CN114292836A - 一种内切沙门氏菌噬菌体的裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用 - Google Patents
一种内切沙门氏菌噬菌体的裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种沙门氏菌属来源的内切沙门氏菌裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。本发明沙门氏菌裂解酶L17来源于沙门氏菌属菌株，所述内切沙门氏菌裂解酶的理论等电点(PI)和分子量(mw)，分别是9.08和17107.69。不含信号肽和跨膜结构。本发明将该新沙门氏菌裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的沙门氏菌裂解酶L17，可在低温或常温下对沙门氏菌实现高效降解。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种内切沙门氏菌噬菌体的裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用。
背景技术
沙门氏菌可引起胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种症候群，可发生在食物链的收获、生产、加工、保存和其他从农场到消费者过程。为了控制沙门氏菌感染，抗生素是最有效的方法，但抗生素的滥用会导致环境残留和耐药菌的出现，噬菌体所分泌的裂解酶(lysin)是目前解决细菌耐药性的有效方法之一。
裂解酶是噬菌体侵染宿主菌并装配成熟子代噬菌体后合成的靶向和降解细菌细胞壁肽聚糖的一种水解酶，它和穴蛋白一起形成了双链DNA噬菌体的穴蛋白-裂解酶裂解系统，可以靶向裂解细菌细胞壁结构，从而引发宿主菌内源性裂解。
本发明的前期工作已分离并鉴定了一株沙门氏菌裂性噬菌体PSM6，并对其进行测序。(黄景晓,尚俊康,陈慧敏,等.一株烈性沙门氏菌噬菌体的生物学特性及基因组分析[J].生物技术通报,37(6):11.)。在此基础上，本发明通过原核表达的方式获得裂解酶L17，并进行细胞毒性活力和杀菌效果初探。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种内切沙门氏菌噬菌体的裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用。
本发明第一方面提供了从沙门氏菌菌株中分离得到的内切沙门氏菌裂解酶基因L17的氨基酸序列。
本发明第二方面提供了从沙门氏菌菌株中分离得到的内切沙门氏菌裂解酶基因L17的生物信息学预测，其预测结果如下：
(1)理论等电点(PI)和分子量(mw)，分别是9.08和17107.69，不含信号肽和跨膜结构，且蛋白在胞外的可能性极大。
(2)二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角以及无规卷曲组成。其中α-螺旋Hh由77个AA组成，占整个组分的50.00％；延伸链Ee由16个 AA组成，占整个组分的10.39％；β-转角Tt由15个AA组成，占整个组分的9.74％；无规卷曲(Cc)由46个AA组成，占整个组分的29.87％。
(3)模型GMQE值大小为0.77，QMEAN值大小为-0.42。
(4)与参考模板相比，该三级结构的序列覆盖率达0.95，相似性达 0.4。
本发明第三方面提供了从沙门氏菌菌株中分离得到的内切沙门氏菌裂解酶基因L17的表达方法，所述方法将上述内切沙门氏菌裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切沙门氏菌裂解酶。
进一步地，重组表达内切沙门氏菌裂解酶的表达载体，是大肠杆菌表达载体。
进一步地，用于重组表达内切沙门氏菌裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞。
本发明第四方面提供了从沙门氏菌菌株中分离得到的内切沙门氏菌裂解酶基因L17的细胞毒性活力初探。
本发明第五方面提供了从沙门氏菌菌株中分离得到的内切沙门氏菌裂解酶基因L17的杀菌效果条件初探。
本发明的有益效果：生物信息学分析结果显示，L17序列的理论等电点(PI)和分子量(mw)，分别是9.08和17107.69，不含信号肽和跨膜结构，且蛋白在胞外的可能性极大。主要参与的生物过程有：细胞壁大分子分解过程(GO：0016998)、肽聚糖分解过程(GO：0009253)、细胞裂解(GO： 0019835)，含有AfaI、AluI、AsuII、EcoRI、HpaII、MseI、MspI、RsaI、 TaqI的酶切位点。二级结构中α-螺旋Hh有77个AA，占50.00％；延伸链Ee有16个AA，占10.39％；β-转角Tt有15个AA，占9.74％；无规卷曲(Cc)有46个AA，占29.87％。三级结构模型GMQE值大小为 0.77，QMEAN值大小为-0.42，与参考模板相比，该三级结构的序列覆盖率达0.95，相似性达0.4。
虽然剂量达500μg/mL的L17对巨噬细胞有刺激性，但是L17的最佳作用浓度为20μg/mL且250μg/mL以下无毒无刺激，说明其使用在安全范围内。分别与0.10mol/mL EDTA、CA和L-MA联用时，具有杀菌效果，具有广阔的应用前景，可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药等领域。
附图说明
图1裂解酶L17的跨膜结构预测图，理论等电点(PI)和分子量 (mw)，分别是9.08和17107.69，不含信号肽和跨膜结构，且蛋白在胞外的可能性极大。主要参与的生物过程有：细胞壁大分子分解过程(GO： 0016998)、肽聚糖分解过程(GO：0009253)、细胞裂解(GO：0019835)，含有AfaI、AluI、AsuII、EcoRI、HpaII、MseI、MspI、RsaI、TaqI的酶切位点。
图2裂解酶L17的二级结构预测图，二级结构由α-螺旋、延伸链、β- 转角以及无规卷曲组成。其中α-螺旋Hh由77个AA组成，占整个组分的50.00％；延伸链Ee由16个AA组成，占整个组分的10.39％；β-转角 Tt由15个AA组成，占整个组分的9.74％；无规卷曲(Cc)由46个AA组成，占整个组分的29.87％。
图3裂解酶L17的三级结构模型图，模型GMQE值大小为0.77， QMEAN值大小为-0.42。GMQE为全局模型质量估计，一种来自目标模板对准结合性质的质量评估，所得的GMQE分数表示为0到1之间的数字，反映了使用该比对和模板构建的模型的预期准确性以及目标的覆盖范围，数字越高表示可靠性越高，QMEAN是基于不同几何特性的复合估计量，并基于一个模型提供全局(即针对整个结构)和局部(即针对每个残基)绝对质量估计。与参考模板相比，该三级结构的序列覆盖率达0.95，相似性达0.4。
图4裂解酶L17的酶切消化验证图，使用琼脂糖电泳及酶切消化来验证重组表达质粒，电泳条带大小均与预期相符合。
图5裂解酶L17的表达鉴定SDS-PAGE分析图，挑取克隆子，利用 IPTG诱导蛋白表达，经12％SDS-PAGE分析，目标蛋白部分存在于上清中，说明其为可溶性表达。
图6裂解酶L17的蛋白纯化SDS-PAGE分析图，通过Ni柱亲和纯化目标蛋白，进行12％SDS-PAGE电泳验证分析，得到的条带单一，表明纯化成功。
图7裂解酶L17的蛋白SDS-PAGE鉴定分析图，通过Ni柱亲和纯化目标蛋白，进行12％SDS-PAGE电泳验证分析，得到的条带单一，表明纯化成功。
图8裂解酶L17对巨噬细胞毒性活力的影响。
图9、10染毒前后解酶L17对巨噬细胞RAW264.7的影响， RAW264.7细胞在L1终浓度为500μg/mL孵育24h，细胞毒性活力为 13.61％，250μg/mL细胞毒性活力为78.65％且浓度低于250μg/mL未见明显细胞毒性，甚至终浓度5μg/mL的细胞毒性活力为101.23％，高剂量L17具有毒性或者刺激性，可激活巨噬细胞RAW 264.7，长出伪足、空泡化，而低剂量的L17则不刺激巨噬细胞。
图11的单独使用裂解酶L17的不同作用浓度的效果，单独使用L17 的杀菌活性极低，其中最佳作用浓度为20μg/mL处理2h吸光度下降约 0.53，其它浓度组吸光度几乎没有下降。
图12解酶L17分别联用低浓度的外膜渗透剂(CA、L-MA、EDTA) 的效果，L17和分别和0.10mol/mL的柠檬酸CA、L型苹果酸酸MA、 EDTA联用37℃处理2h，吸光度分别下降30％、33％和37％。
图13本发明裂解酶的序列
具体实施方式
本发明试验用噬菌体宿主菌肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica subsp.enterica，GIM1.1105)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。肠炎沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica subsp.enterica bacteriophage)PSM6，于2020年8月25日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为:GDMCC No:61171- B1，现存活，该噬菌体为申请公布号CN112760295A(申请公布日:2021.05.07)公布的肠炎沙门氏菌噬菌体。
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1裂解酶L17的生物信息学分析。
本发明的前期工作已分离并鉴定了一株沙门氏菌裂性噬菌体PSM6，并对其进行测序。(黄景晓,尚俊康,陈慧敏,等.一株烈性沙门氏菌噬菌体的生物学特性及基因组分析[J].生物技术通报,37(6):11.)。对其中一个裂解酶L17进行生物信息学分析。使用EMBOSSTranseq (https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/)将L17的核苷酸序列翻译成蛋白质；采用Interpro、Pfam工具预测分析L17蛋白序列的保守结构域，用SignalP工具分析信号肽；TMHMM分析跨膜结构；采用psipred 和swiss-model分析二级和三级结构；采用expasy的protparam工具计算需表达酶的等电点和分子质量数等，南京德泰生物镜像网站分析酶切位点。
实施例2裂解酶L17的表达与纯化。
L17基因扩增和重组质粒的构建：根据L17基因序列，使用 PrimerPremier设计特异性引物。以噬菌体PSM6的基因组核酸为模板进行 PCR扩增L17基因。扩增产物和pCOLDⅡ质粒各自经同样限制性内切酶酶切后，进行酶连。酶连产物转化大肠杆菌TOP10菌株感受态细胞。用氨苄青霉素筛选重组子，并用测序验证。最终构建成重组表达质粒载体 pCOLDⅡ-L17。
将pCOLDⅡ-L17载体转化至大肠杆菌BL21(DE)3Plyss感受态细胞：取1μL提取出来的载体pCOLDⅡ-L17加入100μL培养至云雾状的感受态细菌中，冰浴20min；42℃热激90s，重新转置冰内保持5min，加入 600μL LB液体培养基；在37℃培养箱中，以220r/min，振摇1h；以 5500r/min离心8min后，涂布于提前准备好的LB固体培养基转化平板 (含50μg/mLAmp)，37℃过夜培养。
IPTG诱导pCOLDⅡ-L17载体融合蛋白的表达：观察LB固体转化平板的菌落生长情况，并使用接种环挑取单克隆菌落，于3mL LB液体培养基(含50μg/mL Amp)的试管中，在37℃培养箱中，以220r/min振摇，过夜培养；次日，以1:100的比例，将菌液重新接种于30mL LB培养液(含50μg/mL Amp)中，37℃220r/min将菌液培养至一定浓度(即 OD600nm约为0.6～0.8)；吸取1mL菌液，以10000r/min，室温离心2 min后，弃上清；吸入100μL 1×上样缓冲液轻柔吹打菌体；向剩余菌液，加入IPTG(终浓度为0.4mM)，在11℃的培养箱中，以220r/min振摇，过夜培养以诱导表达融合蛋白；取出1mL培养物，10000r/min离心 2min，弃上清，吸入100μL 1×上样缓冲液轻柔吹打菌体。剩余菌悬液以 4000r/min，离心10min，弃上清，吸入PBS重悬；之后使用超声波破碎，分别取上层清液与下层沉淀液加入上样缓冲液重悬；检测分析使用 12％SDS-PAGE电泳，使用考马斯亮蓝脱色摇床以显色。
Ni柱纯化：利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至以Ni-IDA结合缓冲液预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱；以 0.5mL/min用Ni-IDA结合缓冲液流速冲洗，至流出液OD280nm值到达基线；以1mL/min流速用Ni-IDA清洗缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM 咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)冲洗，至流出液OD280nm值到达基线；以 1mL/min流速用Ni-IDA洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，250mM咪唑， 0.15M NaCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜，进行12％SDS-PAGE分析。
实施例3CCK8法测L17的细胞毒性活力。
RAW 264.7细胞的复苏培养：用镊子将RAW 264.7的细胞冻存管取出于冰上，电磁炉煮水预热至37～40℃，细胞放入温水并温和摇晃至冻存管内冰块融化时，将细胞移至细胞房生物安全柜内。取10mL DMEM培养基(含10％FBS及1％青霉素-链霉素)于15mL离心管，800rpm离心 4min，倒弃上清，继续培养基轻柔吹打细胞至悬浮，重复离心。加2mL 培养基轻柔吹打细胞至悬浮后将其移至培养皿，在培养皿上继续加入4 mL培养基，移至含5％CO2培养箱，37℃培养。
CCK8法测L17的细胞毒性活力；在96孔板中接种100μL复苏后的Raw 264细胞(细胞密度约5×104个/mL)，然后加入100μL不同浓度的 L17(0、10、50、100、500、1000μg/mL)处理细胞。24h后，将10μL CCK8试剂添加到每个孔中并孵育4h，测量OD450nm，细胞活率通过以下公式计算：(OD实验组–OD调零)/(OD对照组–OD调零)×100％。
实施例4L17单独使用及联用低浓度的外膜渗透剂的杀菌活性。
通过浊度分析法，研究裂解酶的杀菌活性，以肠炎沙门氏菌的宿主菌调细菌重悬液的浓度：将宿主菌过夜培养后，在10mL的离心管加入10％氯仿处理20min，以8000r/min离心处理后的菌液10min，弃上清，用 PBS缓冲液吹打重悬，重复离心3次取菌体，使用PBS将菌体调至 OD600nm约0.8～1.0的细菌重悬液。
单独使用裂解酶的最佳浓度：向160μL细菌重悬液加入40μL不同浓度的裂解酶(0、5、25、50、100、150μg/mL)，即终浓度为0、1、 5、10、20、30μg/mL，37℃静置培养2h，测OD600nm，以求最佳作用的裂解酶浓度。
联用低浓度外膜渗透剂的作用浓度：向160μL细菌重悬液加入20μL 最佳作用浓度的裂解酶，再分别加入终浓度为0.10mol/mL外膜渗透剂 (EDTA、CA、L-MA)37℃静置培养2h，测OD600nm。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (5)
1.一种内切沙门氏菌噬菌体的裂解酶L17，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利眼球1所述沙门氏菌噬菌体裂解酶的基因。
3.根据权利2要求所述的基因，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.一种内切沙门氏菌噬菌体裂解酶L17的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)L17基因扩增和重组质粒的构建。
(2)pCOLDⅡ-L17载体转化至大肠杆菌BL21(DE)3Plyss。
(3)IPTG诱导pCOLDⅡ-L17载体融合蛋白的表达。
(4)Ni柱纯化。
5.一种内切沙门氏菌噬菌体裂解酶L17在制备杀灭沙门氏菌的杀菌制剂中的应用。
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