CN112458067A - 一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用 - Google Patents

一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112458067A
CN112458067A CN202011445321.4A CN202011445321A CN112458067A CN 112458067 A CN112458067 A CN 112458067A CN 202011445321 A CN202011445321 A CN 202011445321A CN 112458067 A CN112458067 A CN 112458067A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
polysaccharide
enzyme
depolymerase
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011445321.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112458067B (zh
Inventor
牟海津
肖梦诗
付晓丹
邢坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Ocean University of China
Original Assignee
Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Ocean University of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd, Ocean University of China filed Critical Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Priority to CN202011445321.4A priority Critical patent/CN112458067B/zh
Publication of CN112458067A publication Critical patent/CN112458067A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112458067B publication Critical patent/CN112458067B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种降解岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用，属于酶制备技术领域。所述制备方法具体包括：利用能够产生富含岩藻糖胞外多糖的宿主肠杆菌富集培养噬菌体，制备得到噬菌体富集液，采用超滤法从噬菌体富集液中分离噬菌体源多糖解聚酶酶液，并利用丙酮沉淀法进一步纯化酶液得到噬菌体源多糖解聚酶(Pb‑glyE1)。本发明得到的Pb‑glyE1酶活稳定，能够降解包括褐藻岩藻多糖和海参岩藻多糖等多种岩藻多糖。本发明提供了一种新型噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，产物酶活稳定且制备工艺简单易放大。此外为降解大分子岩藻多糖提供了有效的酶工具，有利于岩藻寡糖的产业化制备。

Description

一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及酶制备技术领域，特别是涉及一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用。
背景技术
岩藻多糖是一类来自于海洋藻类或者无脊椎动物的硫酸化多糖，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等活性功能。岩藻多糖由于存在分子量大，组成复杂，吸收性差等问题而限制了其在医药、食品和化妆品领域的应用。将大分子量岩藻多糖降解成小分子量岩藻寡糖可以有效提高岩藻多糖利用率和利用价值并拓展岩藻多糖的应用空间。
目前常用于降解岩藻多糖的方法主要是化学法，包括酸解法和氧化法。化学法具有生产条件严苛、产物聚合度不一、纯化难度大，得率低的特点而未在工业上广泛应用。酶解法降解岩藻多糖是一种高效、温和的方法，同时还可以保护多糖侧链基团不被破坏。噬菌体在侵染能够产生胞外多糖的宿主菌时可以产生一种降解酶——噬菌体源多糖解聚酶，它能够降解细菌表面胞外多糖，并通过攻击糖苷键来释放多糖重复单元。噬菌体源多糖解聚酶具有可控性高、制备重复性好、污染小、降解条件温和等优点，因而在酶解多糖应用上有一定的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题。在本方法中，从污水中筛选出肠杆菌的噬菌体，并从噬菌体中分离制备噬菌体源多糖解聚酶(Pb-glyE1)，得到的Pb-glyE1制备方法简单、酶活稳定，产量高，并且能够有效降解褐藻岩藻多糖和海参岩藻多糖。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)宿主细胞发酵液的制备：将宿主肠杆菌F-CE2接种于LB液体培养基中，37℃培养6～7h至对数生长期，获得肠杆菌发酵液备用；
(2)噬菌体培养液制备：利用产多糖解聚酶的噬菌体，经过纯化与富集，将效价达到1010～1012pfu/mL的噬菌体与步骤(1)中新鲜的肠杆菌发酵液按照体积比为1：10混合均匀，30～37℃培养3～12h，直至培养液OD600值降低至0～0.2；所述产多糖解聚酶的噬菌体保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为No.19978，保藏日期为2020年7月14日，命名为PF-CE2；分类学为肠杆菌噬菌体(Enterobacter phage)；
(3)噬菌体源多糖解聚酶的收集：步骤(2)得到的培养液6000～8000r/min离心10min去除菌体碎片，上清液使用10kDa超滤膜超滤以收集分子量大于10kDa的粗酶液；
(4)噬菌体源多糖解聚酶的精制：在低温的环境下，将预冷的丙酮与步骤(3)得到的粗酶液按照1～3：1体积比缓慢混合均匀，随后过夜静置，6000～8000r/min离心10min收集沉淀，真空冷冻干燥，得到噬菌体源多糖解聚酶酶粉。
优选的，得到的噬菌体源多糖解聚酶在pH为3～9，25～65℃之间具有解聚酶活性，酶活为500～1000U。
优选的，步骤(2)中所述的噬菌体能够有效侵染宿主肠杆菌，在分类学上属于长尾科噬菌体。
本发明还提供所述的任一用于降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法制备得到的噬菌体源多糖解聚酶。
本发明还提供所述的噬菌体源多糖解聚酶在降解岩藻多糖中的应用。
优选的，具体的应用方法为：岩藻多糖底物质量浓度为1％～10％，噬菌体源多糖解聚酶按照与岩藻多糖质量比为5～50％添加，反应时间为2～12h；酶解2h后可产生分子量小于1000Da的寡糖。
本发明提供的一种降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用，制备方法简单，成本低，得到的酶活性稳定、产量高，能够在大范围的温度和pH条件下应用，能够有效降解褐藻岩藻多糖和海参岩藻多糖，为大分子岩藻多糖的降解提供了有效的工具，有利于岩藻多糖在产业上的进一步运用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1肠杆菌生长曲线和噬菌体侵染肠杆菌曲线；其中正方形标志代表肠杆菌生长曲线，三角标志代表噬菌体侵染肠杆菌曲线；
图2为实施例1噬菌体形态的透射电镜图；
图3为实施例3温度对Pb-glyE1酶活的影响；
图4为实施例3温度对Pb-glyE1稳定性的影响；
图5为实施例3pH对Pb-glyE1酶活的影响；
图6为实施例4添加不同比例的Pb-glyE1对还原糖产生量的影响；
图7为实施例4不同底物浓度对还原糖产生量的影响；
图8为实施例4Pb-glyE1酶解褐藻源岩藻多糖得到的寡糖GPC分子量分布；
图9为实施例5Pb-glyE1酶解海参源岩藻多糖还原糖的产生量；
图10为实施例5Pb-glyE1酶解海参源岩藻多糖得到的寡糖GPC分子量分布。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1噬菌体的筛选与全基因组分析
(1)噬菌体的筛选
污水样品取自青岛市南区团岛污水处理场。将污水离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，取10mL滤液与10mL肠杆菌F-CE2(Enterobacter F-CE2，CGMCC No.20359，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为No.20359，保藏日期为2020年7月14日)菌液，于振荡培养箱中35℃，160r/min过夜培养。取上述培养物于50mL无菌离心管中，4℃环境下8000r/min离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤去除菌体，将滤液于4℃保存。重复上述操作富集噬菌体浓度。
采用双层平板法验证噬菌体的分离并评价噬菌体的效价：将4mL半固体培养基(上层培养基)煮沸熔化，冷却至适宜温度后备用。将噬菌体悬液用分装好的无菌生理盐水进行十倍倍比稀释至适当的稀释度后，取0.1mL待测稀释度的噬菌体悬液同0.9mL肠杆菌悬液混合均匀，同半固体培养基混匀，均匀倒在已经倒好的固体平板培养基上，迅速旋动铺盖均匀。冷却凝固后将平板翻转置于35℃恒温培养箱中过夜培养，观察并计算噬菌斑的数量。观察结果发现，平板上长出大量透明斑，并得到效价为1010pfu/mL的噬菌体悬液。
(2)噬菌体侵染曲线
将肠杆菌菌液以0.1％(V/V)接种量接入20mL LB液体培养基中，在振荡培养箱中37℃，180r/min培养，每隔0.5h取1mL菌液离心，用无菌PBS溶液重悬沉淀测定OD600，绘制肠杆菌生长曲线，并监测其对数生长期。接入2mL效价为1010pfu/mL的噬菌体悬液，测定混合液OD600，绘制噬菌体侵染肠杆菌曲线。结果如图1所示，肠杆菌的生长在3～5h内达到对数生长期，加入噬菌体悬液后，混合液OD600先升高后降低，在4h之后即可降低至0.2，6h后基本不变，结果表明噬菌体能够有效侵染宿主肠杆菌F-CE2。
(3)噬菌体形态
将噬菌体悬液用0.22μm滤膜过滤去除菌体，滤液用0.25％戊二醛固定。将噬菌体滤液放置在400目碳涂层铜网格上5分钟，然后用1％磷钨酸进行负染色10min。空气干燥10min，立即用JEM-1200EX显微镜在100kV加速电压下进行透射电镜扫描。噬菌体图像用4×4k快速高清相机拍摄，放大倍数为1～3×105。结果如图2所示，该噬菌体具有一个直径110nm的头和120nm长的无收缩尾鞘的细长尾，头部为六角形，尾部有一个吸附器官，这说明该噬菌体属于长尾科噬菌体。
实施例2Pb-glyE1的制备
将宿主肠杆菌F-CE2(CGMCC No.20359)接种于LB液体培养基中，37℃，180r/min培养4～6h至对数生长期(OD600＝0.4～0.6)，获得种子培养液；将效价为1010～1012pfu/mL的肠杆菌噬菌体与新鲜的肠杆菌种子液按照体积比为1：10混合均匀，37℃培养3～12h，直至发酵液OD600降低至0.1；将发酵液6000r/min离心10min去除菌体碎片，上清液使用10kDa超滤膜进行超滤，收集分子量大于10kDa的粗酶液；在低温的环境下，将预冷的丙酮与粗酶液按照体积比为1～3：1缓慢混合均匀，随后过夜静置，6000r/min离心10min收集沉淀，真空冷冻干燥得到酶粉，称重计算得率，并用DNS法计算酶活。结果如表1所示，酶的得率为1～5mg/mL，酶活为500～1000U，当丙酮与粗酶液添加比为2:1时，酶活最高为1000U。
DNS法测还原糖含量：将2mL 10mg/mL的肠杆菌胞外多糖溶液和0.4mL 2mg/mL Pb-glyE1混匀，在37℃下摇床培养4h，采用DNS法测定反应液中生成还原糖的含量。取一支10mL比色管，向其中加入反应液0.5mL，DNS试剂0.5mL充分混和均匀，置于沸水浴中恒温5min，取出后流水冷却至室温，加入蒸馏水定容至10mL，充分摇匀后，在可见分光光度计520nm处测定其吸光值。以等体积水和底物的混合液为空白对照。定义每分钟生成1μg葡萄糖的酶的量为一个酶活单位。
表1实施例2不同丙酮添加量Pb-glyE1产量和酶活
Figure BDA0002824255080000071
Figure BDA0002824255080000081
实施例3温度和pH对Pb-glyE1酶活的影响
(1)温度对酶活的影响
酶解温度设置为25℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，和65℃，自然pH条件下150r/min摇床培养30min后取反应液按照实施例2的方法测定Pb-glyE1酶活，以酶活力最大者为100％，计算相对酶活，考察不同酶解温度对酶活性的影响。同时考察Pb-glyE1在不同温度下的热稳定性，分别将粗酶液在25℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，和65℃温度下保温0.5h，3h后在测定酶活力，以未经保温的Pb-glyE1测定得到的酶活力为100％，计算相对酶活，考察Pb-glyE1的热稳定性。结果如图3所示，Pb-glyE1在45℃下酶活最高，当酶解温度提高时，酶活呈下降趋势，65℃条件下的相对酶活能达到最大值的60％，表现出较高的酶活力；Pb-glyE1在经过较高和较低温度的保温0.5h后，酶活性并无明显变化，说明该酶在高温条件下具有良好的稳定性；将保温时间延长至3h后测定酶活力，结果显示55～65℃的酶活同保温0.5h后测得的酶活相比稍有降低但并不明显(图4)。
(2)pH对酶活的影响
在确定了最适反应温度后，设置反应液的pH值为3、4、5、6、7、8及9，按照测定酶活的方法，考察不同pH值条件下的酶活，以酶活力最大者为100％，计算相对酶活，确定Pb-glyE1的最适pH值。pH对Pb-glyE1的影响见图5，可知在pH值为7的条件下酶活力最高，且该酶对pH较为敏感，在一定的pH值范围内(6～7)能够保持一定的稳定性，当pH值较大或者较小，酶活都出现明显的下降。
实施例4Pb-glyE1在降解褐藻源岩藻多糖的应用
将褐藻源岩藻多糖用超纯水配置成质量浓度1％的多糖溶液，添加酶活为1000U的Pb-glyE1搅拌均匀，Pb-glyE1按照占岩藻多糖质量5～50％的比例添加，反应温度45℃，pH为7.0，反应时间为8h。每隔1h取酶解液，用实施例2的方法测定还原糖的产生量。结果如图6所示，Pb-glyE1的添加量为多糖的30％以上时，约6h达到还原糖的最大产生量，随后保持不变。
将褐藻源岩藻多糖用超纯水配置成质量浓度1％～10％的多糖溶液，添加酶活为1000U的Pb-glyE1搅拌均匀，Pb-glyE1按照与岩藻多糖质量比为30％的比例添加，反应温度45℃，pH为7.0，反应时间为8h。每隔1h取酶解液，用实施例2的方法测定还原糖的产生量。结果如图7所示，底物浓度为3％或5％时，还原糖的产生量达到最高，浓度升高后，还原糖产生量迅速下降。
将褐藻源岩藻多糖用超纯水配置成质量浓度3％的多糖溶液，添加酶活为1000U的Pb-glyE1搅拌均匀，Pb-glyE1按照与岩藻多糖质量比为30％的比例添加，反应温度45℃，pH为7.0，反应时间为8h。每隔2h取酶解液，利用高效液相色谱测定其分子量分布，结果见图8。结果表明，Pb-glyE1酶解褐藻源岩藻多糖2h，即可产生分子量小于1000Da的寡糖，随着时间的延长，大于30kDa的多糖含量越来越少，小于1000Da的寡糖含量越来越高。
具体操作条件如下：
液相仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；示差检测器
液相柱型号：TSK-gel G4000PWXL
液相条件：0.2mol/L NaNO3溶液、0.01mol/L NaH2PO4溶液为流动相；柱温为30℃；流速为0.3mL/min；进样量为10μL；示差温度为35℃。
实施例5Pb-glyE1在降解海参源岩藻多糖的应用
将海参源岩藻多糖用超纯水配置成3％的多糖溶液，添加酶活为1000U的Pb-glyE1搅拌均匀，Pb-glyE1按照与岩藻多糖30％的比例添加，反应温度45℃，pH为7.0，反应时间为8h。每隔1h取酶解液，用实施例2的方法测定还原糖的产生量如图9所示，4h后还原糖产生量迅速升高，6～8h达到最高值且基本不变。每隔2h取酶解液，利用实施例4所述高效液相色谱测定其分子量分布，结果见图10，结果显示，酶解8h后，小于1000Da分子量的寡糖占80％以上，Pb-glyE1酶解效果较好。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)宿主细胞发酵液的制备：将宿主肠杆菌F-CE2接种于LB液体培养基中，37℃培养6～7h至对数生长期，获得肠杆菌发酵液备用；
(2)噬菌体培养液制备：利用产多糖解聚酶的噬菌体，经过纯化与富集，将效价达到1010～1012pfu/mL的噬菌体与步骤(1)中新鲜的肠杆菌发酵液按照体积比为1：10混合均匀，30～37℃培养3～12h，直至培养液OD600值降低至0～0.2；所述产多糖解聚酶的噬菌体保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为No.19978，保藏日期为2020年7月14日，命名为PF-CE2；
(3)噬菌体源多糖解聚酶的收集：步骤(2)得到的培养液6000～8000r/min离心10min去除菌体碎片，上清液使用10kDa超滤膜超滤以收集分子量大于10kDa的粗酶液；
(4)噬菌体源多糖解聚酶的精制：在低温的环境下，将预冷的丙酮与步骤(3)得到的粗酶液按照1～3：1体积比缓慢混合均匀，随后过夜静置，6000～8000r/min离心10min收集沉淀，真空冷冻干燥，得到噬菌体源多糖解聚酶酶粉。
2.根据权利要求1所述噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，其特征在于，得到的噬菌体源多糖解聚酶在pH为3～9，25～65℃之间具有解聚酶活性，酶活为500～1000U。
3.根据权利要求1所述的用于降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的噬菌体能够有效侵染宿主肠杆菌，在分类学上属于长尾科噬菌体。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的用于降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法制备得到的噬菌体源多糖解聚酶。
5.一种权利要求4所述的噬菌体源多糖解聚酶在降解岩藻多糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的噬菌体源多糖解聚酶在降解岩藻多糖中的应用，其特征在于，具体的应用方法为：岩藻多糖底物质量浓度为1％～10％，噬菌体源多糖解聚酶按照与岩藻多糖质量比为5～50％添加，反应时间为2～12h；酶解2h后可产生分子量小于1000Da的寡糖。
CN202011445321.4A 2020-12-09 2020-12-09 一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用 Active CN112458067B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011445321.4A CN112458067B (zh) 2020-12-09 2020-12-09 一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011445321.4A CN112458067B (zh) 2020-12-09 2020-12-09 一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112458067A true CN112458067A (zh) 2021-03-09
CN112458067B CN112458067B (zh) 2023-05-30

Family

ID=74802023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011445321.4A Active CN112458067B (zh) 2020-12-09 2020-12-09 一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112458067B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058369A (zh) * 2022-07-20 2022-09-16 威海迪普森生物科技有限公司 一种胞外多糖来源岩藻寡糖发酵型合生元的制备方法
CN115088719A (zh) * 2022-07-20 2022-09-23 北京雷力海洋生物新产业股份有限公司 岩藻寡糖的用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101503720A (zh) * 2009-02-24 2009-08-12 中国海洋大学 一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法
US8182804B1 (en) * 2004-09-13 2012-05-22 Trustees Of Boston University Engineered enzymatically active bacteriophages and methods of uses thereof
CN109929860A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 中国科学院大连化学物理研究所 一种岩藻多糖酶编码基因及酶的制备与应用
CN110079508A (zh) * 2019-05-10 2019-08-02 上海瑞宙生物科技有限公司 一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用
CN112011525A (zh) * 2020-09-02 2020-12-01 上海瑞宙生物科技有限公司 具有降解k64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8182804B1 (en) * 2004-09-13 2012-05-22 Trustees Of Boston University Engineered enzymatically active bacteriophages and methods of uses thereof
CN101503720A (zh) * 2009-02-24 2009-08-12 中国海洋大学 一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法
CN109929860A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 中国科学院大连化学物理研究所 一种岩藻多糖酶编码基因及酶的制备与应用
CN110079508A (zh) * 2019-05-10 2019-08-02 上海瑞宙生物科技有限公司 一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用
CN112011525A (zh) * 2020-09-02 2020-12-01 上海瑞宙生物科技有限公司 具有降解k64荚膜型肺炎克雷伯菌胞外聚合物的能力的解聚酶

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAZYNA等: "Capsule-Targeting Depolymerase, Derived from Klebsiella KP36 Phage, as a Tool for the Development of Anti-Virulent Strategy", 《VIRUSES》 *
商安琪: "Klebsiella噬菌体P13多糖解聚酶及相关功能基因的研究", 中国优秀硕士学位论文工程科技Ⅰ辑 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058369A (zh) * 2022-07-20 2022-09-16 威海迪普森生物科技有限公司 一种胞外多糖来源岩藻寡糖发酵型合生元的制备方法
CN115088719A (zh) * 2022-07-20 2022-09-23 北京雷力海洋生物新产业股份有限公司 岩藻寡糖的用途
CN115058369B (zh) * 2022-07-20 2024-02-20 威海迪普森生物科技有限公司 一种胞外多糖来源岩藻寡糖发酵型合生元的制备方法
CN115088719B (zh) * 2022-07-20 2024-05-24 北京雷力海洋生物新产业股份有限公司 岩藻寡糖的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN112458067B (zh) 2023-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112458067A (zh) 一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用
CN112210513B (zh) 产褐藻胶裂解酶菌株及其应用
CN113684157B (zh) 一株产果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用
CN111961619B (zh) 一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用
Prudnikova et al. The new strain of acetic acid bacteria Komagataeibacter xylinus B-12068–producer of bacterial cellulose for biomedical applications
Anusuya et al. Characterization and optimization of bacterial cellulose produced by Acetobacter spp.
CN108060187B (zh) 一种多糖及其制备方法和应用
CN115873757A (zh) 一株麦氏交替单胞菌及其应用
CN105624067B (zh) 一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶
CN116622538A (zh) 一株需钠弧菌及其应用
CN112458022B (zh) 高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和应用
CN116555094B (zh) 一株溶藻弧菌属多糖降解菌及其培养方法和应用
WO2024131919A1 (zh) 一种类芽孢杆菌及其在制备银耳低聚糖中的应用
CN115491321B (zh) 一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用
CN117511806B (zh) 一种嗜糖土地芽孢杆菌b37及其应用
CN112608962B (zh) 一种凝结芽孢杆菌素的提取方法
CN115161213B (zh) 用于植物根际促生菌剂制备的液体培养基及其应用
CN117417846B (zh) 一种枯草芽孢杆菌zl-1及其在降解塑料中的应用
CN114134076B (zh) 一株产胞外多糖地衣芽孢杆菌、絮凝剂及其在污水处理方面的应用
CN117625436B (zh) 一株降解二甲基乙酰胺的乙酰微小杆菌及培养方法和应用
CN116333911B (zh) 一株溶藻弧菌及其应用
CN110607266B (zh) 产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用
Eo et al. Nitrate permeability of semi‐permeable membranes prepared from binary blends of cellulose triacetate and chitosan
CN117778493A (zh) 一种提高棕色固氮菌生产褐藻胶的产量的方法
CN116286533A (zh) 一种改变鞘氨醇菌分散度提高聚乙烯醇降解能力的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant