CN104804074B - 一种菌丝霉素突变体及其基因、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菌丝霉素突变体，编码该菌丝霉素突变体的基因以及该菌丝霉素的制备方法及其应用，所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示，所述菌丝霉素突变体的编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示。本发明还公开了所述菌丝霉素突变体的融合蛋白以及融合蛋白的编码基因。与现有的菌丝霉素相比，本发明制备所得的菌丝霉素突变体具有更高的抑菌活性，所述菌丝霉素具有用量少，抑菌效果更强的技术效果，具有广阔的医药应用前景。

Description

一种菌丝霉素突变体及其基因、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种菌丝霉素（Plectasin）的突变体多肽及其基因、制备方法和应用。
背景技术
寻找新型抗菌制剂已成为一个迫在眉睫的问题，防御素以其独特的抗菌机制，抗菌谱广和不易产生耐药性以及来源安全等优点，日益受到人们的重视，成为传统抗生素的理想替代品。2005年，Mygind等（Mygind PH,Fischer RL,Schnorr KM,et al.Plectasin isa peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus[J].Nature,2005,437(7061):975-980.）从腐生子囊菌中分离得到了菌丝霉素，被认为是首例真菌防御素，继而引起了人们极大的关注。Schmitz J(Schmitz J,HolzgrabeU.Plectasin-a new peptide antibiotic with high therapeutic potential[J].PharmUnserer Zeit,2010,39(5):336-338.)通过研究发现，菌丝霉素是通过干扰细菌细胞壁的合成来抑制或杀死细菌，对革兰氏阳性菌抑菌效果明显。研究发现，菌丝霉素在生理条件下就有很高的活性；血清稳定性好，半衰期可延长，不易刺激细胞产生炎症反应；对哺乳动物细胞的毒害性小；最小抑菌浓度和最小杀菌浓度几乎相同，能快速杀灭细菌；与万古霉素作用于细胞壁的方式不同，不会产生交叉耐药性，因此，菌丝霉素可以作为一种具有治疗革兰氏阳性菌巨大潜能的小肽抗生素。本实验室(梁文,胡又佳,朱宝泉等.菌丝霉素的高效表达、纯化及活性[J].中国医药工业杂志,2013,44(1):21-26.)在前期研究中成功构建了一株菌丝霉素的表达载体pYG330，实现了菌丝霉素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达，但其抑菌活性还有待进一步的提高。
发明内容
因此本发明要解决的技术问题就是：针对现有的菌丝霉素融合蛋白的抑菌活性较低的缺陷，提供了一种新的菌丝霉素突变体及其基因、制备方法和应用。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之一为：一种菌丝霉素突变体，其所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
本发明所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列的制备方法为本领域常规制备方法，所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列的制备方法较佳地为通过表达分离纯化制备或者通过人工合成氨基酸序列制备即得。本发明所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列优选地为（如序列表中SEQ ID NO:2所示）：
GFCGNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCDKGGFVCKCY。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之二为：一种菌丝霉素突变体的编码基因，其所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示。
本发明所述菌丝霉素突变体的基因的核苷酸序列的制备方法为本领域常规制备方法，所述菌丝霉素突变体的基因核苷酸序列的制备方法较佳地包括聚合酶链式反应（PCR）扩增制备，或者人工合成该核苷酸序列制备即得，本发明所述菌丝霉素突变体的基因的核苷酸序列优选地为（如序列表中SEQ ID NO:3所示）：
5’-GGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGATGATATGCAGTGCCACAACCACTGCAAATCTATCAAAGGTTACAAAGGTGGTTACTGTGATAAAGGTG GTTTTGTTTGCAAATGTTAC-3’。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之三为：一种菌丝霉素突变体融合蛋白，其中所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序列从N端到C端依次为：保护肽段氨基酸序列，蛋白分离纯化标签氨基酸序列，蛋白酶的酶切位点氨基酸序列以及SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
本发明所述的菌丝霉素突变体的融合蛋白，是指在菌丝霉素突变体的氨基酸序列的N端或C端添加一个或多个氨基酸残基的融合蛋白质。其中“多个”更佳地是指2～200个氨基酸残基。所述氨基酸残基组成的肽段较佳地是保护肽，所述保护肽是指新生肽链N端或C端的一段由多个氨基酸残基组成的肽段，该肽段的主要功能是降低菌丝霉素突变体对表达菌株的细胞毒性，并提高宿主对菌丝霉素突变体的表达效率。保护肽段与目的菌丝霉素突变体形成的菌丝霉素融合蛋白经表达纯化后，由特定的蛋白酶切割后经分离纯化步骤去除保护肽片段和蛋白酶，即可得到具有生物活性的菌丝霉素突变体。
本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序列较佳地包括蛋白分离纯化标签，所述蛋白分离纯化标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的多肽或蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和分离纯化等目的。其中所述蛋白分离纯化标签较佳地包括：His tag、FLAG tag、MYC tag、SBP tag、CBP tag、GST tag、EGFP tag，更佳地为His tag（组氨酸标签）。
本发明所述蛋白酶的酶切位点为本领域常规使用的蛋白酶切位点，其中所述蛋白酶酶切点较佳地为TEV酶识别位点，经TEV酶进行识别和切割，去除保护肽段和TEV酶，即得到具有生物活性的菌丝霉素蛋白。
本发明所述TEV酶切中的TEV蛋白酶(TEV Protease)是指来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的Nla蛋白酶经改进后的28kDa的蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列，最普通的识别位点为ENLYFQG，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间。蛋白酶在G/S(或P1`)位点切割多种氨基酸序列，为切割后C端融合部分提供一个想要的N端氨基酸。切割后也很容易利用其N端的HQ标签进行TEV蛋白酶清除。也可以从固定在树脂上的融合蛋白切除掉目的蛋白。本发明所述TEV酶活性较佳地为11.5U/mg，所用TEV酶和底物菌丝霉素突变体融合蛋白的质量比较佳地为0.125︰1～2︰1，更佳地为2︰1。TEV蛋白酶在较宽的温度范围内都有很好的蛋白酶活性，本发明所述TEV酶切的温度较佳地为4～37℃，更佳地为34℃；TEV酶切时间较佳地为0.5～6小时，更佳地为2小时。
本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序优选地为（如序列表中SEQ ID No:4所示）：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSENLYFQGSGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCDKGGFVCKCY。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之四是：一种菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因，其所述的菌丝霉素突变体的编码基因是编码本发明所述的菌丝霉素突变体融合蛋白的基因。
本发明根据已发表的plectasin在腐生子囊菌中的核苷酸序列（Per H.Mygind,Rikke L.Fischer,Kirk M.Schnorr et al，Plectasin is a peptide antibiotic withtherapeutic potential from a saprophytic fungus[J].Nature,437（13），October2005:975-980），再参照大肠杆菌密码子偏好性使用表，设计合成了表达菌丝霉素并包括His-tag和TEV酶酶切位点的菌丝霉素融合蛋白基因序列，本发明以该序列为模板，采用易错PCR技术，得到一种表达菌丝霉素突变体融合蛋白的基因序列。
本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因核苷酸序列较佳地是由在上述核苷酸序列中通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加核苷酸提供一个衍生的多聚核苷酸并且同样能编码如本发明所述的融合蛋白的同系物基因。本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因的核苷酸序列优选地为（如序列表中SEQ No:1所示）：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTGAAAACCTGTACTTCCAGGGATCCGGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGATGATATGCAGTGCCACAACCACTGCAAATCTATCAAAGGTTACAAAGGTGGTTACTGTGATAAAGGTGGTTTTGTTTGCAAATGTTAC。
本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白编码基因核苷酸序列的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括利用PCR反应扩增制备或者人工合成所述核苷酸序列制备即得。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之五是：一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因或者本发明所述的菌丝霉素突变体的编码基因。
本发明所述的重组表达载体可通过本领域常规方法制备。所述制备方法为：将本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白基因或者菌丝霉素突变体基因连接于各种表达载体上构建而成。本发明所述的表达载体较佳地为本领域常规的各种载体，更佳地包括：pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pMBL、pET-28a，pET-30a、pET-32a、pET32a（+）-TEV、pMAL-p2x、pGEX、pMBP、pKK223等）、粘粒（pHZ132）、真核表达载体：pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、pPIC9K、CMV4，优选地为pET32a（+）-TEV，所述质粒的制备方法为本领域常规制备方法或者为市售可得。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之六是：一种重组表达转化体，该重组表达转化体包含本发明所述的菌丝霉素突变体编码基因或者本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因或者本发明所述重组表达载体。
本发明所述的重组表达转化体可通过将本发明所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且该重组表达载体所携带的菌丝霉素突变体融合蛋白的基因或菌丝霉素突变体的基因可被有效表达即可，其中所述重组表达转化体较佳地为原核表达系统或真核表达系统。本发明所述的宿主菌株更佳地为本领域常用的工程细菌，更佳地选自大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α、E.coli TB1、E.coliJM105和E.coli JM109（DE3）中的一种或几种，优选地为(E.coli)BL21(DE3)。
本发明所述重组表达转化体的制备方法较佳地为将包含本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因或者菌丝霉素突变体的编码基因的重组表达载体，通过热击法或电穿孔法转化到宿主体内建立重组表达转化体，所述制备方法更佳地是利用热击法对宿主细胞行转化，热击温度较佳地为40～42℃，热击时间较佳地为60～90秒。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之七是：一种菌丝霉素突变体融合蛋白的制备方法，其中所述制备方法包括以下步骤：培养本发明所述重组表达转化体表达菌丝霉素突变体融合蛋白，收集包含菌丝霉素突变体融合蛋白的溶液即得。
其中所述培养重组表达转化体中使用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的霉丝菌素突变体融合蛋白的培养基。当所述技术方案选择的宿主菌为大肠杆菌（E.coli）时，所述培养基较佳地为LB培养基，LB培养基的成分包括：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生菌丝霉素突变体融合蛋白即可，较佳地可以在摇床中震荡200～300rpm，37℃进行培养。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。本发明所述菌株为大肠杆菌，培养方法较佳地包括以下步骤：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养。所述培养条件为：培养物的OD600较佳地为0.4～0.6，更佳地为0.5～0.6，优选地为0.6，之后在培养基中加入IPTG进行诱导表达，所述IPTG的添加浓度较佳地为0.05～1.0mmol/L，更佳地为0.5～0.8mmol/L，优选地为0.8mmol/L，诱导表达时间较佳地为1～6小时，更佳地为2～4小时，优选地为3小时。本发明所述的IPTG为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，IPTG的制备方法为本领域常规制备方法或者通过商业购买所得。
本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的制备方法较佳地还包括将菌丝霉素突变体融合蛋白分离纯化的步骤，其中所述分离纯化步骤为本领域常规的蛋白质分离纯化技术手段，较佳地包括：根据蛋白质分子大小不同采取超滤法、透析法、凝胶过滤法、超速离心法；根据蛋白质分子所带电荷差异采取离子交换层析法，电泳法，等电聚焦法；根据蛋白质分子疏水性不同，采用疏水层析、反相色谱法；根据蛋白质分子不同分离纯化标签采用亲和层析等方法；或者为沉淀法。本发明中菌丝霉素突变体融合蛋白的分离纯化方法优选地为镍柱分离纯化法，其中所述镍柱分离纯化法所利用的洗脱缓冲液的咪唑浓度较佳地为60～300mM，更佳地为200mM。收集咪唑浓度为200mM的洗脱液，将所得洗脱液浓缩冻干即为所述菌丝霉素融合蛋白。
为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之八是：如上所述的菌丝霉素突变体或菌丝霉素突变体融合蛋白在制备抗细菌感染药物中的应用。
本发明所述菌丝霉素突变体或菌丝霉素突变体融合蛋白可以作为活性成分用于制备抗细菌感染的药物。所述的“活性成分”是指具有预防或治疗细菌感染功能的化合物。所述菌丝霉素突变体或菌丝霉素突变体融合蛋白可以和一种或多种药用载体制备抗细菌感染的药物。在该药物中，所述菌丝霉素突变体或菌丝霉素突变体融合蛋白可以单独作为活性成分或和其他具有抗细菌感染活性的化合物一起作为活性成分。其中所述的药用载体为本领域常规药用载体，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等，所述药用载体的制备方法为本领域常规制备方法或者市售可得。
本发明所述的细菌感染的药物较佳地为一种药物组合物，所述药物组合物的剂型没有特别限制，为本领域常规剂型。所述药物组合物的剂型较佳地是固体、半固体或液体。所述药物组合物的剂型也可以是水溶液、非水溶液或混悬液。所述药物组合物的剂型更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂。所述药物组合物的给药途径为本领域常规的给药途径，所述给药途径较佳地为注射给药或口服给药。其中所述注射给药的方式较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径。
本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，给药次数较佳地为一天一次或数次。在预防或治疗细菌感染时，本发明所述的药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。
本发明所述的细菌感染是由本领域常规的致病菌所引起的，所述致病菌较佳地包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，更佳地为革兰氏阳性菌，优选地为由枯草芽孢杆菌。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种新的菌丝霉素突变体，其基因序列进而氨基酸序列在国内外均未见报道。本发明提供了一种菌丝霉素突变体的制备方法，获得了比现有的菌丝霉素抑制枯草芽孢杆菌活性更高的菌丝霉素突变体，该菌丝霉素突变体具有良好的医药开发应用前景。
附图说明
图1为利用易错PCR方法构建重组质粒的过程示意图。
图2为易错PCR条件的优化电泳图。其中泳道M表示Marker，Mg2+浓度（mM）分别为：泳道1中Mg2+浓度为0，泳道2中Mg2+浓度为5mM；泳道3中Mg2+浓度为10mM；泳道4中Mg2+浓度为15mM；泳道5中Mg2+浓度为18mM；泳道6中Mg2+浓度为20mM。
图3为pET-32a(+)-TEV双酶切及纯化电泳检测结果图。图3（a）中泳道M为Marker；泳道1和2为质粒pET-32a(+)-TEV经SalI和BamHI双酶切后的电泳图谱；泳道3为pET-32a(+)-TEV经SalI和BamHI双酶切前的电泳图谱。图3（b）泳道1和2为质粒pET-32a(+)-TEV经SalI和BamHI双酶切后的纯化电泳图；泳道M为Marker。
图4为易错PCR纯化产物双酶切及纯化电泳检测结果图。图4（a）泳道1和2为易错PCR片段双酶切3.5h小时后的电泳图谱；泳道M是Marker。图4（b）泳道1和2为易错PCR片段酶切后纯化的电泳图谱；M是Marker。
图5为不同菌液PCR电泳检测结果图。泳道M为Marker；泳道1～7分别为不同菌液的PCR鉴定结果图谱。
图6为7种小肽的突变体与菌丝霉素的核苷酸序列对比结果图。
图7为7种小肽的突变体与菌丝霉素的氨基酸序列对比结果图。
图8为5种融合蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳检测结果图。其中泳道M为Marker；泳道1和2为野生菌表达的融合蛋白电泳图谱；泳道3为M-1表达的融合蛋白；泳道4为M-4表达的融合蛋白的电泳图谱；泳道5为M-6表达的融合蛋白电泳图谱；泳道6为M-7表达的融合蛋白电泳图谱。
图9为TEV酶酶切不同融合蛋白后所获得小肽的Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果图。其中泳道M为Marker；泳道1为菌丝霉素；泳道2为M-1小肽；泳道3为M-4小肽；泳道4为M-6小肽；泳道5为M-7小肽。
图10为小肽抑菌活性的检测结果图。其中1，菌丝霉素；2，M-1小肽；3，M-4小肽；4，M-6小肽；5，M-7小肽；6，Tris-cl(10mg/L，上样30μL)；7，Amp（100mg/ml，上样10μL）。
图11为M-1小肽和菌丝霉素抑菌活性的检测结果图。其中1，菌丝霉素；2，M-1小肽；3，Amp(100μg/ml，上样30μL)；4，Tris-cl(10mg/L，上样30μL)；5，Amp（100mg/ml，上样10μL）。
图12为小肽M-1与菌丝霉素的编码基因核苷酸序列对比结果图。
图13为小肽M-1与菌丝霉素的氨基酸序列对比结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
Mastercycler Gradient PCR仪（德国Eppendorf公司）、AKTA explorer蛋白纯化仪（美国GE Health公司）、JY92-II型超生细胞破碎仪（宁波新芝公司）、Bench Top Freeze-Dryer BT48B型真空冷冻干燥机（美国Millrock Technology公司。脱盐柱HistrapTMdesaulting(美国GE Health公司)。
枯草芽孢杆菌购买自北海群林生物工程有限公司。
用于扩增目的基因的PCR引物由上海英骏公司合成。
各种限制性内切酶、Taq酶、T4DNA ligase、DL2000DNA Marker和低分子量蛋白Marker均购自TaKaRa公司；标准分子量蛋白（分子量4100～66000，上海生工生物工程公司）；超滤管（截留分子量10000，Amicon Ultra公司）；Ni-NTA agarose（AOGMA公司）；GlassMilk试剂购买自Sigma公司；其他化学试剂均为分析纯，均购买自国药集团化学试剂有限公司。
LB液体培养基配方为（g﹒L-1）：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10（固体培养基含琼脂粉2%）pH7.0。
实施例1易错PCR扩增与突变文库的构建
本发明利用设计的引物，以质粒pYG330为模板（质粒pYG330的构建方法请参考已公开的中国专利申请：103374579A），探索易错PCR条件，确定易错PCR最适条件，构建突变体库。由于Mg2+在PCR过程中可以稳定非互补的碱基对；Mn2+能够增强聚合酶对模板的特异性，因而调整两种离子的浓度，可以获得不同突变频率的多样性文库。此外，降低退火温度、采用无热启动、无PCR结束后的延伸、循环次数增加的PCR扩增程序，也能够增加其错配率。将所得易错PCR产物与大肠杆菌表达载体pET-32a(+)-TEV进行连接，构建的突变菌株的表达质粒，本发明所述易错PCR重组质粒的构建过程如图1所示。所述的pET-32a(+)-TEV是一种常用的大肠杆菌表达载体质粒，带有His-Tag蛋白标签以及TEV酶酶切位点（质粒pET-32a(+)-TEV的构建方法请参考已公开的专利申请：103374579A）。
以菌丝霉素基因为模板基因。菌丝霉素（plectasin）的基因序列为：CCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTGAAAACCTGTACTTCCAGGGATCCGGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGATGATATGCAGTGCCACAACCACTGCAAATCTATCAAAGGTTA CAAAGGTGGTTACTGTGCTAAAGGTGGTTTTGTTTGCAAATGTTACTAGGTCGAC；
其中CCATGG为NcoⅠ酶切识别位点，CATCATCATCATCATCAC为HIS-TAG，GAAAACCTGTACTTCCAGGGA为TEV酶切识别位点，GGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGATGATAT GCAGTGCCACAACCACTGCAAATCTATCAAAGGTTACAAAGGTGGTTACTGTGCTAAAGGTGGTTTTGTTTGCAAAT GTTAC为菌丝霉素编码序列，GTCGAC为SalⅠ酶切识别位点。所述菌丝霉素基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。设计引物P1、P2，以质粒pYG330为模板，进行易错PCR反应。
P1：5’-CGGGATCC GGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGAT-3’，其中GGATCC为BamHⅠ酶切识别位点（如序列表中SEQ ID NO:5所示）；
P2：5’-CGCGTCGACCTAGTAACATTTGCAAACAAAACCACCTTTAGCACAGT-3’，其中GTCGAC为SalⅠ酶切识别位点（如序列表中SEQ ID NO:6所示）。
将在甘油冷冻管中保存的pYG330DH5α及pET-32a(+)-TEVDH5α菌液（pYG330DH5α菌株和pET-32a(+)-TEVDH5α菌株的构建方法请参考已公开的专利申请：103374579A）分别接种于含有100μg/ml Amp的LB液体培养基试管中37℃振荡培养过夜培养，以便提取质粒。利用质粒提纯试剂盒（购买自QIAGEN公司）进行质粒提取，质粒提取方法请参考该质粒提纯试剂盒的产品说明书。质粒提取方法包括以下步骤：吸取1.5ml菌液于Eppendorf离心管，离心（Eppendorf5415R小型冷冻高速离心机，12,000×1min），弃上清，真空吸干残余液体，将沉淀重悬于100μL Solution I，于漩涡混和器上振荡使菌体分散，冰浴10min。加入200μLSolution II，盖紧盖子后，颠倒管子数次，冰浴3～5min。加入150μl Solution III，剧烈摇动管子，冰浴3～5min。离心12,000×10min，将上清移至另一离心管，加入400μl异丙醇，室温放置10min。离心12,000×10min，弃上清，所得沉淀用70%冰冷乙醇洗涤后置于真空干燥器中干燥。最后加入20μl含RNase的TE溶解沉淀，所得质粒为pYG330，将所得质粒溶液在4℃或-20℃保存，备用。
易错PCR反应缓冲液的基础体系为：10×EX Taq Buffer(Mg2+Free)3μL；dNTPMix3μL；引物P1和P2各1μL；将提取的pYG330质粒稀释10倍作为模板，取模板1μL；EX Taq聚合酶1μL，用ddH2O补足30μL。PCR扩增条件为：（1）94℃3min；（2）94℃1min，45℃1min，72℃1min；其中步骤（2）重复50个循环。通过调整Mg2+的浓度和添加Mn2+来提高突变频率。由于本研究的目的基因片段较小且保守，前期探索使用Mg2+浓度为7mM，Mn2+浓度为0.5mM未发生碱基突变，因此分别选择PCR缓冲液中Mg2+浓度为0mM、5mM、10mM、15mM、18mM和20mM，Mn2+浓度为0.5mM进行易错PCR，扩增所得的目的基因片段全长为135bp，不同Mg2+离子浓度的PCR所得结果如图2所示，其中泳道M表示Marker，Mg2+浓度（mM）分别为：泳道1中Mg2+浓度为0，泳道2中Mg2+浓度为5mM；泳道3中Mg2+浓度为10mM；泳道4中Mg2+浓度为15mM；泳道5中Mg2+浓度为18mM；泳道6中Mg2+浓度为20mM。
扩增产物经纯化回收试剂盒（Nucleic Acid Purification Kit，购买自Axygen）纯化后，利用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ对易错PCR纯化产物和表达质粒pET-32a(+)-TEV分别进行消化3.5h，结果见图3所示，其中图3（a）中泳道M为Marker；泳道1和2为质粒pET-32a(+)-TEV经SalI和BamHI双酶切后的电泳图谱；泳道3为pET-32a(+)-TEV经SalI和BamHI双酶切前的电泳图谱。图3（b）泳道1和2为质粒pET-32a(+)-TEV经SalI和BamHI双酶切后的纯化电泳图；泳道M为Marker。图4为易错PCR纯化产物双酶切及纯化电泳检测结果图，其中图4（a）泳道1和2为易错PCR片段双酶切3.5h小时后的电泳图谱；泳道M是Marker。图4（b）泳道1和2为易错PCR片段酶切后纯化的电泳图谱；M是Marker。易错PCR产物双酶切产物采用1.5%浓度的凝胶进行电泳并采用上述核酸纯化回收试剂盒纯化，表达质粒pET-32a(+)-TEV双酶切产物采用1%浓度的凝胶进行电泳并采用GlassMilk法进行纯化（Glass milk试剂购买自Sigma），GlassMilk纯化方法包括以下步骤：将DNA电泳凝胶置于长波紫外灯下，切出含所需DNA片段的凝胶，装入一个预先称重的Eppendorf离心管，称出凝胶的重量。加入3倍体积的6mol/L NaI（0.1g凝胶加300μl），于50℃水浴保温5min。加入5μl GlassMilk，于漩涡混合器混匀。置于冰浴保持10min，并每隔1～2min振荡一次离心管，使DNA尽可能被Glass Milk吸附。离心（Eppendorf5415R小型冷冻高速离心机，15,000r/min×5s）沉淀Glass Milk，弃去上清液。加入200μl冷冻保存（-20℃）的New Wash缓冲液（由NaCl50Mm;EDTA2.5mM；Tris10mM（pH7.5）；乙醇50%（v/v）配制而成），于漩涡振荡混合器悬浮Glass Milk，离心（台式离心机同上，15,000r/min×5s）洗涤。此过程需要重复三次，最后一次洗涤应尽可能吸干残余在管底的New Wash缓冲液。加入5～10μl无菌蒸馏水，振荡使Glass Milk悬浮，放置50℃水浴保温5min，使吸附的DNA被解吸，离心（台式离心机同上，15,000r/min×5s），将洗脱液移入一个新的离心管，此步重复三次，并合并三次洗脱液，离心（台式离心机同上，15,000r/min×5s），将洗脱液移入一个新离心管，保存在-20℃冰箱中待用。将纯化产物在16℃连接过夜后，使用常规转化方法（化学转化法）转化至E.coli.BL21感受态细胞，涂布于LB（含100μg/ml的Amp）平板，培养12h，实验结果：6个平板均获得转化子3000～4000株，将所有转化子构成突变体库。
实施例2阳性克隆的筛选和鉴定
分别在实施例1所获得的6个平板上随机挑取单克隆20株，于37℃培养12h，经菌液PCR验证结果如图5所示，其中泳道M为Marker；泳道1～7分别为不同菌落的PCR鉴定结果图谱。由上海生工对所得克隆进行序列测定。测序结果显示当PCR缓冲液中的Mg2+浓度为15mM、18mM和20mM时，所得PCR均出现了碱基突变，其结果如表1所示。
表1不同Mg2+浓度下的易错PCR阳性转化子测序结果
其中当PCR缓冲的Mg2+浓度为15mM时所得转化子有2株发生了碱基突变，一株为颠换（92位碱基由C突变成了A），一株为无义突变；Mg2+浓度为18mM和20mM的转化子由于Mg2+浓度过高，导致转化子出现了碱基缺失。故又挑取Mg2+浓度为15mM平板上的转化子80株进行测序，结果有4株发生了碱基突变，因此，随机挑取Mg2+浓度为15mM平板上的转化子共100株，经测序发现其中共有7种菌株发生了碱基突变，分别记作M-1，M-2，M-3，M-4，M-5，M-6和M-7。突变菌株基因序列分析表明所得6个菌株发生了一个点突变，M-7菌株有两个点发生了突变，具体见图6（图6为7种小肽的突变体与菌丝霉素的核苷酸序列对比结果图。）、图7（图7为7种小肽的突变体与菌丝霉素的氨基酸序列对比结果图）和表2所示内容。
表2突变菌株的基因序列分析
所得PCR产物中的碱基突变频率为0.83%～1.67%，而且碱基突变均导致了氨基酸的变化，其中M-3、M-5、M-6突变情况相同，均为92位碱基由C突变成G，导致第31位氨基酸由Ala变成了Gly；M-2发生了无义突变，M-1的92位碱基由C突变成A，导致第31位氨基酸残基由Ala突变成了Asp；M-4的91位由G突变成A，导致第31位氨基酸由Ala突变成了Thr；M-7的88位碱基由T转化成A，第92位碱基由突变成A，导致第31位氨基酸Ala突变成了Aap，第30氨基酸由Cys突变成了Ser，故选择突变体M-1，M-4，M-6，M-7进行下一步的实验。
经过测序（上海生工生物工程公司），M-1的编码基因的核苷酸序列为：5’-GGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGATGATATGCAGTGCCACAACCACTGCAAATCTATCAAAGGTTACAAAGGTGGTTACTGTGATAAAGGTG GTTTTGTTTGCAAATGTTAC-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:3所示，小肽M-1与菌丝霉素的核苷酸序列对比结果如图12所示。
该基因编码的氨基酸序列为：GFCGNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCDKGGFVCKCY，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示，小肽M-1与菌丝霉素氨基酸序列对比结果如图13所示。
实施例3M-1、M-4、M-6、M-7及菌丝霉素的诱导表达以及初步分离纯化
将菌丝霉素表达菌株作为对照菌株（所述菌丝霉素表达菌株的制备方法请参考已公开的中国专利申请：103374579A），该菌株表达载体为pYG330、表达宿主为E.coli.BL21(DE3)。取2.5ml M-1、M-4、M-6、M-7以及上述菌丝霉素表达菌株过夜培养物接种至250ml LB培养基(含100μg/ml Amp)，37℃振荡培养2.5h至OD600为0.4～0.6，加入0.8mM IPTG诱导表达3h后，收集菌体。将诱导后的培养物离心（8000rpm×10min）获得菌体。用10ml NTA-0重悬，置于冰浴中超声破壁10min（500W，工作5s，间歇5s）。细胞破壁液于10，000r/min4℃离心20min（Hitachi Himac CR21G型冷冻高速离心机，转子R21A），取上清置于烧杯（25ml）中。加入2ml Ni-NTA树脂（购买自AOGMA公司）混悬液（含50％V/V树脂，保存于20％V/V乙醇溶液中），置于冰上，用脱色摇床120r/min振荡1h。装入层析柱，静置15min，上清液通过NTA柱，收集流出液用于电泳分析。依次用10ml NTA-10，10ml NTA-20，3ml NTA-60以及NTA-80洗涤层析柱，洗去未结合的杂蛋白。然后用2ml NTA-200洗脱目的蛋白，分4次洗脱，每次0.5ml，即得到多肽的融合蛋白。所得到的目的蛋白采用SDS-PAGE电泳进行检测，结果显示均表达出了大小约为25KD的融合蛋白，所得结果如图8所示，其中泳道M为Marker；泳道1和2为野生菌表达的融合蛋白电泳图谱；泳道3为M-1表达的融合蛋白；泳道4为M-4表达的融合蛋白的电泳图谱；泳道5为M-6表达的融合蛋白电泳图谱；泳道6为M-7表达的融合蛋白电泳图谱。
由于融合蛋白含有TEV酶切位点，故利用实验室的TEV酶表达菌制备获得TEV酶（TEV酶的制备方法请参见文献：Tropea JE,Cherry S,Waugh DS.Expression andpurification of soluble His(6)-tagged TEV protease[J].Methods Mol Biol,2009,498:297-307.）。将所获得的TEV酶和目的蛋白采用HiTrapTMDesalting色谱柱进行分离，将其中的咪唑去掉，替换成10mM Tris-Cl pH8.0，脱盐后进行真空冷冻干燥凝胶脱盐色谱柱为HiTrapTM Desalting5ml（购自GE Healthcare Bio-Sciences公司）。色谱柱分离方法包括以下步骤：Buffer为10mM Tris-Cl，pH=8.0，将样品经0.25μm滤膜过滤，上样量为1ml，流速为1.0ml/min，收集Au280吸收峰高的各管，由于采用亲和层析时使用的洗脱液中含有咪唑，因此获得的融合蛋白是溶解在含有咪唑的缓冲液中的，会影响酶切和后续的抑菌实验，故脱盐时采用10mM Tris-Cl，pH=8.0作为流动相，替换其中的咪唑成分。多次上样后合并各管冻干即得成熟蛋白。
根据文献报道的方法采取的蛋白酶切条件为（请参见文献：Tropea JE,Cherry S,Waugh DS.Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease[J].Methods Mol Biol,2009,498:297-307.）：TEV酶和目的蛋白的质量比为1:4，34℃酶切3h，4℃消化过夜。将所获得的蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图9所示，其中泳道M为Marker；泳道1为菌丝霉素；泳道2为M-1小肽；泳道3为M-4小肽；泳道4为M-6小肽；泳道5为M-7小肽。结果表明所得5种蛋白均酶切出了大小为20.3KD的大片段和4.7KD的小片段。将蛋白进行真空冷冻干燥处理后（蛋白处理方法同上所述TEV酶和目的蛋白的处理方法），将酶切反应液装入截留分子量为10,000Da的离心超滤管（购买自MILLIPORE公司）中，7500g离心10min，收集流出液体，即为目的小肽（分子量为4.7KD），所得目的小肽为：M-1、M-4、M-6、M-7及菌丝霉素野生菌株诱导表达后所纯化出的融合蛋白经TEV酶酶切后获得的菌丝霉素突变体和菌丝霉素。小肽含量采用Bradford法（检测方法请参考文献：Yang AG,MaoJF,Yao LB.Biochemistry and Molecular Biology Protocol[J].High EducationPress,Beijing,2001,255-257.）进行测定，对样品进行一定的稀释后，使蛋白溶液的浓度为2.56mg/ml，于-20℃保存。
实施例4采用琼脂扩散法对所得小肽进行抑枯草芽孢杆菌（ATCC82）活性检测
本发明利用的琼脂扩散法具体请参考文献：Moore JC,Jin HM,Kuchner O,etal.Strategies for the in vitro evolution of protein function:enzyme evolutionby random recombination of improved sequences[J].Journal of MolecularBiology,1997,272(3):336-347.
将枯草芽孢杆菌（购买自北海群林生物工程有限公司）接种于30ml LB培养基中，37℃摇床培养过夜；按1%接种量涂布在LB平板上，生长3h后，在平板表面放置灭菌后的滤纸片。取实施例3所得小肽的样品，小肽样品的使用浓度为2.56mg/ml，上样量为30μL；以氨苄青霉素作为阳性对照，氨苄青霉素的使用浓度为100mg/ml，其上样量为10μL；Tris-Cl作为阴性对照，Tris-Cl的使用浓度为10mM，其上样量为30μL。将平板正面向上37℃培养18～24h，观察抑菌效果如图10（图10所示的抑菌圈1-7分别为：1、plectasin；2、M-1；3、M-4；4、M-6；5、M-7；6、Tris﹒Cl；7、Amp）和图11（图11所示的抑菌圈1-5分别是：1、plectasin；2、M-1；3、Amp浓度为100μg/ml，上样量为30μL；4、Tris-Cl的浓度为10mg/L，上样量为30μL；5、Amp浓度为100mg/ml，上样量10μL）所示。所得样品对枯草芽孢杆菌的抑菌结果如表3和表4所示。
表3不同样品对枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小
表4M-1和对照对枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小
所得测试结果显示M-1小肽的抑菌作用明显高于出发菌株（如表3和表4所示），与传统抗生素氨苄青霉素相比，本发明所得M-1小肽的使用量更低，而且两组实验均显示出M-1小肽的抑菌圈直径大小为15mm，而对照融合蛋白为10mm，因此M-1小肽的抑菌较出发菌株产生的融合蛋白的抑菌活性提高了50%。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种菌丝霉素突变体，其特征在于，所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
2.一种菌丝霉素突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示。
3.一种菌丝霉素突变体融合蛋白，其特征在于，所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序列从N端到C端依次为：保护肽段的氨基酸序列，蛋白分离纯化标签的氨基酸序列，蛋白酶的酶切位点的氨基酸序列以及SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的菌丝霉素突变体融合蛋白，其特征在于，所述菌丝霉素突变体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
5.一种菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述的菌丝霉素突变体的编码基因是编码如权利要求3所述的菌丝霉素突变体融合蛋白的基因。
6.如权利要求5所述的菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2所述菌丝霉素突变体的编码基因或者如权利要求5所述的菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因。
8.一种重组表达转化体，其特征在于，该重组表达转化体包含如权利要求1所述的菌丝霉素突变体基因，或者如权利要求5所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因，或者如权利要求7所述重组表达载体。
9.一种菌丝霉素突变体融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：培养如权利要求8所述的重组表达转化体，表达菌丝霉素突变体融合蛋白，收集包含菌丝霉素突变体融合蛋白的溶液即得。
10.如权利要求1所述的菌丝霉素突变体或者如权利要求3所述菌丝霉素突变体融合蛋白在制备抗细菌感染药物中的应用。
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