CN112852794A

CN112852794A - 一种产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及应用

Info

Publication number: CN112852794A
Application number: CN202110067678.1A
Authority: CN
Inventors: 张辉; 包红朵; 周艳; 王冉; 庞茂达
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112852794B

Abstract

本发明提供了一种产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridiumperfringensphage)裂解酶及其作为抗菌物质在禽坏死性肠炎预防和食品污染控制中的应用，属于生物工程领域。本发明产气荚膜菌噬菌体裂解酶的氨基酸序列为SeqIDNO.2。利用生物工程技术开发能够高效杀灭产气荚膜梭菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活产气荚膜梭菌，为目前防治禽坏死性肠炎和控制食品中产气荚膜梭菌污染提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

Description

一种产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，Cp)是一种重要的人畜共患病原菌，不仅可以导致家禽的坏死性肠炎(NE)，给养殖业造成巨大的经济损失，还能够引起食物中毒，给人类健康带来巨大威胁。随着抗生素的广泛使用，产气荚膜梭菌对抗生素的耐药性不断增强，多重耐药现象明显，严重影响了抗生素的临床治疗效果。家禽是产气荚膜梭菌的主要宿主，其屠宰加工过程中往往会被产气荚膜梭菌污染，然而误食产气荚膜梭菌污染的食物能够引发食物中毒，可损伤细胞膜、血管内皮细胞并使糖类分解，导致细胞坏死、组织水肿、充气等病变，严重会导致死亡。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。裂解酶是双链DNA噬菌体所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌体表达的一类肽糖水解酶，该酶通过水解细菌细胞壁肽糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键最终使宿主细胞裂解。裂解酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较噬菌体广。裂解酶具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及应用，该裂解酶能够特异性的灭活产气荚膜梭菌，防治禽坏死性肠炎和控制食品中产气荚膜梭菌污染。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridiumperfringensphage)裂解酶，所述裂解酶氨基酸序列为Seq ID NO.2；核苷酸序列为Seq ID NO.1。

优选的是，扩增所述裂解酶核苷酸的引物为：5’-ATT GGATCC ATG CTG CTGATTAAC TGC-3’和5’-CTT AAG CTT TAA TTC AAC ACC TTTATG TTT-3’。

一种含有产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶核苷酸序列的质粒。

一种含有产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶核苷酸序列的质粒的重组菌。

优选的是，所述重组菌的原核细胞表达载体为pET28a；裂解酶基因插入到pET28a的Bam H I和Hind III酶切位点之间；重组菌菌为DE3(pET-Cps-Z1)。

产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在制备防治禽坏死性肠炎药物的应用。

产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在抑制食品产气荚膜梭菌污染或过度生长的应用。

优选的是，所述食品为由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

优选的是，将裂解酶与赋形剂复配后，用来抑制食品中产气荚膜梭菌的污染或过度生长。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

利用生物工程技术开发能够高效杀灭产气荚膜梭菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性灭活产气荚膜梭菌，为目前防治禽坏死性肠炎及控制食品中产气荚膜梭菌污染提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

附图说明

图1：裂解酶Cps-Z1表达产物的鉴定分析；

泳道1：纯化的Cps-Z1表达产物；泳道2：蛋白分子质量Maker；

图2：裂解酶Cps-Z1对产气荚膜梭菌的杀菌能力分析；

图3：裂解酶Cps-Z1在食品的中抑菌效果分析。

具体实施方式

本发明试验用噬菌体宿主菌产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，ATCC13124)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridiumperfringens phage) vB_CpeS_JS01，于2020年1月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2020047，该噬菌体为申请公布号CN111662880 A(申请公布日：2020.09.15) 公布的产气荚膜梭菌噬菌体。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

噬菌体基因提取

将噬菌体vB_CpeS_JS01裂解液用0.22μm滤膜过滤上清，分别加RNaseA和DNase I至噬菌体悬液，终浓度1μg/ml，37℃孵育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h；4℃离心10000×g·min^-1、30min，去上清；加5ml SM溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用30min；加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的 PEG和细胞碎片，振荡30s；4℃，3000×g·min^-1离心15min，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。

将制备的噬菌体悬液用λ噬菌体基因组快速提取试剂盒方法提取噬菌体基因组，具体按试剂盒说明进行。

实施例2

裂解酶Cps-Z1的克隆、表达载体的构建

a、根据裂解酶核苷酸序列(Seq ID NO.1)编码序列设计一对特异性引物：

CP-ZF:5’-ATT GGA TCC ATG CTG CTG ATT AAC TGC-3’

CP-ZR:5’-CTT AAG CTT TAA TTC AAC ACC TTT ATG TTT-3’；

以噬菌体基因组为模板用上述特异性引物扩增Cps-Z1基因全长序列，1％琼脂糖电泳，鉴定扩增片段的大小；

b、切胶纯化回收扩增的目的片段，并将该片段与pMD18-T载体于16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的平板，并将转化的阳性克隆进行测序鉴定，将其命名为裂解酶Cps-Z1基因，其核苷酸序列为Seq ID NO.1；

c、将测序列正确的片段用限制性内切酶Bam H I和Hind III进行双酶切，37℃，水浴孵育2h，1％琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将该片段与pET28a(+)载体于16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将转化的菌液涂布于含有卡那霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜；

d、挑取阳性克隆接种于含卡那霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，碱裂法提取质粒，用Bam H I和Hind III 进行双酶切鉴定，同时用BamH I单酶切的pET-28a(+)空质粒作为对照。将鉴定正确的质粒命名为pET-Cps-Z1，重组菌命名为DE3(pET-Cps-Z1)。

结果表明，重组质粒pET-Cps-Z1用Bam H I和Hind III进行双酶切后，分别在5.4kb和1.3kb处出现pET28a(+)载体和Cps-Z1编码基因，大小与预期相符，表明构建正确。

实施例3

裂解酶Cps-Z1蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌DE3(pET-Cps-Z1)接种到含卡那青霉素(100μg/mL) 的LB培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1:100比例转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600值约为0.5时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，28℃诱导6h。收集菌体，超声波破碎细胞，4℃， 10,000rpm/min离心10min，收集上清，并将上清经0.22μm滤膜过滤， SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表达情况。将过滤的裂解上清用His亲和层析镍柱(GE Healthcare,Sweden)纯化，具体按试剂盒说明步聚进行。获得表达产物Cps-Z1，将纯化的裂解酶Cps-Z1产物经去毒素试剂盒(Novagen公司)进行去毒处理(≤0.01EU/μg内毒素)。

SDS-PAGE分析结果如图1所示，重组菌DE3(pET-Cps-Z1)经 IPTG诱导后，其上清中在约50kD处有诱导蛋白条带，与预期大小相符，由此表明，重组菌DE3(pET-Cps-Z1)构建正确，且表达的裂解酶蛋白产物Cps-Z1为可溶性蛋白。

实施例4

裂解酶Cps-Z1作用谱系分析

将产气荚膜梭菌ATCC 13124及分离株共20株进行裂解谱鉴定，将菌株培养至OD₆₀₀≈0.6，用PBS洗涤后重悬，取10μl纯化的裂解酶产物，混匀，37℃作用4h，用酶标仪动态测定菌液的OD₆₀₀值(每次间隔30min)，OD₆₀₀的下降表明细菌被裂解，根据数据评价裂解酶对不同产气荚膜梭菌的裂解效力。

结果见表1及图2，19株菌在作用4h后，OD₆₀₀值从起始的0.6 下降至0.1及以下，与对照相比较，试管中菌液澄清。仅Cp17菌株在裂解酶作用至4h时下降至0.34，与对照相比较略微澄清。

表1裂解酶作用宿主谱系

实施例5

裂解酶在抑制食品产气荚膜梭菌污染和过度生长试验

将鸡肉切块分为两组，A组接种产气荚膜梭菌10⁵cfu/mL，加入 100μg的裂解Cps-Z1蛋白；B组中仅加入10⁵cfu/mL产气荚膜梭菌作为对照，同时设PBS作为空白对照。将制备好的样品分别置于4℃作用12h，每隔4h检测产气荚膜梭菌数量。

结果如图3所示，4℃作用4h后，宿主菌数量有所下降(2.52log)；至8h后，宿主菌数量下降约4.01log，至12h时，宿主菌数量下降4.97log，与对照组呈显著性差异，从而表明裂解酶Cps-Z1在食品中有良好的杀菌作用。

实施例6

裂解酶在禽养殖中的预防性抑菌试验

选取1日龄雏鸡30只，随机分为3组，每组10只。其中A组为对照组正常饲喂，B组正常饲喂同时用裂解酶Cps-Z1灌服， 50μg/0.1mL/只，连续灌服5天，C组正常饲喂并加氨苄青霉素饮水 (0.1％W/V)连续饮水5天；第10～14天再饲喂裂解酶和氨苄青霉素；分别在第19天用10⁹cfu/0.1ml/只进行产气荚膜梭菌(ATCC 13124) 感染，分别对鸡进行称重、取肠道分析坏死性肠炎发生状况进行评分 (0为正常小肠，1为肠道轻度黏液覆盖，2为严重坏死性肠炎)，统计总死亡率，结果参见表2。由表2可以看出，应用裂解酶组与应用抗生素组的肠道评分和死亡率均低于对照组。

表2噬菌体对鸡生长性能影响

裂解酶对雏鸡增重结果如表3所示，通过应用裂解酶组与应用抗生素组别在14天及19天的雏鸡增重均高于对照组。养殖19天中对照组死亡2只，裂解酶与抗生素组均无死亡，且肠炎评分均低于对照组。由此可见，应用裂解酶能够抑制细菌的生长，具有与抗生素相当的作用能力，能够有效的预防肠炎的发生。

表3噬菌体对雏鸡增重效果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgctga ttaactgccc ggaacacgtt gaaaactgtt ccagacttca gtacttcttc 60

gaacacaaag gtttcctgaa cgcctctcgt atcaccgccg aagttaacac cgttgatggt 120

ttcctggaaa aaatgaaccg ttaccacgac tatatcatcg tgatcgaacc gggcaccgaa 180

aaaccgtact tctacaacag caaaatcccc gtaagaaaat gccgaccaaa gaactggatg 240

atcagttcga attcgacttc aaaacctctt ttgatcgttg ccacgttcgt cgttgggaaa 300

aattcgacga taacatccac aacctggacg tacttcttcg aacacaaact gaacgccgtg 360

cgaccgaagt tcagggcatc gaaaccatta agaaaatcag cccgacctac atcctggcaa 420

ccaccaaact gtctggtact ggaaatgggc taccctccgg ttgtggtgat gtttccaaag 480

gtatcccgag caacaaatac taccgttacc ggaaaggtat cgaaggtctg gaccgtttta 540

ccaaagaaaa cgaaccgacc tacttcgcga aactgggtgc gccgccggtt tgcgaagtgc 600

tgtccagcca gaaaaaagac ggcctggatc acaaattcga tgcgtttgag tgcgacctgt 660

gctacaacac cggtttggct ggcgaacgaa agcgatatca aaagcgaatg gctggtttac 720

gcaatcatgc cgggttcttt cgaagaaggc atgggcaact accctccgct gcgccgtcgt 780

cgtaccgttg ccacgatcca cggcgatcgc ggtcagagca tcggtaccgt tgaaggcggc 840

tacatgatcg aatgtgaaaa cgtgaccgat aaatacttca ccgttgaagg cggccagaac 900

tggatcatgc cgaaaccatt agcagaaggt accgttagcg cgacctaccc ggtgtatcct 960

agcggtagcc cgcacagcgg cgtggatgtt tcctgcccgg aaggcacccc ggttcgtgca 1020

agcaaagatg gtgtgtgcat caaacgtcgc gaaatcacca gctacggtaa atacctgttt 1080

atcgaacaca tctacgctca caactctaaa ctgctgatca acgaaggtga cacctggcac 1140

gttaaagcgg gtgacatcat cgcgtacagc ggtaacaccg gtaactctac cggcgcgcac 1200

agccacttcg aaatccgcgt taacggcgtt gcaatcaacc cggcgccgaa cgcgaacctg 1260

aaagtgggcg acgtgatcaa acataaaggt gttgaataa 1299

<210> 2

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Ile Asn Cys Pro Glu His Val Glu Asn Cys Ser Arg Leu

1 5 10 15

Gln Tyr Phe Phe Glu His Lys Gly Phe Leu Asn Ala Ser Arg Ile Thr

20 25 30

Ala Glu Val Asn Thr Val Asp Gly Phe Leu Glu Lys Met Asn Arg Tyr

35 40 45

His Asp Tyr Ile Ile Val Ile Glu Pro Gly Thr Glu Lys Pro Tyr Phe

50 55 60

Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Val Arg Lys Cys Arg Pro Lys Asn Trp Met

65 70 75 80

Ile Ser Ser Asn Ser Thr Ser Lys Pro Leu Leu Ile Val Ala Thr Phe

85 90 95

Val Val Gly Lys Asn Ser Thr Ile Thr Ser Thr Thr Trp Thr Tyr Phe

100 105 110

Phe Glu His Lys Leu Asn Ala Val Arg Pro Lys Phe Arg Ala Ser Lys

115 120 125

Pro Leu Arg Lys Ser Ala Arg Pro Thr Ser Trp Gln Pro Pro Asn Cys

130 135 140

Leu Val Leu Glu Met Gly Tyr Pro Pro Val Val Val Met Phe Pro Lys

145 150 155 160

Val Ser Arg Ala Thr Asn Thr Thr Val Thr Gly Lys Val Ser Lys Val

165 170 175

Trp Thr Val Leu Pro Lys Lys Thr Asn Arg Pro Thr Ser Arg Asn Trp

180 185 190

Val Arg Arg Arg Phe Ala Lys Cys Cys Pro Ala Arg Lys Lys Thr Ala

195 200 205

Trp Ile Thr Asn Ser Met Arg Leu Ser Ala Thr Cys Ala Thr Thr Pro

210 215 220

Val Trp Leu Ala Asn Glu Ser Asp Ile Lys Ser Glu Trp Leu Val Tyr

225 230 235 240

Ala Ile Met Pro Gly Ser Phe Glu Glu Gly Met Gly Asn Tyr Pro Pro

245 250 255

Leu Arg Arg Arg Arg Thr Val Ala Thr Ile His Gly Asp Arg Gly Gln

260 265 270

Ser Ile Gly Thr Val Glu Gly Gly Tyr Met Ile Glu Cys Glu Asn Val

275 280 285

Thr Asp Lys Tyr Phe Thr Val Glu Gly Gly Gln Asn Trp Ile Met Pro

290 295 300

Lys Pro Leu Ala Glu Gly Thr Val Ser Ala Thr Tyr Pro Val Tyr Pro

305 310 315 320

Ser Gly Ser Pro His Ser Gly Val Asp Val Ser Cys Pro Glu Gly Thr

325 330 335

Pro Val Arg Ala Ser Lys Asp Gly Val Cys Ile Lys Arg Arg Glu Ile

340 345 350

Thr Ser Tyr Gly Lys Tyr Leu Phe Ile Glu His Ile Tyr Ala His Asn

355 360 365

Ser Lys Leu Leu Ile Asn Glu Gly Asp Thr Trp His Val Lys Ala Gly

370 375 380

Asp Ile Ile Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Gly Asn Ser Thr Gly Ala His

385 390 395 400

Ser His Phe Glu Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Ile Asn Pro Ala Pro

405 410 415

Asn Ala Asn Leu Lys Val Gly Asp Val Ile Lys His Lys Gly Val Glu

420 425 430

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> CP-ZF

<400> 3

attggatcca tgctgctgat taactgc 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> CP-ZF

<400> 4

cttaagcttt aattcaacac ctttatgttt 30

Claims

1.一种产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage)裂解酶，其特征在于，所述裂解酶氨基酸序列为Seq ID NO.2。

2.根据权利要求1所述的裂解酶，其特征在于，所述裂解酶的核苷酸序列为Seq IDNO.1。

3.根据权利要求2所述的裂解酶，其特征在于，扩增所述裂解酶核苷酸的引物为：5’-ATT GGA TCC ATG CTG CTG ATT AAC TGC-3’和5’-CTT AAG CTT TAA TTC AAC ACC TTTATG TTT-3’。

4.一种含有权利要求2所述的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶核苷酸序列的质粒。

5.一种含有权利要求4所述质粒的重组菌。

6.根据权利要求5所述重组菌，其特征在于，所述重组菌的原核细胞表达载体为pET28a；裂解酶基因插入到pET28a的Bam H I和Hind III酶切位点之间；重组菌为DE3(pET-Cps-Z1)。

7.权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在制备防治禽坏死性肠炎药物的应用。

8.权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶在抑制食品产气荚膜梭菌污染或过度生长的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述食品为由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

10.根据权利要求8所述的应用，将裂解酶与赋形剂复配后，用来抑制食品中产气荚膜梭菌的污染或过度生长。