에는 소 뇌 인퓨젼이 함유되어 있어 글로벌 제품 등록이 허용되지 않는 것이 흥미롭다. 도 1에는 도시되지 않은 바와 같이, Mhp는 혈청이나 MGS가 없는 m-BHI 및 Frey에서 저조하게 성장한다.

Mhp 성장을 지원하는 16가지 배지 제형 중, 5가지 배지 제형 - Friis + 10% 돼지 혈청(대조군, 제형 3), m-P-BHI + 10% 말 혈청 + MGS(제형 11), m-P-BHI + 10% 말 혈청 + MGS(매일 보충됨), m-P-BHI + MGS(제형 13), Frey + 10% 말 혈청 + MGS(제형 7) 및 Frey + MGS(제형 10)이 대규모(플라스크 규모와 반대되는) 발효기 시스템에서 추가 검증에 사용되었다.

실시예 6

이 연구의 목적은 상업적 제조 조건을 보다 밀접하게 모방하는, 대규모 발효기 시스템(Ambr 250, Sartorius)에서 플라스크 연구(실시예 5)에서 선택된 배지 제형을 비교하는 것이다. 이 실험에서 테스트한 변수는 다음과 같다:

1. 기본 배지: Friis(대조군), Frey 및 변형-돼지 뇌 심장 인퓨젼(m-P-BHI);

2. 혈청: 10% 돼지 혈청(대조군), 10% 말 혈청, 또는 무혈청; 및

3. MGS: 매일 보충하거나 초기 배양 시에만 보충.

이 실험을 위한 접종물을 준비하기 위해, 25 mL 배양물에 3일 동안 성장시킨 0.5 mL 작업 스톡을 접종한다. 이 "사전-접종물" 중 20 mL는 Friis + 10% 돼지 혈청 200 mL에 FoamAway 소포제(Gibco, 0.75 mL/L)를 접종하는 데 사용된다. 이 접종물을 1%(v/v) 비율로 발효기에 접종하기 위해 사용하기 전에 3일 동안 100 RPM 오비탈 셰이킹과 함께 37℃에서 인큐베이션한다.

6가지 다양한 배지 제형이 테스트된다:

제형 1: Friis + 10% 돼지 혈청(대조군);

제형 2: m-P-BHI + 10% 말 혈청 + MGS;

제형 3: m-P-BHI + 10% 말 혈청 + MGS (매일 보충됨);

제형 4: m-P-BHI + MGS;

제형 5: Frey + 10% 말 혈청 + MGS; 및

제형 6: Frey + MGS.

Mhp는 6가지 제형 각각에서 4일 동안 배양된다. 전체-규모 CCU 분석은 매일 수행된다. 3일차가 끝나면, 분취량을 취하고 혈액 한천에 대한 무균(즉, 오염) 테스트를 받는다. 4일 배양이 끝나면, 실시예 7에 기술된 바와 같이 단백질체학 분석을 위해 Mhp를 수집한다.

도 2에 도시된 바와 같이, Mhp는 Frey + 10% 말 혈청 + MGS(제형 5), m-P-BHI + 10% 말 혈청 + MGS(제형 2), 및 m-P-BHI + 10% 말 혈청 + MGS(매일 보충됨)( 제형 3)는 대조군 제형 1, Friis + 10% 돼지 혈청과 매우 유사하다. 그러나, m-P-BHI의 + MGS 및 Frey + MGS에서의 Mhp 성장은 대조군 배지에 비해 저조하다. 실시예 5의 플라스크-규모 연구와의 차이점에 대한 한 가지 가능한 설명은 Mhp 성장에 대한 선택된 배지 제형의 극단적인 효과를 식별하기 위해 발효기 연구가 1%의 매우 낮은 접종물로 수행된다는 것이다.

실시예 7.

이 연구의 목적은 선택된 배지 제형에 돼지 혈청 및/또는 동물 유래 성분이 없으면 Mhp의 글로벌 단백질 프로필을 유의하게 변경하여, 세포의 항원 특성을 감소시키고 백신 제품의 면역원성 효과를 감소시킬 수 있는지 확인하는 것이다.

실시예 6에 설명된 발효기 배양물에서 대략 80 mL가 수집되었으며, 4℃에서 30분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 1 mL의 빙냉된 PBS로 한 번 세척한 다음, 8M 요소, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0에 1시간 동안 용해한다. 단백질체학 분석을 위해 세포 용해물을 MSBioWorks(Ann Arbor, MI, USA)에 제출한다.

선택된 배지 제형에서 성장한 Mhp의 단백질 발현 프로필은 Friis 플러스 돼지 혈청에서 자란 Mhp(대조군)와 매우 유사하다. 이 데이터는 선택된 배지 제형에서 돼지 혈청의 부재가 Mhp의 단백질 발현 프로파일을 변화시키는 것으로 나타나지 않음을 시사한다. 선택된 배지 제형에서 성장한 Mhp는 Friis ＋ 돼지 혈청에서 성장한 Mhp와 유사한 면역원성을 보유할 수 있지만, 이것은 실험적으로 확인된다. 생체 내 면역원성 효능을 위해 Mhp를 성장시키는 데 사용될 최종 배지 제형의 조성이 표 12에 설명되어 있다.

실시예 8.

이 연구의 목적은 Mhp(X+3 스톡)가 최종 배지 제형에서 성장할 때 조합 Mhp 및 돼지 써코바이러스 유형 2(PCV-2) 백신의 Mhp 분획의 효능을 평가하는 것이다. 백신접종-챌린지 실험은 통제된 무작위 및 단일-맹검 연구이다.

실험용 백신을 제조하기 위해, Sf9 MCS 세포(곤충 세포주)에서 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 PCV2 바이러스-유사 입자를 제조한다. PCV2 항원(50 μg/ml 최종 농도)을 함유하는 상청액을 희석제 대조군 또는 비활성화된 Mhp와 혼합한 다음, 50%-50% 최종 농도에서 W/O/W 제형을 첨가한다.

실험적 Mhp 백신은 (1) 치료 그룹의 평균 폐 경화가 음성 대조군(그룹 1)에 비해 40% 초과 감소하고, (2) 백신접종의 완화된 부분이 0.35 초과이고, (3) 완화된 부분의 하위 95% 신뢰 구간이 0.2 초과인 경우에 효과적인 것으로 간주된다. 3~4주령 돼지에서, 음성 대조군 동물의 접종 후 폐 경화는 폐의 8~15%(그룹 평균 반응)로 예상된다. 긍정적인 백신 영향은 대조군과 비교하여 백신접종자의 그룹 평균 반응의 감소와 동일하다. 백신접종에서 폐 병변의 감소는 적어도 40%여야 한다. 데이터 세트는 백신접종 그룹의 동물로부터 기록된 폐 경화 퍼센트를 악성 Mhp 챌린지 이후에 백신접종되지 않은(음성 대조군) 그룹의 동물로부터 기록된 폐 경화 퍼센트와 비교함으로써 통계적 유의성에 대해 테스트된다(양측 p<0.05). 챌린지 물질은 대조군 배지에서 성장한 GL713이다. 대조군(그룹 7)에 대한 연구용 백신 그룹(그룹 1~5)에 대한 완화된 분획 및 관련 95% 신뢰 하한(LCB)은 폐 경화 백분율에 대해 추정된다. 그룹 6은 양성 대조군으로 포함된다.

실험의 주요 결과는 부검에서 검사되고 동물의 총 폐 크기의 백분율로 기록된 접종받은 동물의 폐 경화의 양이다. 도 3에 도시된 바와 같이, PCV-2 항원만 백신접종한 동물은 예상대로 악성 Mhp의 챌린지로부터 보호되지 않는다. Mhp가 돼지-BHI + HS + MGS에서 성장하고 2-브로모에틸아민을 4 mM의 최종 농도로 첨가하여 비활성화되고 백신으로 제형화될 때, Mhp 항원은 백신접종이 피내로 또는 근육내로 투여되었는지 여부에 관계없이, 악성 Mhp에 대한 챌린지로부터의 보호를 제공한다. 그러나, Frey 기본 배지 + HS + MGS에서 성장한 Mhp로부터의 항원은 근육내로 투여될 경우에만 효과적이다. 세 가지 효과적인 Mhp 백신은 양성 대조군 백신과 유사하거나 더 나은 효능을 보여준다.

매일의 임상 관찰을 평가하고 실험의 2차 결과로 보고한다. 표 15. 추가로, 상이한 실험 백신의 면역화 부위의 주사 부위 병변 및 육류 품질은 기준선 도축 중단 데이터를 확립하기 위해 부검에서 평가된다.

최종 연구 변수는 실험 배지 제형에서 성장할 때 Mhp 항원 분획이 Mhp와 PCV-2 항원이 결합된 경우 PCV-2 항원의 면역원성을 방해하는지 여부를 결정하는 것이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 피내 투여된 Mhp(Frey) + PCV2가 다시 차선책으로 수행되었지만, 모든 실험 백신은 돼지에게 투여될 때 항-PCV2 항체를 유도할 수 있다. 그룹 2~4의 백신은 PCV2 대조군, 그룹 1과 비슷한 방식으로 반응한다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> Elanco US Inc <120> MYCOPLASMA MEDIA FORMULATIONS <130> P21680 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mhyo-PCR-16S-rRNA Forward primer <400> 1 gtagaaagga ggtgttccat cc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mhyo-PCR-16S-rRNA Reverse primer <400> 2 acgctagctg tgtgcttaat 20

Claims (15)

1. 조성물로서,
   염화콜린, 나이아신아미드, 니코틴산, L-메티오닌, L-시스테인, 푸트레신 이염산염, 피로인산티아민, L-아스코르브산나트륨, 스페르민, 피리독살 5'-인산 일수화물, 테트라하이드로엽산, 3'-데포스포코엔자임 및 리보플라빈을 포함하며,
   상기 조성물은 마이코플라즈마 성장 보충제("MGS")인, 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 마이코플라즈마(Mycoplasma)가 마이코플라즈마 하이오시노비에(M. hyosynoviae); 마이코플라즈마 수이스(M. suis); 마이코플라즈마 하이오히니티스(M. hyorhinitis), 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, "Mhp")로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 마이코플라즈마가 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)인, 조성물.
4. Frey의 배지 및 돼지 뇌 심장 인퓨젼(p-BHI) 배지로 구성된 군으로부터 선택된 기본 배지;
   말 혈청; 및
   마이코플라즈마 성장 보충제
   를 포함하는 배지내에 마이코플라즈마를 넣는 단계를 포함하는, 마이코플라즈마를 배양하는 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 마이코플라즈마가 마이코플라즈마 하이오시노비에(M. hyosynoviae); 마이코플라즈마 수이스(M. suis); 마이코플라즈마 하이오히니티스(M. hyorhinitis), 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae, "Mhp")로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
6. 청구항 4에 있어서, 상기 마이코플라즈마가 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)인, 방법.
7. 청구항 4에 있어서, 상기 말 혈청이 약 2.5% 내지 약 10% v/v로 존재하는, 방법.
8. 청구항 4에 있어서, 상기 말 혈청이 약 5% 내지 약 10% v/v로 존재하는, 방법.
9. 청구항 4에 있어서, 상기 말 혈청이 약 10% v/v로 존재하는, 방법.
10. 청구항 4에 있어서, 상기 MGS의 성분이
    약 0.5 mg/L 염화콜린;
    약 0.025 mg/L 나이아신아미드;
    약 0.025 mg/L 니코틴산;
    약 0.1 mM L-메티오닌;
    약 1.5 mM L-시스테인;
    약 0.1 mM 푸트레신 이염산염;
    약 0.01 mg/L 피로인산티아민;
    약 0.284 mM L-아스코르브산나트륨;
    약 0.1 mM 스페르민;
    약 0.025 mg/L 피리독살 5'-인산 일수화물;
    약 0.05 mg/L 테트라하이드로엽산;
    약 0.025 mg/L 3'-데포스포코엔자임 A; 및
    약 0.01 mg/L 리보플라빈
    의 최종 농도로 존재하는, 방법.
11. 청구항 4에 있어서, 상기 마이코플라즈마는 37℃에서 3~15일 동안 배양되는, 방법.
12. Frey의 배지 및 돼지 뇌 심장 인퓨젼(p-BHI) 배지로 구성된 군으로부터 선택된 기본 배지; 말 혈청; 및 마이코플라즈마 성장 보충제를 포함하는 배지에서 마이코플라즈마를 배양하는 단계;
    37℃에서 마이코플라즈마를 인큐베이션하는 단계; 및
    마이코플라즈마를 비활성화시키는 단계
    를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 마이코플라즈마를 비활성화시키는 단계가 2-브로모에틸아민으로 수행되는, 방법.
14. 마이코플라즈마에 의해 유발되는 질환을 예방, 감소 또는 개선하기 위한 의약의 제조에 있어서의 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 MGS의 용도.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 의약이 돼지 치료용인, 용도.

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