CN116042593B - 产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及其在制备抗产气荚膜梭菌感染药物中的应用 - Google Patents

产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及其在制备抗产气荚膜梭菌感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及其在制备抗产气荚膜梭菌感染药物中的应用，所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列。本发明的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶具有广谱杀菌性，可以高效裂解多种不同类型的产气荚膜梭菌，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，同时具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。

Description

产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及其在制备抗产气荚膜梭菌感染 药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶及其在制备抗产气荚膜梭菌感染药物中的应用。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringen)是一种革兰氏阳性厌氧产芽孢杆菌，广泛存在于人和动物的正常肠道菌群和自然环境中。该菌被认为是人和动物肠道中的正常微生物，但在特定条件下，能够对多种动物造成严重感染甚至导致死亡。根据产气荚膜梭菌产生毒素(α、β、ε、ι、cpe和NetB)的不同可将产气荚膜梭菌分为A型(α)、B型(α,β,ε)、C型(α,β)、D型(α,ε)、E型(α,ι)、F型(α,cpe)和G型(α,NetB)。
集约化生产中，一般使用抗生素防控产气荚膜梭菌病，但大量抗生素的应用易导致耐药菌株的出现，使该病防治更为困难。在耐药现状和限抗政策的推动下，亟待寻找抗生素替代品进行该菌的防治。
噬菌体裂解酶是噬菌体在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶，该酶通过水解氨基糖之间的糖苷键、细胞壁肽聚糖上的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，达到裂解细菌的目的，然后释放出子代噬菌体，用于感染其他细菌。
目前，对于产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶，国内外研究正处于起步阶段，研究内容多集中于裂解酶的诱导表达及活性检测。针对不同类型的产气荚膜梭菌具有光谱杀菌性的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的一个方面，本发明提出了产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶。根据本发明的实施例，所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列。
根据本发明实施例的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶具有广谱杀菌性，可以高效裂解多种不同类型的产气荚膜梭菌，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，同时具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子编码前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体含有前面所述分离的核酸分子。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、分离的核酸分子或表达载体。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗产气荚膜梭菌感染药物组合物。根据本发明的实施例，所述抗产气荚膜梭菌感染药物组合物含有前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗因感染产气荚膜梭菌所引发的疾病。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种裂解产气荚膜梭菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞与产气荚膜梭菌进行共培养。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的电泳图；
图2显示了根据本发明一个实施例的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶对不同类型产气荚膜梭菌的裂解效果分析图；
图3显示了根据本发明一个实施例的不同温度和不同孵育时间下产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的裂解效果分析图；
图4显示了根据本发明一个实施例的不同pH值条件下产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的裂解效果分析图；
图5显示了根据本发明一个实施例的不同温度条件下产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的裂解效果分析图；
图6显示了根据本发明一个实施例的不同温度和不同储存时间下产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的裂解效果分析图；
图7显示了根据本发明一个实施例的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶对细胞毒性影响分析图；
图8显示了根据本发明一个实施例的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶对生菜表面产气荚膜梭菌杀菌作用分析图；
图9显示了根据本发明一个实施例的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶对雏鸡治疗效果分析图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提出了产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、分离的核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、用途和杀死产气荚膜梭菌的方法，下面将分别对其进行详细描述。
产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶和分离的核酸分子
在本发明的一个方面，本发明提出了产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶。根据本发明的实施例，所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列。
根据本发明实施例的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶(在本文中，亦称为“裂解酶cpp-J1”)具有广谱杀菌性，对A型(NCTC 528、NCTC 8533)、B型(NCTC 6261)、C型(NCTC 10720、NCTC 4989)、D型(NCTC 8346)、E型(NCTC 8084)、F型(F4969)和G型(CP56)等9株产气荚膜梭菌均能高效裂解，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，同时具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
MKIGIRDGHSPNCKGAIGLRDEQSCMRVLCKEVIEILEKHGHEVVYCGSDASTQNGELSEGVRKAKLKLLMIFISLHMNSFNGQAQGTESLVAVGARNFIKEIATRLCKNFASLGLVNRGVKEVNLYEMKNVKAPNIIFETMFCDNEHDINEVWSPTPYEKMALLIANAIDPTIKENELYRVVVQYFNSEDAENCQQEIAKRWYCFVEECN(SEQ IDNO：1)
在本发明的另一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子编码前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶。由此，根据本发明实施例的分离的核酸分子编码的蛋白具有广谱杀菌性，对多种产气荚膜梭菌均能高效裂解，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，同时该裂解酶具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其相比具有至少80％同源性的核苷酸序列。
atgaaaataggtattagagatggacatagtccaaattgtaaaggtgctattggtttacgtgatgaacaatcatgtatgagagttttatgtaaagaagttatagaaatattagaaaaacatggtcatgaggtagtttattgtggtagtgatgcaagtacacaaaatggtgaactttcagaaggtgtgagaaaagctaaactcaaactgttgatgatatttatttcactacacatgaatagttttaatggacaagctcaaggaacagagtcacttgttgcagttggagcaagaaatttcataaaagaaattgcaacaagattatgtaaaaactttgctagtttaggtttagtaaatagaggtgtaaaagaagttaatttatatgaaatgaaaaacgtaaaagcgcctaacataatatttgaaactatgttttgtgataatgaacatgacataaacgaagtttggtcacctacaccatacgagaaaatggctttactaattgcaaatgctattgacccaactattaaggaaaatgaactttatagagttgttgtccaatattttaacagcgaagatgctgaaaattgtcaacaggaaattgctaaaagatggtattgttttgtagaggagtgtaattaa(SEQ ID NO：2)
在本发明中，术语“同源性”是指核苷酸序列或者氨基酸序列之间的相似程度，同时本发明所说的具有(一定程度)同源性的核苷酸序列或者氨基酸序列对应的蛋白至少在用于本发明的功能方面具有相同或更好的活性。
在本发明中，术语“至少80％同源性”指与各参考序列至少为80％，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的相似程度。
尽管本发明采用的是由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1的产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶cpp-J1，但是可以理解，cpp-J1的任何功能等效变体均适用于本发明中，所述功能等效变体相较于SEQ ID NO:1所示的cpp-J1可以具有一个或者多个氨基酸的插入、替换和/或缺失，但是依然具有SEQ ID NO:1所示的cpp-J1的相同或功能/作用。
需要说明的是，前面针对产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶所描述的特征和优点，同样适用于该分离的核酸分子，在此不再赘述。
表达载体和重组细胞
在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体含有前面所述分离的核酸分子。由此，根据本发明实施例的表达载体可以将分离的核酸分子表达为产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶，其可以高效裂解多种产气荚膜梭菌，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，同时具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，应用价值高。
在本发明中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA的载体以及主要用于DNA的转录和/或翻译的表达的载体。示例性地，表达载体可以为质粒、噬菌体、粘粒或病毒等。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、分离的核酸分子或表达载体。由此，根据本发明实施例的重组细胞可以表达产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶，其可以高效裂解多种产气荚膜梭菌，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，同时具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入表达载体的原核细胞或真核细胞。
需要说明的是，前面针对产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、分离的核酸分子所描述的特征和优点，同样适用于该表达载体和重组细胞，在此不再赘述。
药物组合物和用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗产气荚膜梭菌感染药物组合物。根据本发明的实施例，所述抗产气荚膜梭菌感染药物组合物含有：前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞。由此，利用根据本发明实施例的药物组合物可以高效裂解多种产气荚膜梭菌，有助于预防或治疗感染产气荚膜梭菌所引发的疾病，应用价值高。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
在本发明中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗因感染产气荚膜梭菌所引发的疾病。
在本发明中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本发明使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本发明使用的“治疗”涵盖将药物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本发明所述药物给予有需要的个体。
在本发明中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉、肌肉、皮下、皮层、口服、局部、鼻腔、肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，肽键断裂，因此口服给药的药物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解或破坏。优选地，本发明的药物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。
本发明的药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、病人年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。
根据本发明的实施例，所述产气荚膜梭菌选自产气荚膜梭菌NCTC 528、NCTC8533、NCTC 6261、NCTC 10720、NCTC 4989、NCTC 8346、NCTC 8084、F4969或CP56。由此，利用该药物可以高效裂解多种产气荚膜梭菌。
具体地，产气荚膜梭菌NCTC 528和NCTC 8533均为A型，产气荚膜梭菌NCTC 6261为B型，产气荚膜梭菌NCTC 10720和NCTC 4989均为C型，产气荚膜梭菌NCTC 8346为D型，产气荚膜梭菌NCTC 8084为E型，产气荚膜梭菌F4969为F型(GenBankno.NZ_ABDX00000000.1)，产气荚膜梭菌CP56(GenBank no.MW393528)为G型。
需要说明的是，前面针对产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、分离的核酸分子、表达载体或者重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物和用途，在此不再赘述。
裂解产气荚膜梭菌的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种裂解产气荚膜梭菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞与产气荚膜梭菌进行共培养。由此，利用根据本发明实施例的方法可以高效裂解多种产气荚膜梭菌。
需要说明的是，本发明对于产气荚膜梭菌的存在状态不做严格限定，既可以存在于受试者表面，也可以存在于受试者内部。对于受试者的类型不在严格限定，可以为动物或植物，当为动物时，不以疾病的诊断或治疗为目的，例如为对产气荚膜梭菌的微生物学研究或者产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的蛋白组学研究。
根据本发明的实施例，所述产气荚膜梭菌选自产气荚膜梭菌NCTC 528、NCTC8533、NCTC 6261、NCTC 10720、NCTC 4989、NCTC 8346、NCTC 8084、F4969或CP56。由此，利用该药物可以裂解多种产气荚膜梭菌。
根据本发明的实施例，所述共培养的温度选自4～50℃，pH值为4～10。由此，产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶具有耐高温和耐酸碱的特性，在上述共培养条件下仍具有较高的酶活性，从而更好地发挥杀灭产气荚膜梭菌噬菌体的作用。并且，方便存储和使用，应用价值高。
需要说明的是，前面针对产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、分离的核酸分子、表达载体或者重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中，采用的主要材料如下：
pET-28a载体：购买于Invitrogen公司。
BL21(DE3)感受态细胞：购买于Invitrogen公司。
洗涤液洗脱液配方：Tris 20mmol/L、NaCl 500mmol/L、咪唑50-500mmol、甘油5％、Tween0.05％。
实施例1重组蛋白的构建与表达
1.基因的扩增
以本实验室噬菌体Pcpp为模板扩增目的片段基因cpp-J1。
正向引物：5’-CG GGATCC ATGAAAATAGGTATTAGAGATG-3’BamHI
反向引物：5’-CCC AAGCTT TTAATTACACTCCTCTACAAAA-3’Hind III
扩增体系和扩增条件如下：
成分 加样量(μL)
dH2O 19
上游引物(10μmol/l) 2.5
下游引物(10μmol/l) 2.5
2×PrimeSTAR 25
模板DNA 1
总体积 50
PCR反应程序：98℃预变性5min；98℃预变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
2.构建重组质粒
(1)胶回收目的片段与胶回收后的pET-28a载体分别与限制性内切酶BamH I和Hind III在37℃酶切2h；
(2)将酶切后的产物在T4连接酶的作用下4℃过夜连接，连接体系条件如下：
Figure BDA0004066681010000081
Figure BDA0004066681010000091
将测序成功的重组质粒pET-28a-cpp-J1，转化BL21(DE3)感受态细胞中，按照1:100的比例向1000mL的LB液里(含37mg/mL Kan)加入过夜培养的细菌BL21(DE3)-pET-28a-cpp-J1，37℃摇床振荡培养(180rmp)两个小时，至菌液OD600nm在0.3-0.5之间，加入终浓度为0.5mmol IPTG，16℃摇床中140rpm诱导培养16小时。4℃离心机(10,000rmp)离心3min收集菌体。PBS(pH＝7.2)重悬，超声细胞破碎机破碎菌体(超声开10s关10s，工作时间20min)。将破碎液于4℃离心机(10,000rmp)离心10min，取上清过0.22μm滤膜，获得未纯化的裂解酶蛋白。
利用Ni-His亲和株纯化蛋白，将未纯化的蛋白经HiTrap Q Sepharose FF column(GE Healthy Care)，使用洗涤液(咪唑浓度20mmol)洗涤三次(每次1mL)后不同咪唑浓度的洗脱液洗脱(50mmol、100mmol、150mmol、200mmol、250mmol、300mmol、350mmol、400mmol、450mmol、500mmol)，收集流出液，将流出液通过PBS(pH＝7.2)透析咪唑，使用30kD蛋白浓缩柱浓缩目的蛋白cpp-J1。裂解酶cpp-J1蛋白纯化后的胶图见图1，其蛋白大小为23.9kD。蛋白纯度检测结果为50μg/mL。
实施例2裂解酶cpp-J1对不同毒素产气荚膜梭菌的裂解效果
取出保存在-80℃产气荚膜梭菌，将适量菌液滴于BHI血琼脂培养基上，用涂布棒涂布均匀后平放于超净台静置30min，待其良好吸收后42℃厌氧培养24h。将培养好的细菌单菌落接种于新鲜配制的FTG培养基中，42℃厌氧培养24h。离心(6000rmp，10min)收集菌体，利用PBS(pH＝7.2)重悬菌体，使细菌的OD600nm＝1.0。取100μl细菌与100μl裂解酶(0.5μg)cpp-J1混合，37℃孵育30min，测定细菌在OD600nm下的吸光值，该试验一式三份，计算浊度下降比率。结果如图2所示，裂解酶cpp-J1对7种不同的毒素型(A，B，C，D，E，F和G)的9种产气荚膜梭菌具有较好的裂解效果，由此，表明其具有广谱杀菌性。
实施例3裂解酶cpp-J1在不同温度下作用时间
42℃厌氧过夜培养宿主菌株C.perfringens NCTC 8533，离心后收集菌体，利用PBS(pH＝7.2)重悬菌体，使细菌的OD600nm＝1.0。取100μl细菌与100μl裂解酶(0.5μg)cpp-J1混合，分别在4℃，16℃，25℃，37℃和42℃五个不同温度孵育。每个温度组分别孵育10min，30min，60min，120min，240min和360min。在反应时间结束后，立即测定细菌在OD600nm下的吸光值。该试验一式三份，计算浊度下降比率。结果如图3所示，在4℃，16℃，25℃，37℃和42℃五个不同温度条件下孵育10～360min，裂解酶cpp-J1均能够发挥杀菌效果，在42℃条件下，杀菌效果大于98％。
实施例4pH对裂解酶cpp-J1的酶活影响
42℃厌氧过夜培养宿主菌株C.perfringens NCTC 8533，离心后收集菌体，利用PBS(pH＝7.2)重悬菌体，使细菌的OD600nm＝1.0。将裂解酶cpp-J1至于不同pH(pH＝3，4，5，6，7，8，9，10)的PBS中，37℃孵育1h，取100μl细菌与100μl(0.5μg)上述处理的裂解酶cpp-J1混合，37℃孵育30min。测定细菌在OD600nm下的吸光值，该试验一式三份，计算浊度下降比率。结果如图4所示，相对pH为7环境下，pH为4、5、6、8、9和10时，裂解酶活性相对稳定，而pH为3时，裂解酶活性降低85％。
实施例5温度对裂解酶cpp-J1的酶活影响
42℃厌氧过夜培养宿主菌株C.perfringens NCTC 8533，离心后收集菌体，利用PBS(pH＝7.2)重悬菌体，使细菌的OD600nm＝1.0。预先将裂解酶cpp-J1在4℃，16℃，25℃，37℃，42℃，50℃，60℃，70℃和80℃孵育1h，取100μl细菌与100μl(0.5μg)上述处理的裂解酶cpp-J1混合，37℃孵育30min。测定细菌在OD600nm下的吸光值，该试验一式三份，计算浊度下降比率。结果如图5所示，裂解酶cpp-J1在4-50℃下均具有较高的酶活性。
实施例6不同温度下，储存时间对裂解酶cpp-J1的酶活影响
42℃厌氧过夜培养宿主菌株C.perfringens NCTC 8533，离心后收集菌体，利用PBS(pH＝7.2)重悬菌体，使细菌的OD600nm＝1.0。将裂解酶cpp-J1分别储存在-80℃，-20℃，4℃，16℃，25℃，37℃和42℃。分别在1d，3d，7d，15d和30d后，取100μl细菌与100μl(0.5μg)上述处理的裂解酶cpp-J1混合，37℃孵育30min。测定细菌在OD600nm下的吸光值，该试验一式三份，计算浊度下降比率。结果如图6所示，裂解酶cpp-J1在42℃放置30d，酶的活性下降40％，37℃放置30d，酶的活性下降18％，在其它温度下放置30d均能保存较高的酶活性。由此，表明其方便储存，在常温环境下储存不影响裂解酶cpp-J1活性。
实施例7裂解酶cpp-J1对细胞毒性影响
将人源的293T，A549，Huh7三种细胞培养至1×104个/mL。在每个细胞板中，加入裂解酶cpp-J1(终浓度15μg/ml)，37℃细胞培养箱中培养24h后，移除培养基。每孔加入20μlMTS试剂(Promega Cell Titer 96TM Aquesous One Solution Cell ProliferationAssay)，2h后在OD490nm检测吸光度，该试验一式三份。结果如图7所示，Prism 8.0软件比较各组间FL差异(NS P＞0.01)，裂解酶cpp-J1对三种细胞无毒性作用。
实施例8裂解酶cpp-J1对生菜表面产气荚膜梭菌杀菌作用
取新鲜生菜叶片剪切至1cm2大小，用无菌水清洗三遍，晾干备用。将菌液稀释至105CFU/mL，吸取100μL菌液滴加在叶片上，42℃厌氧晾干后，取出试验组叶片滴加100μL(10μg)裂解酶cpp-J1，再将叶片置于42℃厌氧培养。厌氧培养15min、30min、60min时，取出实验组和对照组叶片，分别浸泡在1mL无菌水中。取100μL浸泡液，10倍稀释后涂布于TSC培养基上，42℃厌氧培养24h，计算细菌数目lg值。结果如图8所示，Prism8.0软件比较各组间差异(***P＜0.001)，裂解酶cpp-J1在15min内可完全杀死蔬菜表面的细菌。
实施例9裂解酶cpp-J1对雏鸡治疗作用
18只10日龄SPF雏鸡随机分成3组，所涉及的攻毒方式均为腹腔注射。A、B两组给予100μl(109CFU)产气荚膜梭菌C.perfringens NCTC 8533攻毒，C组攻入100μl PBS，攻毒3h后，A、C两组给予100μl(30μg)裂解酶cpp-J1，B组给予100μl PBS。实验连续观察7d。结果如图9所示，裂解酶cpp-J1治疗组中的雏鸡全部存活。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶，其特征在于，所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述分离的核酸分子。
5.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子或权利要求4所述表达载体。
6.一种抗产气荚膜梭菌感染药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子、权利要求4所述表达载体或者权利要求5所述重组细胞。
7.一种裂解产气荚膜梭菌的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子、权利要求4所述表达载体或者权利要求5所述重组细胞与产气荚膜梭菌进行共培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌选自产气荚膜梭菌NCTC528、NCTC 8533、NCTC 6261、NCTC 10720、NCTC 4989、NCTC 8346、NCTC 8084、F4969或CP56；
所述共培养的温度选自4~50℃，pH值为4~10。
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