CN110079508A

CN110079508A - 一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110079508A
Application number: CN201910388278.3A
Authority: CN
Inventors: 何平; 祝先潮; 吴运强; 刘畅; 杜娟
Original assignee: Shanghai Ruizhou Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ruizhou Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110079508B

Abstract

本发明提供了一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用，所述噬菌体命名为SH‑KP152302，具有降解生物被膜的特性，噬菌体的基因组的第42位开放阅读框编码解聚酶，能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，抑制生物被膜的形成，去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性，可以作为一种潜在的抗生素替代品。

Description

一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用，尤其涉及一种肺炎克雷伯菌噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，抗生素的耐药问题日益严峻，细菌表面的生物被膜使细菌对抗生素的抵御能力提高了10-1000倍，给临床治疗带来巨大挑战。据美国疾病预防与控制中心估计，65％的人类感染与生物被膜细菌感染有关，细菌形成生物被膜的能力决定了细菌的致病性，而生物被膜的形成过程也是重要的感染过程。

肺炎克雷伯菌是一种具有重要临床研究价值的机会致病性革兰氏阴性杆菌，正常情况下定植在口、皮肤和肠道等部位，但也可能导致严重的院内和院外感染，例如社区获得性肺炎、肝脓肿、呼吸道感染和脓毒血症等。近年来，抗生素的滥用使得肺炎克雷伯菌成为了重要的医源性感染病原体，克雷伯氏菌菌株分泌的多重耐药性广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和碳青霉烯酶(carbapenemases)日益增加，美国疾病控制中心已将肺炎克雷伯菌列为严重威胁公共健康的因素之一。

多糖是肺炎克雷伯菌最重要的致病因子之一，包括在细菌周围形成的包膜多糖(CPS)和释放到胞外的胞外多糖(EPS)。其中，EPS在肺炎克雷伯菌抵抗宿主防御机制、抑制早期炎症反应、防止噬菌体进入、协助细菌粘附和生物膜形成等方面发挥了重要作用。肺炎克雷伯菌具有合成和分泌EPS的能力，细菌细胞群落通过嵌入EPS组成的基质中形成生物被膜。导管表面的生物被膜保护细菌免受不利环境因素(如干燥、洗涤剂和宿主免疫防御攻击)和抗生素的渗透，显著提高了细菌的耐药性。因此，迫切需要找到一种对抗细菌生物被膜、解决细菌耐药性的策略。

噬菌体提供了一种天然、高特异性和无毒的防控细菌生物被膜的方式。噬菌体是一类能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。自20世纪20年代初以来，噬菌体治疗已被应用于临床实践，与抗生素相比，噬菌体治疗对目标菌具有高度特异性和有效性，不会在体内引起疾病，稳定存在直到细菌被清除。

噬菌体感染细菌的关键步骤包括识别和吸附、特异性结合、DNA注射、繁殖和裂解，其中，识别和吸附尤为关键。然而，当细菌生活在生物被膜中时，噬菌体受到阻碍。有趣的是，在与宿主共同进化的过程中，噬菌体产生了多种降解多糖化合物的多糖解聚酶，可以促进噬菌体吸附于细菌表面，或与细菌表面受体结合。多糖解聚酶存在的显著特征是在菌斑周围产生光环，并随着孵育时间的延长，光环直径增大。研究发现，噬菌体编码的多糖解聚酶对生物被膜具有有效的降解作用。

CN 109536459 A公开了降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶，通过对肺炎克雷伯氏菌噬菌体GH-K3基因组中第32个开放阅读框进行原核表达和纯化，获得了全新并具有高效活性的解聚酶depo32。该解聚酶对肺炎克雷伯氏菌所形成的荚膜多糖和生物被膜具有高效降解作用，但对K47荚膜型肺炎克雷伯菌的生物被膜降解效果较弱。

因此，提供一种高效识别和去除K47型肺炎克雷伯菌的特异性荚膜的多糖解聚酶，为解决细菌耐药性问题具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用，所述噬菌体通过表达解聚酶Dpo42，显著降解了肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种肺炎克雷伯菌噬菌体，所述噬菌体的基因组的第42位开放阅读框编码解聚酶。

本发明中，所述肺炎克雷伯菌噬菌体通过编码由793个氨基酸组成的解聚酶，具有降解生物被膜的特性，所述噬菌体命名为SH-KP152302。

优选地，所述肺炎克雷伯菌的wzi分型为K47荚膜型。

本发明中，所述K47荚膜型肺炎克雷伯菌是中国产kpc的优势肺炎克雷伯氏杆菌克隆体。

优选地，所述噬菌体的基因组包括至少28个功能基因。

本发明中，噬菌体发现包含48个假定的功能基因，平均长度为766bp，其中包括28个明确的功能基因，可分为4类：DNA组装和形态相关蛋白、DNA复制/重组/修饰蛋白、宿主裂解蛋白、以及未分类蛋白，其余的是假定蛋白质，无毒力和耐药基因。

第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的肺炎克雷伯菌噬菌体的分离方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向污水中加入肺炎克雷伯菌，培养后收集上清液；

(2)将上清液点斑于双层琼脂平板上，纯化后得到单一斑块；

(3)向单一斑块中加入缓冲液，搅拌后静置，收集液体和上层琼脂；

(4)离心取上清，采用PEG-8000富集，氯化铯密度梯度离心1h，得到噬菌体颗粒。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的噬菌体表达的解聚酶，所述解聚酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为：

MDQDIKTVIQYPVGATEFDIPFDYLSRKFVRVSLVSDDNRRLLSNITEYRYVSKTRVKLLVETTGFDRVEIRRFTSASERIVDFSDGSVLRASDLNVSQIQSAHIAEEARDAALMAMPQDDAGNLDARNRRIVRLAPGIAGTDAVNKDQLDTTLGEAGGILSDMKDLEGEIHDYIEKFADDTALVRGVAWVYNLGSADGGETVITINKSTRTYAVPYIEVNGSRQEVGYHYSFDLETQQITLATPLKAGDFVMVMTTESQLPVETLLASSVGAASIGTATGETVEERLTRLYGHFVHPETYGAVGDGITDDRVALQRSLDVAYENALNGTGPSTVRWSGDYMVSLNPNSLGVSGELAAGRSALCIRPGVSIEGKGTVRLDPSFTGSQSGAVITNWAGPADDCSIKDIRIYGGKDVATGTGITGILILDSQRVVISDVKVLNSTAGGIYLRKGATEGLYGCSFSKVSGCTVDNAGYIGIQMERPYDNTVIGNTINRCEDNGIDVFGNVNDATVTGIAQSTLITGNNIRDVLNGVFIESCGNTNITGNYIADFRSSGVIYNRINSAANDNSLTSNVLIGASGASAGVSFKNSVGYCTVASNRIQNSDYGIRCVGGGITGLNILPNTMKNIAKTLLFVEARNNGLVKSRMSTQFYEGAQVGGIPSNTSPRGVPHRFPSRLSYIVDIQPFWATEQGTREDNFERAKGTLASITGWGSKCALYDTIVAGDTVVSLNSSSVAVGEYLEINAEVYKVTSVSATYAVVRKWTGSDYTAGDYAAVIISNPSYIIRRVQWGEQ.

本发明中，所述解聚酶能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，抑制生物被膜的形成，去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性。

优选地，所述解聚酶的结构域包括T7噬菌体尾丝蛋白、果胶酸裂解酶、含氮氧化酶和右手β螺旋结构域。

本发明中，果胶酸裂解酶参与破坏糖苷键，从而裂解细菌胞外多糖；已发表的研究表明，果胶酸裂解酶在其他噬菌体中识别和降解CPS的尾尖蛋白。

优选地，所述解聚酶为85kDa。

第四方面，本发明提供了一种编码如第三方面所述的解聚酶的核酸序列。

优选地，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述SEQ ID NO:2的核酸序列为：

atggaccaagacattaaaacagtcattcagtacccagtaggggccactgagttcgacatcccgttcgactacctgtcccgtaagtttgtccgtgtgtcgctggtgtcagacgataaccgcagactgctaagtaacatcactgagtaccgctacgtgtctaagaccagagtgaagctccttgtggaaactaccgggttcgaccgtgtggaaatccgcaggttcacctcggcgtctgagcgaatcgttgacttcagcgatggctcggttctccgcgcttctgaccttaacgtatctcaaatacagtcggcgcatatcgcagaggaagcacgtgacgcggcactcatggccatgccacaggatgacgctgggaaccttgatgcgcgcaaccgtagaatcgtaaggttggcaccgggtattgccgggacggatgcagtgaacaaggaccagcttgacacgaccttaggagaggctggtggtatcctatcggacatgaaggacctagagggtgagattcatgactacatcgagaagtttgcagatgacactgcgcttgtgcgtggggtggcgtgggtgtataaccttggttccgctgatggtggggaaaccgttatcaccataaataaatcgacacgtacatacgctgtgccttacattgaggtaaatggctcacgccaagaggtcgggtatcactattcgttcgatctggaaacacagcagataacccttgccaccccattgaaagctggcgacttcgttatggtaatgaccacagagtctcagctcccggtagagacattgctggcatctagcgttggtgccgcgagcatcgggacggccacaggagagacagttgaggagcgacttactcgactttacgggcactttgtgcaccctgagacgtatggtgctgtaggtgatggcataacagacgaccgagttgcactccagcgctcactagatgtggcttatgagaatgcgctgaatggtactggcccgtcgactgtacgctggtcaggagactacatggtgtcgctgaaccctaactcattaggcgtttctggggaactggcagcaggccgctcagcactatgtatccgacccggtgtgtcaattgaaggtaagggcacggtccgtcttgacccatcctttacaggaagccagtctggcgcagtaataaccaactgggctggtccagctgacgactgctccattaaggatatacggatttacggcggtaaggacgtagccactggtactggcataaccggaatccttattctggattcacagagagtagtcatatctgacgttaaggttctgaacagtacagctggtggtatctatctgagaaaaggtgccacagagggtctgtatggatgctcattcagcaaggtctcagggtgtactgtggataacgctgggtacattggaatccagatggagagaccatacgataataccgtcattggaaacacaatcaatcggtgtgaagataacggcattgacgtgttcggtaacgtaaacgatgctacggtaacgggcattgcgcaatccacgctaatcactggcaacaacataagggatgtcctaaacggagtgttcattgaatcctgcggcaacacaaacattaccggaaactacatcgcggactttcgctccagcggggtcatctacaaccgcatcaactcggcggcaaatgataactcactcacctcaaacgtactcatcggcgcctcaggtgcttcggcaggtgttagcttcaagaactcagtaggatactgtacagtggcgagcaacaggattcagaatagtgactacgggattcgatgcgttggcggaggcattaccgggcttaacatcctcccaaatacgatgaagaacatcgctaagaccctgctgtttgtggaggcccgtaacaacggtctggtcaagtcacgtatgtctacccagttctacgagggggcacaggtcggcgggattccgagtaacacctctccaagaggagtaccgcacagattcccatcaaggctctcttatattgtggatatccaaccgttctgggcaacagagcagggtacccgcgaggataacttcgagagagcaaaagggaccttggcgtcaatcactgggtggggttcaaagtgtgccctgtatgacacgattgtggcaggtgatacggtggtgtctcttaactcatcgtcagtagctgtgggcgaataccttgagattaacgcggaggtttataaggttactagcgtatccgcaacttacgccgtggttcgaaaatggactggttcggattacacggctggagactacgcagcggtaattattagtaatccatcctacatcattcgccgggtgcagtggggcgaacagtaa.

第五方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第四方面所述的核酸序列。

第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第四方面所述的核酸序列和/或如第五方面所述的表达载体。

第七方面，本发明提供了一种如第三方面所述的解聚酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1’)采用如SEQ ID NO:3-4所示的引物对，从噬菌体的基因组中扩增得到第42位开放阅读框，并在扩增产物的两端引入SacI和HindIII的限制性位点；

(2’)将扩增产物插入pSUMO3的SacI和HindIII酶切位点，转化入大肠杆菌，氨苄青霉素抗性筛选得到重组菌株，并进行IPTG诱导表达；

(3’)将表达产物进行组氨酸纯化后得到SUMO-解聚酶融合蛋白，加入SUMO蛋白酶，得到所述解聚酶。

所述SEQ ID NO:3的核酸序列为：

cgagctcatggaccaagacattaaaacagtc；

所述SEQ ID NO:4的核酸序列为：

cccaagcttttactgttcccccactgc.

本发明中，通过如SEQ ID NO:3-4所示的引物对向扩增产物的两端引入SacI和HindIII酶切位点。

第八方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括解聚酶。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第九方面，本发明提供了一种如第一方面所述的噬菌体、如第三方面所述的解聚酶、如第四方面所述的核酸序列、如第五方面所述的表达载体、如第六方面所述的宿主细胞或如第八方面所述的药物组合物在制备肺炎克雷伯菌抑制剂、治疗肺炎克雷伯菌感染药物、抗生素替代制剂或消毒剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明筛选得到一种肺炎克雷伯菌噬菌体，命名为噬菌体SH-KP152302，具有降解生物膜的特性；

(2)本发明从噬菌体SH-KP152302中鉴定出一种解聚酶Dpo42，由噬菌体SH-KP152302的ORF42编码，能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，所述解聚酶Dpo42不仅能够抑制生物膜的形成，而且可以去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性；

(3)本发明的解聚酶Dpo42在pH＝5.0-9.0的条件下表现出较高的活性，在25℃～80℃范围内也表现出较高的活性；

(4)本发明的解聚酶Dpo42对败血症小鼠具有显著的治疗效果，在高浓度下也没有毒副作用。

附图说明

图1(A)为噬菌体斑块，图1(B)为噬菌体形态的透射电镜图；

图2(A)为SUMO-Dpo42融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，M-蛋白标记，1～6-融合蛋白，图2(B)为洗脱蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，M-蛋白标记，1-融合蛋白，2-消化蛋白，3-镍柱附着蛋白，4-纯化蛋白，5-洗脱液；

图3为梯度稀释的Dpo42对宿主菌的斑点实验，对照为SUMO；

图4为蛋白酶的HPLC检测结果，其中，I-未经处理的EPS溶液，II-EPS与0.1μM的Dpo42在37℃下孵育，III-EPS与0.1μM的Dpo42在25℃下孵育，IV-经SUMO处理的EPS溶液；

图5(A)为pH值对Dpo42酶活性的影响，图5(B)为温度对Dpo42酶活性的影响；

图6为不同浓度的解聚酶对肺炎克雷伯菌生物膜的去除作用；

图7为不同浓度的解聚酶对肺炎克雷伯菌生物膜的抑制作用；

图8为小鼠生存曲线。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1噬菌体的分离纯化

污水样本取自复旦大学附属华山医院，将水样离心后加入肺炎克雷伯菌，在37℃条件下振荡培养过夜，噬菌体与细菌集中在上清液中；对上清液使用0.22μm滤膜过滤，采用SM缓冲液(100mM NaCl，8mM MgSO₄·7H₂O，50mMTris-HCl，pH＝7.5)梯度稀释后，点斑于双层琼脂平板上，进行噬菌体分离；

纯化噬菌体斑块，直至平板上呈现单一的斑块形态；向平板中加入3mL SM缓冲液，120rpm搅拌，4℃静置过夜；收集液体和顶层琼脂，9000×g离心15min，上层清液采用0.22μm滤膜过滤，纯化后的噬菌体在4℃下保存于SM缓冲液中；利用PEG-8000过夜富集噬菌体颗粒，20000×g氯化铯密度梯度离心1h，得到纯化的噬菌体。

如图1(A)所示，经过长时间培养，噬菌体斑块周围产生不断增加的光晕，12h后出现纯噬菌体斑块，3-7天后斑块周围光环增大，表明噬菌体具有多糖解聚酶活性；如图1(B)的透射电镜显示，短尾噬菌体的形态为头部50nm，尾部20nm×10nm。

实施例2主光谱测定

本实施例检测97株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体的裂解谱。细菌在37℃下过夜生长，取200μL细菌培养物接种于双层琼脂平板上，待顶部琼脂凝固后，加入10μL梯度稀释的噬菌体；37℃过夜孵育后，观察噬菌体对细菌的影响并进行评分。

结果发现，除宿主菌株(2302)外，其他肺炎克雷伯菌(0523、0581、0775、0805、0861、1093、1109、2226、2302、2328、2340)的噬菌体均形成明显的斑块，斑块周围有光环。根据wzi测序结果，所有菌株均属于K47荚膜分型。

实施例3噬菌体基因组DNA分离、测序和注释

向含有噬菌体的SM缓冲液中加入10μg/mL脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶A，37℃下处理1h，集中噬菌体；提取噬菌体DNA，得到222265个剪切reads；

采用Glimmer3.02分析噬菌体基因组的开放阅读框(ORF)，Genemark测定预测基因，采用BLAST对预测基因与已知的基因和蛋白序列进行比较，HHpred数据库作为多糖解聚酶注释的补充；此外，考虑到噬菌体应用于临床的安全性和稳定性，使用ProParam软件分析ORF编码蛋白的稳定性，使用VFDB数据库分析CPG岛。

结果发现，SH-KP152302的核苷酸序列是一个含有41420bp的线性基因组，GC含量为52.70％，包含48个假定的功能基因，平均长度为766bp。

功能蛋白有28个明确的功能基因，可分为4类：DNA组装和形态相关蛋白、DNA复制/重组/修饰蛋白、宿主裂解蛋白、以及未分类蛋白，剩余的是假定的功能蛋白，无毒力和耐药基因。

噬菌体SH-KP152302的ORF42编码蛋白由793个氨基酸组成；Blastp和HHpred结果显示，ORF42编码蛋白与噬菌体phiAB6(GenBank ID：KT339321)ORF49编码的蛋白5JS4具有相似性，但同源性较低(14％)。

ORF42包括四个保守域，即T7噬菌体尾丝蛋白、果胶酸裂解酶、含氮氧化酶和β螺旋结构域；其中，n端的结构域编码一个6条尾丝包围的尾管，是一种病毒蛋白gp17低聚体，属于T7噬菌体尾丝蛋白，可能与噬菌体头部结构相互作用；中间位置的结构域编码果胶裂解酶，果胶裂解酶是破坏糖苷键裂解细菌胞外多糖的主要结构域，属于糖苷水解酶家族28；毗邻果胶裂解酶结构域的位点编码含氮氧化酶，参与无机盐离子的转运和代谢。

实施例4噬菌体解聚酶的克隆、表达和纯化

本实施例利用如SEQ ID NO:3-4所示的特异性引物从噬菌体SH-K152302基因组中扩增出编码解聚酶的ORF42，并在扩增产物的两端引入SacI和HindIII(New EnglandBiolab)限制性位点；PCR扩增产物经SacI和HindIII酶切后，克隆到pSUMO3表达载体，将得到的orf42-pSUMO3质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，BL21(DE3)/pSUMO3-Dpo42细胞在37℃条件下、添加50μg/mL氨苄青霉素的1L LB中，摇匀培养至OD600为0.6；

解聚酶的重组表达采用0.5mM的IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)进行诱导，30℃孵化4h，离心(5000×g，30min，4℃)造粒，细胞在含PMSF的20mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，10％甘油，20mM咪唑，pH＝7.5)中复苏，超声冰上裂解；细胞碎片在4℃下、以12000rpm离心1h，随后采用镍离子柱进行蛋白纯化，采用裂解缓冲液平衡后，取上清液，并用20mM裂解缓冲液洗涤，用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，300mM咪唑，pH＝7.5)洗脱，得到融合蛋白SUMO-dpo42；

向融合蛋白SUMO-dpo42中加入SUMO蛋白酶，蛋白酶与融合蛋白的比例为1:5000(wt/wt)，4℃下、将混合物在透析缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10％甘油，20mM咪唑，pH＝7.5)中透析过夜，随后将裂解的蛋白溶液重新添加到Ni-NTA柱上，去除组氨酸标记SUMO和未消化的融合蛋白；将得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，并在30KD滤膜上离心富集(Thermo，USA)，最后将样品保存在-80℃。

如图2(A)所示，纯化后的重组SUMO-Dpo42融合蛋白在SDS-PAGE上以单条带形式迁移，与约102kDa蛋白标记相对应；采用SUMO蛋白酶对SUMO-dpo4融合蛋白的SUMO标签进行高效裂解后，进行SDS-PAGE电泳，如图2(B)所示，去除6×His标记的SUMO和未消化融合蛋白，纯化的解聚酶约85kDa。

实施例5细菌EPS纯化

将肺炎克雷伯球菌2226接种于新鲜的TSB培养基中过夜培养，37℃无搅拌培养5天，进行EPS纯化，具体步骤为：

向10mL细菌培养物中加入60μL甲醛溶液(36.5％)，温柔摇(100rpm)培养1h；加入1M NaOH，搅拌3h，提取EPS；细胞悬液在16800×g下离心1h，加入三氯乙酸(TCA，20％w/v)沉淀上清，去除蛋白质和核酸，将溶液在16800×g下离心1h，收集上清液；加入1.5倍体积的96％乙醇，-20℃下保存24h析出胞外多糖EPS；将得到的沉淀物经16800×g离心1h，重悬于双蒸水(ddH₂O)中；EPS混合物在4℃条件下、在过量的双蒸水(ddH₂O)中透析24h，使用12-14kDa分子量的滤膜去除低分子量杂质，最后对透析得到的EPS进行冻干称重。

实施例6生物膜形成

37℃过夜培养肺炎克雷伯菌，加入新鲜的TSB培养基进行稀释，培养至OD600＝0.1，48h和72h后形成生物膜，200μL新鲜TSB培养基作为阴性对照；孵育后取上清液，用200μL 1×PBS缓冲液冲洗两遍，每孔在室温下用200μL甲醇(10％v/v)处理15min；去除甲醇，室温晾干，每孔加入200μL结晶紫(1％v/v)孵育20min，用无菌水轻轻冲洗；加入100μL乙酸(33％v/v)对染色液进行溶解；在595nm处测定吸光度，实验重复三次。

实施例7解聚酶的功能分析

采用斑点法鉴定重组酶对肺炎克雷伯菌的降解作用：将指数期生长的细菌接种于LB软琼脂上，干燥后加入10μL酶液，37℃过夜孵育，光晕带的形成表明菌株对多聚酶敏感，将酶液进行梯度稀释，测定活性范围，SUMO蛋白为阴性对照组。

如图3所示，梯度稀释的多聚酶溶液在细菌培养板上形成光晕环。

为了鉴定Dpo42是一种多糖解聚酶，采用高效液相体积排阻色谱法(HPLC-SEC)对Dpo42的降解活性进行评价，具体步骤为：

纯化的EPS溶解于50mM Na₂HPO₄(pH＝7.0)中，以终浓度为0.5mg/mL与Dpo42(0.1μM)或SUMO(0.1μM)在37℃下孵育30min；90℃加热10min停止反应，进行HPLC分析；加样体积为20μL，洗脱体系为溶液A(0.2M磷酸盐缓冲液)，无溶液B；30min内采用溶液A作为流动相，以0.5mL/min流速进行色谱分析。

如图4所示，未经处理的EPS溶液显示单峰，保留时间在18-20min；与Dpo42孵育后，多糖在18-20min的峰值信号消失；然而，经SUMO处理的EPS，仍然在18-20min时显示单峰。

采用Miller法(二硝基水杨酸试剂测定还原糖)，对Dpo42在不同pH值(4.0-9.0)和不同温度(25-80℃)下的活性进行测定：以葡萄糖为分析标准，浓度范围为0.2-1.0mg/mL，每个试管中加入500μL标准溶液和1.5mL DNS，在100℃下煮沸5min，冷却到室温后以1:5(v/v)的比例与ddH₂O混合稀释；采用分光光度计测量550nm处的吸光度，绘制校准曲线。

在37℃、不同缓冲液条件下测定pH对酶活性的影响：缓冲液包括50mM乙酸钠缓冲液(pH＝4.0-5.0)、50mM Na₂HPO₄缓冲液(pH＝6.0-7.0)、50mMTris-HCl缓冲液(pH＝8.9-9.0)；在50mM Na₂HPO₄(pH＝7.0)、不同温度范围内(20-80℃)，研究温度对酶的作用的影响。结果以相对活性百分比表示，采用方差分析(p<0.001)和Dunnett pos检验进行统计学分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，误差条表示均值的标准误差。

如图5(A)所示，解聚酶在pH为5.0-9.0的范围内保持较高的活性，当pH为4.0时活性明显下降，相对活性为68.06％，由于肺炎克雷伯菌感染局部微环境的pH值为6.5-7.0，从这个角度来看，除了抗菌添加剂外，多聚酶有望成为抗病毒候选药物。

如图5(B)所示，解聚酶Dpo42在25℃～80℃范围内也表现出较高的活性，保证了其在治疗过程中达到最高的效率，同时作为抗菌/抗菌膜保留剂。

实施例8解聚酶的抗生物膜活性

采用肺炎克雷伯菌2226测定Dpo42对生物膜的抑制作用：

将细菌培养在新鲜的TSB培养基中至指数级中期，将100μL稀释后的样品加入96孔板，随后加入不同浓度(0.01、0.05和0.1μm)的重组解聚酶或SUMO，以稀释后的细菌培养液和新鲜的TSB培养基作为对照；37℃无搅拌培养72h后，用结晶紫染色法在595nm处测定残余生物膜。采用方差分析(p<0.001)和Dunnett pos检验进行统计学分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，误差条表示均值的标准误差。

如图6所示，与阴性对照相比，解聚酶处理的生物膜生长受到抑制。OD值在595nm处显著降低(P<0.05)；0.1μM多聚酶的抑制作用最强，表明Dpo42可以抑制生物膜的形成，并在生物膜的形成过程中表现出剂量依赖性。

采用肺炎克雷伯菌2226测定Dpo42对生物膜的去除作用：

将细菌接种于96孔板中生长48h，去除上清液，采用不同浓度的Dpo42或SUMO(0.01、0.05和0.1μM)处理细胞3h，以稀释的细菌培养液作为对照；采用结晶紫染色法评价生物膜的去除效果，并测定A595。采用方差分析(p<0.001)和Dunnett pos检验进行统计学分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，误差条表示均值的标准误差。

如图7所示，Dpo42处理后，生物膜的总附着生物量显著下降(P<0.05)，因此，Dpo42不仅可以抑制生物膜的形成，而且可以去除生物膜。

实施例9有效性实验

选取40只8-10周龄的雌性小鼠(20-22g)，随机分为5组，向其中的四组的小鼠腹腔注射100μL不同浓度的肺炎克雷伯菌菌液(10⁶CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁸CFU/mL，10⁹CFU/mL)，对照组注射同剂量的生理盐水。定期观察小鼠的死亡情况，将引起一组小鼠全部死亡的最小剂量定为最小致死量。

观察发现，注射浓度为10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL和10⁹CFU/mL的三组小鼠在24h内死亡，而注射浓度为10⁶CFU/mL的小鼠在24h内有3只死亡，5只存活，第5天后，剩余的5只小鼠也全部死亡。因此选择10⁶CFU/mL肺炎克雷伯菌的注射剂量建立败血症小鼠模型。

选取40只BALB/c小鼠，腹腔注射10⁶CFU/mL肺炎克雷伯菌建立败血症小鼠模型，随机分为5组，2小时后从尾静脉进行注射：第一组注射热失活噬菌体Dpo42悬液100μL/只，第二组注射生理盐水100μL/只，第三组注射0.01μM噬菌体Dpo42悬液100μL/只，第四组注射0.05μM噬菌体Dpo42悬液100μL/只，第五组注射0.1μM噬菌体Dpo42悬液100μL/只。每日观察小鼠的存活情况，共观察60天。

结果如图8所示，第三组的小鼠1天后出现死亡，在第60天仍有2只小鼠存活，存活率为25.0％；第四组的小鼠3天后出现死亡，在第60天仍有4只小鼠存活，存活率为50.0％；第五组的小鼠在第60天时全部存活，说明注射剂量为0.1μM的噬菌体Dpo42对小鼠的保护率达到100％。另外，第一组和第二组的小鼠在24小时内全部死亡，表明热失活的噬菌体Dpo42和生理盐水对感染的小鼠没有保护作用，证实噬菌体Dpo42可以有效的治疗小鼠由肺炎克雷伯菌引起的败血症。

实施例10安全性实验

选取32只BALB/c小鼠，随机分为4组，分别从腹腔注射不同浓度(0.1μM、0.2μM和0.3μM)的噬菌体Dpo42，注射量为100μl/只，对照组注射生理盐水100μl/只。

结果发现所有小鼠都正常存活，说明高浓度(0.3μM)的噬菌体Dpo42对小鼠也没有毒副作用。

综上所述，本发明筛选得到一种肺炎克雷伯菌噬菌体，命名为噬菌体SH-KP152302，具有降解生物膜的特性；从噬菌体SH-KP152302中鉴定出一种解聚酶Dpo42，由噬菌体SH-KP152302的ORF42编码，能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，所述解聚酶Dpo42不仅能够抑制生物膜的形成，而且可以去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性；解聚酶Dpo42在pH为5.0-9.0的范围内保持较高的活性，在25℃～80℃范围内也表现出较高的活性；解聚酶Dpo42对败血症小鼠具有显著的治疗效果，在高浓度下也没有毒副作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海瑞宙生物科技有限公司

<120> 一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用

<130> 20190508

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 793

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asp Gln Asp Ile Lys Thr Val Ile Gln Tyr Pro Val Gly Ala Thr

1 5 10 15

Glu Phe Asp Ile Pro Phe Asp Tyr Leu Ser Arg Lys Phe Val Arg Val

20 25 30

Ser Leu Val Ser Asp Asp Asn Arg Arg Leu Leu Ser Asn Ile Thr Glu

35 40 45

Tyr Arg Tyr Val Ser Lys Thr Arg Val Lys Leu Leu Val Glu Thr Thr

50 55 60

Gly Phe Asp Arg Val Glu Ile Arg Arg Phe Thr Ser Ala Ser Glu Arg

65 70 75 80

Ile Val Asp Phe Ser Asp Gly Ser Val Leu Arg Ala Ser Asp Leu Asn

85 90 95

Val Ser Gln Ile Gln Ser Ala His Ile Ala Glu Glu Ala Arg Asp Ala

100 105 110

Ala Leu Met Ala Met Pro Gln Asp Asp Ala Gly Asn Leu Asp Ala Arg

115 120 125

Asn Arg Arg Ile Val Arg Leu Ala Pro Gly Ile Ala Gly Thr Asp Ala

130 135 140

Val Asn Lys Asp Gln Leu Asp Thr Thr Leu Gly Glu Ala Gly Gly Ile

145 150 155 160

Leu Ser Asp Met Lys Asp Leu Glu Gly Glu Ile His Asp Tyr Ile Glu

165 170 175

Lys Phe Ala Asp Asp Thr Ala Leu Val Arg Gly Val Ala Trp Val Tyr

180 185 190

Asn Leu Gly Ser Ala Asp Gly Gly Glu Thr Val Ile Thr Ile Asn Lys

195 200 205

Ser Thr Arg Thr Tyr Ala Val Pro Tyr Ile Glu Val Asn Gly Ser Arg

210 215 220

Gln Glu Val Gly Tyr His Tyr Ser Phe Asp Leu Glu Thr Gln Gln Ile

225 230 235 240

Thr Leu Ala Thr Pro Leu Lys Ala Gly Asp Phe Val Met Val Met Thr

245 250 255

Thr Glu Ser Gln Leu Pro Val Glu Thr Leu Leu Ala Ser Ser Val Gly

260 265 270

Ala Ala Ser Ile Gly Thr Ala Thr Gly Glu Thr Val Glu Glu Arg Leu

275 280 285

Thr Arg Leu Tyr Gly His Phe Val His Pro Glu Thr Tyr Gly Ala Val

290 295 300

Gly Asp Gly Ile Thr Asp Asp Arg Val Ala Leu Gln Arg Ser Leu Asp

305 310 315 320

Val Ala Tyr Glu Asn Ala Leu Asn Gly Thr Gly Pro Ser Thr Val Arg

325 330 335

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340 345 350

Ser Gly Glu Leu Ala Ala Gly Arg Ser Ala Leu Cys Ile Arg Pro Gly

355 360 365

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370 375 380

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420 425 430

Val Ile Ser Asp Val Lys Val Leu Asn Ser Thr Ala Gly Gly Ile Tyr

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Val Ser Gly Cys Thr Val Asp Asn Ala Gly Tyr Ile Gly Ile Gln Met

465 470 475 480

Glu Arg Pro Tyr Asp Asn Thr Val Ile Gly Asn Thr Ile Asn Arg Cys

485 490 495

Glu Asp Asn Gly Ile Asp Val Phe Gly Asn Val Asn Asp Ala Thr Val

500 505 510

Thr Gly Ile Ala Gln Ser Thr Leu Ile Thr Gly Asn Asn Ile Arg Asp

515 520 525

Val Leu Asn Gly Val Phe Ile Glu Ser Cys Gly Asn Thr Asn Ile Thr

530 535 540

Gly Asn Tyr Ile Ala Asp Phe Arg Ser Ser Gly Val Ile Tyr Asn Arg

545 550 555 560

Ile Asn Ser Ala Ala Asn Asp Asn Ser Leu Thr Ser Asn Val Leu Ile

565 570 575

Gly Ala Ser Gly Ala Ser Ala Gly Val Ser Phe Lys Asn Ser Val Gly

580 585 590

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Met Lys Asn Ile Ala Lys Thr Leu Leu Phe Val Glu Ala Arg Asn Asn

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Gly Leu Val Lys Ser Arg Met Ser Thr Gln Phe Tyr Glu Gly Ala Gln

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Ile Val Ala Gly Asp Thr Val Val Ser Leu Asn Ser Ser Ser Val Ala

725 730 735

Val Gly Glu Tyr Leu Glu Ile Asn Ala Glu Val Tyr Lys Val Thr Ser

740 745 750

Val Ser Ala Thr Tyr Ala Val Val Arg Lys Trp Thr Gly Ser Asp Tyr

755 760 765

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

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atcgttgact tcagcgatgg ctcggttctc cgcgcttctg accttaacgt atctcaaata 300

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<210> 3

<211> 31

<212> DNA

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<400> 3

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<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cccaagcttt tactgttccc ccactgc 27

Claims

1.一种肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体的基因组的第42位开放阅读框编码解聚酶。

2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌的wzi分型为K47荚膜型；

优选地，所述噬菌体的基因组包括至少28个功能基因。

3.一种如权利要求1或2所述的肺炎克雷伯菌噬菌体的分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)向污水中加入肺炎克雷伯菌，培养后收集上清液；

(2)将上清液点斑于双层琼脂平板上，纯化后得到单一斑块；

4.一种如权利要求1或2所述的噬菌体表达的解聚酶，其特征在于，所述解聚酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述解聚酶的结构域包括T7噬菌体尾丝蛋白、果胶酸裂解酶、含氮氧化酶和右手β螺旋结构域；

优选地，所述解聚酶为85kDa。

5.编码如权利要求4所述的解聚酶的核酸序列；

优选地，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求5所述的核酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5所述的核酸序列和/或如权利要求6所述的表达载体。

8.一种如权利要求4所述的解聚酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括解聚酶；

10.一种如权利要求1或2所述的噬菌体、如权利要求4所述的解聚酶、如权利要求5所述的核酸序列、如权利要求6所述的表达载体、如权利要求7所述的宿主细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备肺炎克雷伯菌抑制剂、治疗肺炎克雷伯菌感染药物、抗生素替代制剂或消毒剂中的应用。