JP5795079B2 - 細胞表面で発現される抗菌ペプチド多重合複合体 - Google Patents
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Description
式(1):N末端−[抗菌ペプチド−ペプシン切断アミノ酸リンカー]−C末端
式(2):N末端−[ペプシン切断アミノ酸リンカー−抗菌ペプチド]−C末端
ただし、前記抗菌ペプチドは、ペプシン切断アミノ酸リンカーとは異なるアミノ酸からなる。
1−1:ペプシン切断アミノ酸リンカーの配列の決定
ペプシンによって単量体に分離される抗菌ペプチド重合体を製造するために、韓国登録特許第0441402号に開示された配列番号1の抗菌ペプチド(配列番号9:RVVRQWPIGRVVRRVVRRVVR)を任意のアミノ酸をリンカーとして用いて連結した抗菌ペプチド重合体において、ペプシンによってアミノ酸リンカーが切断されてそれぞれの単量体に分離されるようにするアミノ酸配列を、コンピュータプログラムツールのExPAsy(Expert protein analysis system、スイス)を用いて決定した。その結果、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンのC末端と抗菌ペプチドのN末端との間に形成されたペプチド結合がペプシンによって切断されたことを確認し、前記アミノ酸のそれぞれをペプシン切断アミノ酸リンカーとして決定した。
抗菌ペプチドにペプシンによって切断されるアミノ酸を添加した抗菌ペプチド重合体のアミノ酸配列を、プログラムによって予測した結果、ロイシン(luecine)、フェニルアラニン(phenylalanine)、チロシン(tyrosine)の後でペプシンが作用したことを確認し、これら3つのペプチドに対して化学合成を通じて純度95%の抗菌ペプチドを得た。
前記実施例1で決定されたペプシン切断アミノ酸リンカー(ロイシン)を抗菌ペプチドのC末端に添加した抗菌ペプチド単量体(Hinge2L)をコードするDNA切片を作製し、ベクターにクローニングした。このために、配列番号1(5’−GAAGACCCCGTGTTGTTCGTCAGTGGCCGATTGGTCGTGTCGTTCGCCGTGTTGTTCG−3’)および配列番号2(5’−GGATGGATCCTAAGCACGCAGACGAACGACGCGACGAACAACACGGCGAACGACACG−3’)のプライマーを用いてPCRを行うことにより、配列番号9の抗菌ペプチドのC末端にペプシン切断アミノ酸リンカーのロイシンが付加された22個のアミノ酸からなる抗菌ペプチド単量体をコードする二重鎖のDNA切片を完成した。PCR条件は、94℃で30秒間DNA変性、56℃で30秒間アニーリング、72℃で30秒間DNAを合成し、これを30回繰り返した。クローニングのために、抗菌ペプチド単量体のN末端に制限酵素BbsIの認識部位(5’−GAAGAC(N)2▼−3’,3’−CTTCTG(N)6▲−5’)、およびC末端にFokIの認識部位(5’−GGATG(N)9▼−3’,3’−CCTAC(N)13▲−5’)を導入した。
以後、完成したDNA切片をpGEM T−easyベクターに挿入し、pMBT−Hと名付けた。
3−1:Lpp−OmpAに連結された抗菌ペプチド重合体DNAの作製およびクローニング
抗菌ペプチド重合体を宿主細胞の細胞表面で発現されるようにするために、細胞表面発現母体として、大腸菌(E.coli)の脂質タンパク質(lipoprotein)のリーダー配列(leader sequence)、および細胞外膜に安定的に付着している大腸菌の外膜タンパク質A(OmpA)の配列の一部を用いた配列番号7の塩基配列を有するLpp−OmpA DNA切片を作製し、これをベクターにクローニングすることを試みた。
クローニングされたか否かを確認するために、前記実施例3−1で作製されたそれぞれのpLO−Hinge2Lnベクターに挿入されたLpp−OmpA−Hinge2Ln DNA切片のサイズを測定した。
図4に示されるように、Lpp−OmpA DNAに抗菌ペプチド多重合体およびHis tagを連結し、この形態で発現できるように組換えベクターを製造した。このために、前記実施例3で作製されたpLO−Hinge2Lnベクターに制限酵素NdeIとBamHIを処理し、Lpp−OmpA−Hinge2Ln DNA切片を得て、ゲル抽出キット(Gel extraction kit、Qiagen、ドイツ)を用いて所望の大きさのDNA片を分離した。
前記実施例4の形質転換された大腸菌の細胞表面に抗菌ペプチド多重合体が発現されるか否かの確認を試みた。このために、LB培地(Luria Botani、トリプトン1%、酵母抽出物0.5%、NaCl0.5%)を用いて形質転換された大腸菌を培養し、培養液がOD600=0.5〜0.6の間の時、0.2mMのIPTG(isopropyl−β−Dthiogalactopyranoside)を添加し、抗菌ペプチド多重合体の細胞表面発現を誘導した。発現を誘導した後、4時間後培養液を除去し、PBS(phosphate buffered saline)で2回洗浄し、0.2%のBSA(bovine serum albumin)が含まれているPBSおよびHis−tag一次抗体(His−tag primary antibody)を共に入れた後、氷で30分間培養した。培養後、PBSで2回洗浄し、FITC(fluorescein isothiocyanate)の標識されたHis−tag二次抗体(FITC conjugated his tag secondary antibody)を入れた後、光が入らないようにしながら、氷で30分間培養した。以後、PBSで再び洗浄をし、大腸菌細胞をPBSで再浮遊(resuspension)させ、これを共焦点顕微鏡(confocal microscope)を用いて観察した。
前記実施例4で作製された細胞表面に抗菌ペプチド多重合体を発現させる大腸菌の抗菌効果を測定した。形質転換されたE.coli BL21(DE3)を100mlのLB培地で培養し、培養液の懸濁液がOD600=0.5〜0.6の間の時、0.2mM IPTGを添加し、細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導した。発現を誘導してから、4時間後培養液を除去し、NAPB(sodium phosphate buffer)で2回洗浄した後、同じバッファーで再浮遊(resuspension)させ、すべてのサンプル大腸菌は、1X1010cfu/mlで数を同一に合わせた。次に、生体の胃と類似の濃度のHCl水溶液(SGF、sitimulated gastirc fluid;0.084N HCl、35mM NaCl、pH1.2or2.0)にペプシンを溶かして大腸菌に処理した後、30分間培養した。培養後、ペプシンの活性を防ぎ、pHを中和させるために、HCl水溶液と同濃度のNaOH水溶液と混合し、遠心分離して、ペプシンによって切断された抗菌ペプチド単量体以外の細胞残渣を除去した。
Claims (15)
- 下記式1または2を含む抗菌ペプチド重合体、および前記重合体に連結された細胞表面発現母体を含む、抗菌ペプチド多重合体。
式(1):N末端−[抗菌ペプチド−ペプシン切断アミノ酸リンカー]−C末端
式(2):N末端−[ペプシン切断アミノ酸リンカー−抗菌ペプチド]−C末端
ただし、前記抗菌ペプチドは、ペプシン切断アミノ酸リンカーとは異なるアミノ酸からなり、
前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンからなる群より選択されるいずれか1つ以上のアミノ酸であり、
前記細胞表面発現母体は、外膜タンパク質である。 - 前記抗菌ペプチドが、配列番号9ないし24のいずれか1つのアミノ酸配列を有するものである、請求項1に記載の多重合体。
- 前記細胞表面発現母体が、重合体のN末端に連結されたものである、請求項1に記載の多重合体。
- 前記外膜タンパク質が、大腸菌の外膜タンパク質OmpA、大腸菌の脂質タンパク質(lipoprotein)のリーダー配列(leader sequence)に連結された大腸菌の外膜タンパク質OmpA、大腸菌の外膜タンパク質OmpS、大腸菌の外膜タンパク質LamB、大腸菌の外膜タンパク質PhoE、大腸菌の外膜タンパク質OmpC、大腸菌の外膜タンパク質FadL、サルモネラ菌株の外膜タンパク質OmpCおよびシュードモナス菌株の外膜タンパク質OprFからなる群より選択されるものである、請求項1に記載の多重合体。
- 前記大腸菌の脂質タンパク質(lipoprotein)のリーダー配列(leader sequence)に連結された大腸菌の外膜タンパク質OmpAが、配列番号8のアミノ酸配列からなるものである、請求項4に記載の多重合体。
- 前記抗菌ペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を有し、前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、ロイシンであり、前記細胞表面発現母体は、配列番号8のアミノ酸配列を有するものである、請求項1に記載の多重合体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の多重合体をコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号25ないし27のいずれか1つの塩基配列を有するものである、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項7または8に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
- 請求項9に記載の組換えベクターで形質転換され、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する、抗菌微生物。
- 前記抗菌微生物が、生体内で抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現するものである、 請求項10に記載の微生物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の多重合体を有効成分として含む、抗菌用薬学組成物。
- 請求項10または11に記載の抗菌微生物を有効成分として含む、抗菌用薬学組成物。
- 請求項10または11に記載の抗菌微生物を有効成分として含む、抗菌用医薬外品組成物。
- (a)請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗菌ペプチド多重合体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを製造するステップと、(b)前記組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体に形質転換するステップと、(c)前記形質転換体を培養して抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導するステップとを含む、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物の製造方法。
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