CN109837284B - 柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用，并具体公开了一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。本发明通过抑菌蛋白CsLTP3密码子优化，原核表达载体构建，rCsLTP3的重组表达、纯化及鉴定，得到的rCsLTP3蛋白具备较好的热稳定性、酸碱稳定性，而且在活体条件下，对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌具有明显的抑制效果，与现有技术相对，本发明中的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的天然抑菌剂，能够显著降低柑橘果实采后绿霉病的发生，且减少化学杀菌剂造成的危害，在柑橘果实防腐保鲜领域具有良好的应用前景。

Description

柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用

技术领域

本发明属于柑橘采后绿霉病防治领域，更具体地，涉及一种柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用，可应用于防治芸香科植物果实(如柑橘)采后绿霉病，即利用基因工程制备柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3的方法以及利用该方法制备的提取物作为植物源抑菌剂在诸如柑橘采后病害绿霉病防治中的应用。

背景技术

柑橘是全球第一大水果，在其采收、运输及贮藏期间，因措施不当导致果实损伤，易遭受多种病原菌的侵染产生采后病害，导致果实腐烂变质，给柑橘产业带来巨大经济损失[1]。由指状青霉(Penicillium Digitatum)和意大利青霉(Penicillium Italicum)引起的柑橘绿霉病和青霉病是柑橘采后的两大主要病害，导致的腐烂率为70％～80％[2-3]，其中以指状青霉引起的腐烂尤为严重[4]。这种柑橘采后病害主要表现为，果实上病部先发软，呈水渍状，2-3天后产生白霉状物(病原菌的菌丝体)，后中央出现绿色粉状霉层(病原菌的子实体)，嗅之有闷人的芳香味，很快全果腐烂，果肉发苦，不堪食用。目前控制柑橘采后病害及贮藏保鲜的方法主要是采用化学杀菌剂(如苯并咪唑类、咪唑类、抑霉唑、双胍盐类等)结合物理贮藏技术(如低温、热处理等)处理果实[5]。虽然化学杀菌剂对柑橘采后病害有一定的控制作用，但其毒性大、环境污染严重，给人类健康带来严重威胁，许多化学杀菌剂的使用在很多国家遭到限制。而且由于这些药剂长期使用使致病菌产生抗药性，导致采后病害控制方法更加复杂化，影响保鲜效果。因此，寻找一种具有抑制柑橘病原菌活性的植物天然活性物质来控制柑橘采后病害对柑橘产业的发展具有重大意义。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)因具有广谱的抗细菌活性，高效的抗真菌、病毒和原虫的活性；热稳定性好；抗菌机理独特，不易产生抗药性等特性，正引起人们的关注，有望成为替代抗生素的产品之一。研究发现抗菌肽广泛存在于原核生物、植物及动物体内，并在生物的天然防御系统中起着重要的作用。抗菌肽包括抗细菌多肽(antibacterial peptides)和抗真菌多肽(antifungal peptides)[6]。目前，国内对植物源抗菌肽的研究相对较少。有研究报道非特异性脂质转运蛋白(Non-specific lipidtransfer protein,nsLTP)具备广泛的抗真菌功能[7]。但未见直接采用非特异性脂质转运蛋白这类抗菌肽作为植物源抑菌剂在果蔬采后病害防控方面的研发应用报道。参考文献：

[1]Brown G E,Chambers M.Evaluation of biological products for thecontrol of postharvest diseases of Florida citrus[C]//Proc.Fla.StateHort.Soc.1996,109:278-282.

[2]Demirci F.Effects of'Pseudomonas fluorescens'and'Candida famata'onBlue Mould of Citrus Caused by'Penicillium Italicum'[J].Australian Journal ofCrop Science,2011,5(3):344.

[3]何天富.柑橘学[M].北京:中国农业出版社,1997:714-734.

[4]Macarisin D,Cohen L,Eick A,et al.Penicillium digitatum suppressesproduction of hydrogen peroxide in host tissue during infection of citrusfruit[J].Phytopathology,2007,97(11):1491-1500.

[5]Sayago J E,

R M,Kovacevich L N,et al.Antifungal activityof extracts of extremophile plants from the Argentine Puna to control citruspostharvest pathogens and green mold[J].Postharvest biology and technology,2012,67:19-24.

[6]de Souza

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[7]Kirubakaran S I,Begum S M,Ulaganathan K,et al.Characterization ofa new antifungal lipid transfer protein from wheat[J].Plant physiology andBiochemistry,2008,46(10):918-927.

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用，抑菌蛋白CsLTP3可作为植物源抑菌剂应用于防治芸香科植物果实(如柑橘)采后绿霉病，其中通过抑菌蛋白CsLTP3密码子优化，原核表达载体构建，CsLTP3的重组表达、纯化及鉴定，得到的rCsLTP3蛋白具备较好的热稳定性、酸碱稳定性，而且在活体条件下，对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌(Penicillium digitatum)具有明显的抑制效果。与现有技术相对，本发明中的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的天然抑菌剂，能够显著降低柑橘果实采后绿霉病的发生，且减少化学杀菌剂造成的危害，在柑橘果实防腐保鲜领域具有良好的应用前景。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其中，

所述正向引物包括SEQ ID NO:3所示的序列；

所述反向引物包括SEQ ID NO:4所示的序列。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种rCsLTP3重组蛋白，其特征在于，该蛋白为：

i.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

或ii.与SEQ ID No.1所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；

或iii.SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.01～1mmol/L IPTG，在12～37℃诱导4～24h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；优选的，是将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，在20℃诱导16h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；

其中，所述重组菌为转入CsLTP3基因原核表达载体的大肠杆菌；所述CsLTP3基因原核表达载体具体是以如权利要求1所述密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因为模板，并利用如权利要求2所述用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物经PCR反应构建得到的。

作为本发明的进一步优选，生成的所述rCsLTP3重组蛋白还经过纯化处理，所述纯化处理具体是先收集诱导后的重组菌，然后对这些重组菌进行PBS洗涤、离心、重悬于冰预冷的裂解缓冲液、以及超声破菌处理，然后离心收集上清，接着用滤膜过滤该上清，得到的滤液经HIS镍柱纯化体系纯化洗脱处理后收集洗脱液即得到rCsLTP3重组蛋白。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种鉴定rCsLTP3重组蛋白的方法，该方法是将待鉴定蛋白与CsLTP3蛋白经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，若从所述待鉴定蛋白上鉴定出能够匹配CsLTP3蛋白的6个有效特异性肽段，则该待鉴定蛋白属于rCsLTP3重组蛋白；否则，该待鉴定蛋白不属于rCsLTP3重组蛋白；

其中，所述CsLTP3蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的序列。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种检测上述rCsLTP3重组蛋白热稳定性或酸碱稳定性的方法，其特征在于，

将rCsLTP3重组蛋白置于不超过120℃的温度条件下0-15min，优选是将rCsLTP3重组蛋白置于-80℃～120℃的温度条件下0-15min，通过观察该蛋白是否降解来检测该rCsLTP3重组蛋白的热稳定性，优选的，该蛋白不发生降解；

或者，将rCsLTP3重组蛋白置于4～9的pH条件下，通过观察该蛋白是否降解来检测该rCsLTP3重组蛋白的酸碱稳定性，优选的，该蛋白不发生降解。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种用于防治芸香科植物果实采后绿霉病的药物，其特征在于，该药物含有上述rCsLTP3重组蛋白；优选的，该药物是在含10³-10⁸CFU/ml的指状青霉菌孢子的悬浮液中混合rCsLTP3重组蛋白得到的；优选的，所述悬浮液中的指状青霉菌孢子满足10⁶CFU/ml；所述rCsLTP3重组蛋白在该悬浮液中的添加量为0.1-1mg/ml，优选为500μg/ml。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种检测抗菌肽rCsLTP3重组蛋白对芸香科植物果实采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制效果的方法，其特征在于，将接种了混合有0.1-1mg/ml上述rCsLTP3重组蛋白、并含10³-10⁸CFU/ml的指状青霉菌孢子悬浮液的芸香科植物果实，与接种了未混合上述rCsLTP3重组蛋白、但含10³-10⁸CFU/ml的指状青霉菌孢子悬浮液的芸香科植物果实这两种芸香科植物果实的腐烂率进行比较，由此检测抗菌肽rCsLTP3重组蛋白对芸香科植物果实采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制效果；

优选的，所述接种了混合有0.1-1mg/ml rCsLTP3重组蛋白、并含10³-10⁸CFU/ml的指状青霉菌孢子悬浮液的芸香科植物果实其腐烂率降低；

优选的，0.1-1mg/ml所述rCsLTP3重组蛋白优选为500μg/ml；所述悬浮液中指状青霉菌孢子均满足10⁶CFU/ml；

优选的，所述芸香科植物果实为柑橘。

按照本发明的另一方面，本发明提供了上述密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因、上述用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物、上述rCsLTP3重组蛋白作为植物源抑菌剂、上述诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法、上述鉴定rCsLTP3重组蛋白的方法、上述检测rCsLTP3重组蛋白热稳定性或酸碱稳定性的方法、上述用于防治芸香科植物果实采后绿霉病的药物、或上述检测抗菌肽rCsLTP3重组蛋白对芸香科植物果实采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制效果的方法在防治芸香科植物果实采后绿霉病中的应用。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，通过密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因、用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物、rCsLTP3重组蛋白、诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法、鉴定rCsLTP3重组蛋白的方法、检测rCsLTP3重组蛋白热稳定性或酸碱稳定性的方法、用于防治芸香科植物果实采后绿霉病的药物或检测抗菌肽rCsLTP3重组蛋白对芸香科植物果实采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制效果的方法等，提供了可用于防治芸香科植物果实采后绿霉病的方法；并且，密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因、用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物、rCsLTP3重组蛋白、诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法、或鉴定rCsLTP3重组蛋白的方法等，均可应用于制备用于防治芸香科植物果实采后绿霉病的药物或保鲜剂；rCsLTP3重组蛋白可作为抗菌肽，并作为植物源抑菌剂应用于防治柑橘采后绿霉病中。本发明得到的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的天然抑菌剂，能够显著降低柑橘果实采后绿霉病的发生，且减少化学杀菌剂造成的危害，在柑橘果实防腐保鲜领域具有良好的应用前景。

本发明尤其通过对rCsLTP3重组蛋白的诱导表达及纯化步骤的工艺条件及参数进行优化，将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.01～1mmol/L IPTG，在12～37℃诱导4～24h后(尤其是将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，在20℃诱导16h后)，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；并且，对于生成的rCsLTP3重组蛋白，本发明还利用纯化工艺处理，即先收集诱导后的重组菌，然后对这些重组菌进行PBS洗涤、离心、重悬于冰预冷的裂解缓冲液、以及超声破菌处理，然后离心收集上清，接着用滤膜过滤该上清，得到的滤液经HIS镍柱纯化体系纯化洗脱处理后收集洗脱液即得到rCsLTP3重组蛋白。本发明通过对重组蛋白的诱导表达及纯化步骤所采用的工艺流程整体、及各个步骤所涉及的具体工艺条件及参数(如试剂的种类及配比，处理的温度及时间，离心处理的时间及离心力大小等)进行控制，使得rCsLTP3重组蛋白产率高，且纯度高。

核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示序列的密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，即CsLTP3基因密码子优化的核苷酸序列，尤其适合大肠杆菌表达；在诱导表达rCsLTP3蛋白时，利用已转入CsLTP3基因原核表达载体的大肠杆菌为重组菌(该CsLTP3基因原核表达载体具体是以上述密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因为模板，并利用上述用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物经PCR反应构建得到的；该引用基于芸香科植物，如柑橘中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因)，使得rCsLTP3能大量的、可溶性的表达；诱导表达后的菌经纯化可得到重组蛋白，且纯化得到的蛋白纯度较高(该蛋白的分子量例如为约27kDa，该蛋白经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定可得到6个特异性有效肽段)。

本发明中的rCsLTP3重组蛋白可作为抗菌肽，例如，可将rCsLTP3蛋白与常规使用的指状青霉菌孢子悬浮液(如含10⁶CFU/ml的指状青霉菌孢子悬浮液)混合，使得最终的悬浮液中抗菌肽rCsLTP3的浓度为例如500μg/ml，然后再对诸如柑橘果实进行接种，从而可降低柑橘果实腐烂率；本发明还可在活体条件下检测抗菌肽rCsLTP3对诸如柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制效果(可通过将其与仅接种了指状青霉菌孢子悬浮液的芸香科植物果实相对比，本发明中通过使用含有rCsLTP3重组蛋白的药物，尤其是通过接种特定rCsLTP3重组蛋白、指状青霉菌孢子含量的混合悬浮液，柑橘果实腐烂率明显降低)。并且，该rCsLTP3蛋白热稳定性好，能耐受120℃高温处理不发生降解；酸碱稳定性好，能耐受PH4-9的条件处理。

综上，本发明提供的一种制备柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3的方法以及利用该方法制备的提取物作为植物源抑菌剂在柑橘采后病害绿霉病防治中的应用。其中，通过优化CsLTP3基因原核表达序列，基因合成，构建抗菌肽过敏原CsLTP3的原核表达体系，优化表达纯化rCsLTP3蛋白的方法，质谱鉴定该重组蛋白，检测rCsLTP3蛋白的热稳定性和酸碱稳定性，并且在活体条件下，检测抗菌肽rCsLTP3对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制效果。与现有技术相比，本发明所提供的抗菌肽rCsLTP3对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌具有明显的抑制效果，且本发明所采用的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的植物源抑菌剂，能减少化学杀菌剂造成的危害，对柑橘果实防腐保鲜和食品安全有重要意义。

附图说明

图1是柑橘抗菌蛋白CsLTP3抗原表达、蛋白纯化、热稳定性酸碱稳定性检测及其应用技术流程图。

图2是原核表达载体构建图。(a)，构建的原核表达载体模式图。(b)，泳道M：DNALadder；泳道1：构建的载体pET-32a(+)-CsLTP3，即pET-32a(+)/Trx-His-CsLTP3；泳道2，pET-32a(+)/Trx-His-CsLTP3质粒双酶切(EcoRI，XhoI)。

图3是Trx-His-CsLTP3蛋白表达及纯化。M，蛋白分子质量标准；1，重组菌未诱导；2，重组菌经IPTG诱导；3，经IPTG诱导后的重组菌裂解上清；4，纯化后的Trx-His-CsLTP3蛋白。

图4是MALDI-TOF/TOF鉴定CsLTP3蛋白。图中粗体字展示了有效鉴定的肽段。

图5是rCsLTP3蛋白稳定性检测。(a)rCsLTP3蛋白热稳定性检测，(b)rCsLTP3蛋白酸碱稳定性检测。

图6是rCsLTP3蛋白处理后接种指状青霉菌第3天柑橘果实的发病情况。

图7是统计分析rCsLTP3蛋白处理后接种指状青霉菌第3天柑橘果实的发病病斑面积。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3基因检索、密码子优化、全基因合成

1.1柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3基因检索

通过已发表文章(如，Jinlong Wu,Lin Chen,Dingbo Lin,Zhaocheng Ma*,andXiuxin Deng*.Development and Application of a Multiplex Real-Time PCR Assayas an Indicator of Potential Allergenicity in Citrus Fruits.Journal ofagricultural and food chemistry,2016,64(47):9089-9098.)中非特异性脂转移蛋白(GenBank XP_006429565.1)的氨基酸序列，通过序列同源性在甜橙基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)搜索对应的柑橘非特异性脂转移蛋白并获得基因序列，如表1所示。

表1柑橘非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因信息

1.2过敏原基因CsLTP3序列密码子优化及全基因合成

不同物种的种属之间，对同义密码子的使用频率是不同的，存在密码子偏好性。在外源基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，外源基因的表达水平会显著提高。本发明中的过敏原基因CsLTP3可使用JCat工具(http://www.jcat.de/)进行密码子优化，优化后的氨基酸和核苷酸序列，如表2所示。密码子优化后CsLTP3基因编码的氨基酸序列如表2所示。全基因合成委托武汉金开瑞生物工程有限公司完成。

表2密码子优化后的核苷酸序列

注：CsLTP3^＊为氨基酸序列，CsLTP3为原始的核苷酸序列，CsLTP3^#为优化后的核苷酸序列

实施例2原核表达载体构建

2.1引物设计

本发明中的引物使用Primer 5.0软件设计，引物的核苷酸序列如表3所示。所有引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表3引物

注：表格中的CsLTP3-F,CsLTP3-R为正向反向引物。粗体文本15bp表示载体构建所用的接头。斜体表示5’端EcoRI和3’端XhoI酶切位点。

2.2载体构建

本发明使用同源重组一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit,由南京诺唯赞生物科技有限公司提供)的方法构建原核表达载体pET-32a(+)/Trx-His-CsLTP3。具体如下，以合成的CsLTP3基因为模板,CsLTP3-F,CsLTP3-R为引物，通过PCR反应得到PCR产物。PCR体系如表4，程序如表5，PCR Master Mix(2X)购自Thermo FisherScientific(货号：K0171)。同时，pET-32a(+)载体通过EcoRI和XhoI限制性内切酶酶切。内切酶酶切体系参照Invitrogen。根据同源重组一步克隆试剂盒的方法将PCR产物与载体酶切产物混合在一起，混合物在37℃处理30分钟，之后立即转入冰上孵育5分钟。根据北京全式金生物技术有限公司的方法，得到的混合物将被转化至E.coli DH5α中，在合适的培养条件下，筛选阳性重组子，送北京擎科新业生物技术有限公司进行DNA序列测定。取序列完全正确的克隆，用

AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取重组质粒，通过EcoRI和XhoI进行双酶切验证(图2)。经琼脂糖电泳发现酶切片段为282bp，因此，本发明成功构建原核表达载体pET-32a(+)/Trx-His-CsLTP3。

表4 PCR体系

表5 PCR反应条件

实施例3重组CsLTP3蛋白表达、蛋白纯化、质谱鉴定

3.1rCsLTP3蛋白诱导表达

将测序正确的阳性质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞后，接种至5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养过夜。次日以1∶100比例分别转接于50mL上述培养液中，于37℃培养至对数生长期(A600＝0.4～0.6)，加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，20℃诱导16h后10000g离心5min，收集细菌；经PBS洗涤、离心、重悬于冰预冷的裂解缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄、300mmol/L NaCl、0.1g/L溶菌酶及1mmol/L PMSF，pH 8.0)、超声破菌，10000g离心10min，收集上清，进行SDS-PAGE分析(图3)。根据胶图的结果分析，发现rCsLTP3蛋白表达在上清中，且可溶性表达。

3.2rCsLTP3蛋白纯化

经诱导表达的1L菌液用6000r/min离心收获菌体，加入40mL裂解缓冲液充分重悬菌体，加入终浓度1mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)后在冰浴条件下进行超声裂解。裂解液在4℃12000r/min离心50min，收集上清并用0.22μm滤膜过滤备用。HIS标签镍离子蛋白纯化柱用5个柱体积的lysis缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,5％glycerol)平衡后，加入裂解液，4℃摇匀孵育4h，亲和介质能够特异性的吸附目的蛋白，再使用咪唑洗脱液(50mM Tris,100mM NaCl and 5％glycerol,100-200mM imidazole)将目的蛋白洗脱。收集洗脱液经SDS-PAGE检测分析。图3中第四个泳道是对应纯化的rCsLTP3蛋白。经检测计算1L菌能够产出25.1mg重组蛋白。将获取的蛋白用超滤管置换buffer，原来的Tris缓冲液置换成PH7.2的PBS磷酸缓冲盐溶液。

3.3rCsLTP3蛋白质谱鉴定

挖取图3中第四个泳道对应rCsLTP3蛋白的胶条，分子量为约27kDa，送往上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析。利用MALDI-TOF/TOF蛋白鉴定技术对rCsLTP3蛋白进行蛋白鉴定。如图4所示，经鉴定得到特异性肽段有6个。

实施例4抑菌蛋白CsLTP3热稳定性、酸碱稳定性检测

4.1rCsLTP3蛋白热稳定性检测

将rCsLTP3蛋白溶解在PBS磷酸缓冲盐溶液中，于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃下分别处理15min，经SDS-PAGE检测分析确定其热稳定性。如图5a所示，rCsLTP3蛋白热稳定性好，能耐受120℃高温处理不发生降解。

4.2rCsLTP3蛋白酸碱稳定性检测

将rCsLTP3蛋白溶解在PBS磷酸缓冲盐溶液中，用1mol/L HCl调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取rCsLTP3蛋白溶液用1mol/L NaOH调整pH为8、9、10三个处理，经SDS-PAGE检测分析确定其酸碱稳定性。如图5b所示，rCsLTP3蛋白酸碱稳定性好，能耐受PH 4-9的条件处理。

实施例5抗菌肽rCsLTP3对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌的抑制作用

5.1样品准备

本发明中使用了两个柑橘品种，分别是红夏橙和融安金柑。红夏橙采摘于华中农业大学的国家柑橘育种中心，融安金柑购自市场。指状青霉为华中农业大学园艺林学学院采后与生物技术实验室(本实验室)分离并保存。

5.2CsLTP3蛋白处理对柑橘果实接种指状青霉菌病斑直径的影响

首先本实验采用的CsLTP3蛋白为实施例3制备的产物。首先，配制添加CsLTP3蛋白和未添加CsLTP3蛋白的含指状青霉菌孢子的PBS溶液，其中未添加CsLTP3蛋白的为对照。然后，通过接种于红夏橙和融安金桔果实上(8-10个果实)，观察实验材料发病情况，检测添加CsLTP3蛋白的对指状青霉菌的抑制活性株。具体步骤如下：①挑取指状青霉菌的孢子于无菌PBS溶液中，制取浓度为10⁶CFU/ml的孢子悬浮液，用此悬浮液配制添加CsLTP3蛋白和未添加CsLTP3蛋白的菌液，其中添加的CsLTP3蛋白浓度为500μg/ml；②对果子进行处理，先用蒸馏水洗净果子表面，然后将果子在2％的次氯酸钠中浸泡2min，再用蒸馏水清洗两次，于室温下风干；③用消毒过的接种针(10针捆绑在一起)在柑橘果皮上扎孔，2.5mm直径、1.5mm深的小孔，一果两孔；④用移液枪在每个孔处接种菌液20μl，等菌液被完全吸收后，把果子转移到放有湿润面纸的保鲜盒中，置于25℃恒温培养箱中培养，培养过程中观察果子的发病情况。

测量第3天的病斑直径，以病斑扩展垂直两个方向的平均宽度(cm)计算病斑大小。柑橘贮藏的感病情况如图5所示，接种指状青霉菌3天后，CsLTP3处理的红夏橙和融安金柑果实病斑面积显著性小于对照组(图6)。以上数据表明，CsLTP3蛋白作为抑菌剂处理对柑橘绿霉病的病原菌状青霉菌具有显著抑制作用。

综上，本发明提供一种制备柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3的方法以及利用该方法制备的提取物作为植物源抑菌剂在柑橘采后病害绿霉病防治中的应用，填补了植物源抗菌肽在防治柑橘采后病害中的空白。本发明不仅检索了甜橙基因组中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，还为了提高外源基因的表达水平，优化了密码子，合成了适合大肠杆菌表达的核苷酸序列，尤其适用于芸香科植物，而且建立了CsLTP3蛋白的原核表达体系，能快速的、大量的获得rCsLTP3蛋白。同时本发明发现rCsLTP3蛋白具备较好的热稳定性和酸碱稳定性。而且在活体条件下，本发明提供的抗菌肽rCsLTP3对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌具备明显的抑制效果。本发明所提供的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的植物源抑菌剂，能减少化学杀菌剂造成的危害，对柑橘果实防腐保鲜和食品安全有重要意义。

本发明采用的pET-32a(+)载体本身带有一个HIS标签，是常用的一种亲和标签，不影响目的蛋白的功能及免疫原性。为了提高纯化效率，充分利用载体的HIS标签，在设计下游引物时对目的基因的终止密码子进行了缺失，选择了载体的T7终止子。利用大肠杆菌生产重组蛋白，具有周期短、易于纯化等优点。本发明构建了原核表达载体pET-32a(+)-CsLTP3，转化E.coli BL21(DE3)菌后成功诱导表达了分子量为27kDa的蛋白，该蛋白主要以可溶形式存在。在蛋白纯化过程中，采用HIS标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。HIS镍柱纯化系统是利用Ni柱中的氯化镍可以与有HIs(组蛋白)标签的蛋白结合，通过咪唑洗脱的原理来进行纯化。经SDS-PAGE鉴定，纯化的CsLTP3蛋白纯度高。

本发明中的芸香科果实，既包括柑橘属植物(如橘、柑、柚、橙、柠檬等)，也包括其他常见柑橘类植物(如枳、金橘等)。本发明中所提供的植物源抑菌剂CsLTP3适用于几乎所有柑橘品种防治柑橘采后绿霉病病害。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> Citrus

<400> 1

Met Ala Leu Lys Leu Ala Cys Ala Val Leu Leu Met Cys Met Val Met

1 5 10 15

Gly Ala Pro Ile Ala Gln Ala Ala Val Thr Cys Gly Gln Val Thr Ser

20 25 30

Ser Leu Gln Ala Cys Met Pro Tyr Val Thr Gly Pro Gly Gly Gly Ala

35 40 45

Val Pro Pro Ala Cys Cys Ser Gly Ile Lys Ser Leu Asn Ser Ala Ala

50 55 60

Thr Thr Thr Pro Asp Arg Gln Ser Val Cys Asn Cys Leu Lys Thr Ala

65 70 75 80

Ala Gly Ser Ile Arg Asn Leu Asn Leu Asn Leu Ala Ser Gly Leu Pro

85 90 95

Arg Gln Cys Gly Val Asn Ile Pro Tyr Gln Ile Ser Pro Ser Val Asp

100 105 110

Cys Ser Arg Val Arg

115

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> Citrus

<400> 2

gcgctgaaac tggcgtgcgc ggttctgctg atgtgcatgg ttatgggtgc gccgatcgcg 60

caggcggcgg ttacctgcgg tcaggttacc tcttctctgc aggcgtgcat gccgtacgtt 120

accggtccgg gtggtggtgc ggttccgccg gcgtgctgct ctggtatcaa atctctgaac 180

tctgcggcga ccaccacccc ggaccgtcag tctgtttgca actgcctgaa aaccgcggcg 240

ggttctatcc gtaacctgaa cctgaacctg gcgtctggtc tgccgcgtca gtgcggtgtt 300

aacatcccgt accagatctc tccgtctgtt gactgctctc gtgttcgtta a 351

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgatatcg gatccgaatt cgcggttacc tgcggtcagg t 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gttaacgaac acgagagcag t 41

Claims (4)

1.一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因在防治芸香科植物果实采后绿霉病中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法在防治芸香科植物果实采后绿霉病中的应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.01～1mmol/L IPTG，在12～37℃诱导4～24h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；

其中，所述重组菌为转入CsLTP3基因原核表达载体的大肠杆菌；所述CsLTP3基因原核表达载体具体是以如权利要求1所述密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因为模板，并经PCR反应构建得到的。

3.如权利要求2所述诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法在防治芸香科植物果实采后绿霉病中的应用，其特征在于，是将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，在20℃诱导16h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白。

4.如权利要求2所述诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法在防治芸香科植物果实采后绿霉病中的应用，其特征在于，生成的所述rCsLTP3重组蛋白还经过纯化处理，所述纯化处理具体是先收集诱导后的重组菌，然后对这些重组菌进行PBS洗涤、离心、重悬于冰预冷的裂解缓冲液、以及超声破菌处理，然后离心收集上清，接着用滤膜过滤该上清，得到的滤液经HIS镍柱纯化体系纯化洗脱处理后收集洗脱液即得到rCsLTP3重组蛋白。

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