CN113637054B - 一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，包括如下步骤：S1、细胞裂解，S2、离子交换层析，S3、羟基磷灰石层析，S4、亲和层析，本发明通过特定的、具有顺序的纯化步骤，首先阴进行离子交换层析，之后进行羟基磷灰石层析，最后进行亲和层析，并且上述纯化步骤之间具有协同作用，能较大程度地去除杂质，最后得到纯度极高的重组仙台病毒样颗粒；所述纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产；经过上述方法纯化得到的重组仙台病毒样颗粒可以直接感染细胞，产生相应抗原，诱导机体发生免疫反应；也可以添加相应的佐剂，制成疫苗。

Description

一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于病毒生物学技术领域，具体涉及一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用。

背景技术

仙台病毒(Sendai virus，SeV)，又称日本凝血病毒(Hemagglutinating Virus ofJapan，HVJ)，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒属(Respirovirus)，1953年首次于日本仙台发现，在分离出了第一株病毒Fushimi株之后，人们对仙台病毒进行了广泛的研究和报道。仙台病毒基因由15384个核苷酸构成，其3端为起始序列，之后串连排列6个结构基因-NP-P-M-F-HN-L-，5端为终止序列，对于每个基因RNA聚合酶从3端的起始序列(GS)开始转录，依次为非翻译区(UTR)，开放阅读框(ORF)，到5端的终止序列(GE)mRNA合成终止，相邻基因单位之间有3核苷酸的保守序列(Ⅰ)，外源基因可插入至1-7的任一位置，基因越靠近3端，表达越强，这种表达受位置影响的作用称之为“极性作用”，这是由于聚合酶在从3到5端的移动过程中脱落引起的，通过“极性作用”，可通过对表达基因的要求将其插入到不同位置构建病毒载体。

仙台病毒粒子多呈圆形，直径130～250nm，仙台病毒对乙醚敏感，在pH为3.0的条件下极易灭活，室温条件下可凝集多种动物红细胞，其中以鸡的红细胞凝集价最高。仙台病毒易在鸡胚羊膜腔和尿囊腔中生长繁殖，通常用此方法来扩增病毒，仙台病毒可使小鼠、大鼠、豚鼠等多种啮齿类动物自然感染甚至死亡，迄今为止的研究表明仙台病毒对人类无致病性。仙台病毒在体外试验中可以感染大多数的哺乳动物细胞，并且其转录和复制等生命周期完全在细胞质中进行，没有引起宿主细胞遗传突变的风险，因此，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、疫苗研发、癌症治疗等各个领域。

仙台病毒在活载体疫苗上的应用主要是基于其能够激发较强的细胞免疫，可用于传统方法无法实现的疫苗生产，目前已经有若干应用SeV载体构建针对不同病原体活载体疫苗的方案。日本DNAVEC公司已经联合国内几家单位开展应用SeV载体开发HIV疫苗的研究，近期的一项研究是采用DNA疫苗初免，腺病毒活载体疫苗加强免疫，仙台病毒活载体再次加强免疫(Yu S,Xia F,Shu T,et al.Potent specific immune responses induced byprime-boost-boost strategies based on DNA,adenovirus,and Sendai virus vectorsexpressing gag gene of Chinese HIV-1subtype B[J].Vaccine,2008,26(48):6124-6131.)。具体地，在Balb/c小鼠模型中，三种载体联合免疫的细胞免疫效果优于单独应用任何一种载体，且每次加强免疫均可明显上调免疫应答；在猕猴模型中，细胞免疫的持续时间与体液免疫相当，这一方案对于开发HIV预防性或治疗性疫苗有较好前景。

中国专利CN 105441482A文献公开了一种表达HIV抗原的重组载体疫苗，将F基因缺陷型仙台病毒载体、HIV gag基因连接后获得重组仙台病毒载体，重组仙台病毒载体与表达仙台病毒辅助蛋白的质粒共转染LLC-MK2/F细胞系，包装出具有“一次性感染”能力的病毒样颗粒，该病毒样颗粒可以感染细胞，产生相应抗原，诱导机体发生免疫反应。但是，如何纯化出高纯度的重组仙台病毒样颗粒，是一个技术难题。选用常规的离子交换层析很难将目的蛋白与杂蛋白分离开来，选用其他的纯化方式，也会存在效率很低的问题，而且，在目的基因表达的过程中，也会产生一些与重组仙台病毒样颗粒相近的蛋白质，按照现有的技术纯化，很难去除这些杂质。

因此，有必要开发一种纯化效率高、步骤简单的纯化重组仙台病毒样颗粒的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用。解决现有的选用常规的离子交换层析很难将目的蛋白与杂蛋白分离开来，选用其他的纯化方式，纯化效率很低，而且，在目的基因表达的过程中，也会产生一些与重组仙台病毒样颗粒相近的蛋白质，按照现有的技术纯化，很难去除这些杂质等问题。

本发明的一个目的在于提供一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法。

一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，包括如下步骤：

S1、细胞裂解：收集包含有重组仙台病毒样颗粒的细胞，加入细胞裂解液，经破碎后，得到细胞裂解液；

S2、离子交换层析：使用阴离子交换层析柱，对步骤S1中得到的细胞裂解液进行纯化，得到初级提取液；

S3、羟基磷灰石层析：使用羟基磷灰石层析柱，对步骤S2中得到的初级提取液进行纯化，得到中级提取液；

S4、亲和层析：使用亲和层析柱，对步骤S3中的得到的中级提取液进行纯化，得到重组仙台病毒样颗粒。

本发明中，首先对收集包含有重组仙台病毒样颗粒的细胞进行破碎，得到细胞裂解液；之后使用阴离子交换层析柱对上述细胞裂解液进行纯化，去除细胞碎片和大分子核酸等物质，同时对包含有重组仙台病毒样颗粒和分子量接近的杂蛋白进行浓缩，得到初级提取液；由于陶瓷羟基磷灰石具有良好的捕捉力和选择性，能够分离其他介质不能分离的各种比较难的，性质比较接近的生物分子，因此，采用陶瓷羟基磷灰石能大大减少纯化步骤，且所得产物纯度较高，但现有研究表明，陶瓷羟基磷灰石层析的方法不适用纯化浓度低、含量少的物质，因此，本发明首先使用阴离子交换层析柱对上述细胞裂解液进行纯化，对包含有重组仙台病毒样颗粒和分子量接近的杂蛋白进行浓缩，使得初级提取液中目标产物含量高，杂质少，初级提取液进行陶瓷羟基磷灰石层析后，分子量和重组仙台病毒样颗粒相近的杂蛋白被去除，得到中级提取液；最后使用亲和层析，进一步地去除杂蛋白和一些细胞裂解物，通过特定的纯化步骤(首先阴进行离子交换层析，之后进行羟基磷灰石层析，最后进行亲和层析)，得到纯度极高的重组仙台病毒样颗粒。

进一步地，步骤S1中，所述细胞裂解液的组分如下：50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、150mM NaCl、1％TritonX-100、0.5％SDS、0.5％脱氧胆酸盐、4％β-巯基乙醇和1mMEDTA。

进一步地，步骤S1中，细胞破碎采用高压均质的方法进行，具体条件如下：在800～900bar的条件下破碎细胞4～6次。

进一步地，步骤S2中，所述阴离子交换层析柱选自Capto-DEAE阴离子交换柱或Capto-Q阴离子交换柱中的一种。

更进一步地，步骤S2中，所述细胞裂解液进行纯化的具体方法如下：采用50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡4～8个柱体积后上样，之后加入pH为7.0～9.5的50mM Tris-HCl缓冲液(含有250～400mM NaCl)进行洗脱，得到初级提取液。

本发明中，由于重组仙台病毒样颗粒中的M蛋白富含碱性氨基酸，使得整个重组仙台病毒样颗粒带有负电荷，因此，初步纯化使用阴离子交换层析柱，并且，该阴离子交换柱中的Capto填料，具有季铵盐类的带电配体组分，能吸附碱性氨基酸，因此能更好的吸附重组仙台病毒样颗粒，使用该阴离子交换层析柱，纯化的效果较好。

进一步地，步骤S3中，所述羟基磷灰石层析柱为陶瓷羟基磷灰石层析柱(CHT TypeⅡ)。

更进一步地，所述初级提取液进行纯化的具体方法如下：采用20mM PBS缓冲液(pH7.5)平衡5～10个柱体积后上样，之后加入50～150mM PBS缓冲液(pH为8.0～9.5)进行洗脱，得到中级提取液。

本发明中，陶瓷羟基磷灰石具有良好的捕捉力和选择性，能够分离其他介质不能分离的各种比较难的，性质比较接近的生物分子，因此，采用陶瓷羟基磷灰石能大大减少纯化步骤，且所得产物纯度较高。

进一步地，步骤S4中，所述亲和层析柱为Benzamidine Focurose 6B亲和层析柱。

更进一步地，所述中级提取液进行纯化的具体方法如下：采用pH为7.4的50mMTris-HCl缓冲液(含有500mM NaCl)平衡5～10个柱体积后上样，之后加入洗脱液(50mMTris-HCl缓冲液、500mM NaCl、20mM对氨基苯甲脒，pH 7.4)进行洗脱，得到重组仙台病毒样颗粒。

本发明中，选用的亲和层析柱为Benzamidine Focurose 6B亲和层析柱，该亲和层析柱能去除一些残留的细胞裂解物和杂蛋白，进一步地提高目标产物的纯度。

本发明的另一个目的在于提供一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法的应用。

上述重组仙台病毒样颗粒的纯化方法在制备HIV疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过特定的、具有顺序的纯化步骤，首先阴进行离子交换层析，之后进行羟基磷灰石层析，最后进行亲和层析，并且上述纯化步骤之间具有协同作用，能较大程度地去除杂质，最后得到纯度极高的重组仙台病毒样颗粒；所述纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产；经过上述方法纯化得到的重组仙台病毒样颗粒可以直接感染细胞，产生相应抗原，诱导机体发生免疫反应；也可以添加相应的佐剂，制成疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明重组仙台病毒样颗粒的纯化工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所使用的试剂和设备，如无特殊说明，均可市售获得。

本发明中，采用中国专利CN 105441482A中的方法，得到含有重组仙台病毒样颗粒的细胞。

实施例1重组仙台病毒样颗粒的纯化方法

一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，包括如下步骤：

S1、细胞裂解：收集包含有重组仙台病毒样颗粒的细胞，加入细胞裂解液，所述细胞裂解液的组分如下：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、150mM NaCl、1％TritonX-100、0.5％SDS、0.5％脱氧胆酸盐、4％β-巯基乙醇和1mM EDTA，经破碎后，得到细胞裂解液，所述破碎采用高压均质的方法进行，具体条件如下：在800～900bar的条件下破碎细胞4～6次；

S2、离子交换层析：使用阴离子交换层析柱(Capto-DEAE阴离子交换柱或Capto-Q阴离子交换柱中的一种)，对步骤S1中得到的细胞裂解液进行纯化，所述细胞裂解液进行纯化的具体方法如下：采用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡4～8个柱体积后上样，之后加入pH为7.0～9.5的50mM Tris-HCl缓冲液(含有250～400mM NaCl)进行洗脱，得到初级提取液；

S3、羟基磷灰石层析：使用羟基磷灰石层析柱(陶瓷羟基磷灰石层析柱(CHT TypeⅡ))，对步骤S2中得到的初级提取液进行纯化，所述初级提取液进行纯化的具体方法如下：采用20mM PBS缓冲液(pH 7.5)平衡5～10个柱体积后上样，之后加入50～150mM PBS缓冲液(pH为8.0～9.5)进行洗脱，得到中级提取液；

S4、亲和层析：使用亲和层析柱(Benzamidine Focurose 6B亲和层析柱)，对步骤S3中的得到的中级提取液进行纯化，所述中级提取液进行纯化的具体方法如下：采用pH为7.4的50mM Tris-HCl缓冲液(含有500mM NaCl)平衡5～10个柱体积后上样，之后加入洗脱液(50mM Tris-HCl缓冲液、500mM NaCl、20mM对氨基苯甲脒，pH 7.4)进行洗脱，得到重组仙台病毒样颗粒。

对比例1

重组仙台病毒样颗粒的纯化方法基本同实施例1一致，不同之处在于，不包括离子交换层析这一步骤。

对比例2

重组仙台病毒样颗粒的纯化方法基本同实施例1一致，不同之处在于，不包括羟基磷灰石层析这一步骤。

对比例3

重组仙台病毒样颗粒的纯化方法基本同实施例1一致，不同之处在于，不包括亲和层析这一步骤。

对比例4

重组仙台病毒样颗粒的纯化方法基本同实施例1一致，不同之处在于，羟基磷灰石层析步骤和离子交换层析步骤调换，使得羟基磷灰石层析步骤位于离子交换层析步骤之前，其他步骤保持不变。

对比例5

重组仙台病毒样颗粒的纯化方法基本同实施例1一致，不同之处在于，亲和层析步骤和羟基磷灰石层析步骤调换，使得亲和层析步骤位于羟基磷灰石层析步骤之前，离子交换层析步骤之后，其他步骤保持不变。

实施例2重组仙台病毒样颗粒的性能测试

将实施例1和对比例1～5制得的重组仙台病毒样颗粒进行纯度和收率的测试，结果如下表1所示：

表1重组仙台病毒样颗粒的性能测试结果

	重组仙台病毒样颗粒的纯度(％)	重组仙台病毒样颗粒的收率(％)
			实施例1	95	87
对比例1	80	75
			对比例2	65	59
对比例3	84	79
			对比例4	85	80
对比例5	83	77

从表1的性能测试结果可以看出，实施例1中制得的重组仙台病毒样颗粒的纯度为95％，收率为87％，结果表明，通过特定的、具有顺序的纯化步骤，首先阴进行离子交换层析，之后进行羟基磷灰石层析，最后进行亲和层析，并且上述纯化步骤之间具有协同作用，能较大程度地去除杂质，最后得到纯度极高的重组仙台病毒样颗粒；

对比例1与实施例1的区别在于，不包括离子交换层析这一步骤。结果发现，制得的重组仙台病毒样颗粒的纯度和收率均有一定的下降，这一结果表明，使用阴离子交换层析柱，是由于该阴离子交换柱中的Capto填料，具有季铵盐类的带电配体组分，能吸附碱性氨基酸，因此能更好的吸附重组仙台病毒样颗粒，使用该阴离子交换层析柱，纯化的效果较好；

对比例2与实施例1的区别在于，不包括羟基磷灰石层析这一步骤。结果发现，制得的重组仙台病毒样颗粒的纯度和收率均有大幅度的下降，这是由于陶瓷羟基磷灰石具有良好的捕捉力和选择性，能够分离其他介质不能分离的各种比较难的，性质比较接近的生物分子，因此，采用陶瓷羟基磷灰石能大大减少纯化步骤，且所得产物纯度较高；当没有使用羟基磷灰石层析时，获得的产物中会含有一些性质相近的分子，使得产物的纯度和收率均偏低；

对比例3与实施例1的区别在于，不包括亲和层析这一步骤。结果发现，制得的重组仙台病毒样颗粒的纯度和收率均有一定的下降，这一结果表明，使用BenzamidineFocurose 6B亲和层析柱，该亲和层析柱能去除一些残留的细胞裂解物和杂蛋白，进一步地提高目标产物的纯度；

对比例4和实施例1的区别在于，羟基磷灰石层析步骤和离子交换层析步骤调换，使得羟基磷灰石层析步骤位于离子交换层析步骤之前，其他步骤保持不变。结果发现，制得的重组仙台病毒样颗粒的纯度和收率均有一定的下降，这是由于先进行羟基磷灰石层析时，由于细胞裂解液中目标产物浓度很低，同时含有大量的杂质，导致制得的目标产物的纯度和收率都很低；

对比例5与实施例1的区别在于，亲和层析步骤和羟基磷灰石层析步骤调换，使得亲和层析步骤位于羟基磷灰石层析步骤之前，离子交换层析步骤之后，其他步骤保持不变。结果发现，制得的重组仙台病毒样颗粒的纯度和收率均有一定的下降，这是由于亲和层析是特异性的吸附重组仙台病毒样颗粒，当先进行亲和层析后，由于一些和重组仙台病毒样颗粒分子量相近的分子没有被吸附，导致在最后进行羟基磷灰石层析时，样品中的待分离物质浓度很低，从而使得获得的目标产物纯度和收率均有一定程度的降低。

综上所述，本发明通过特定的、具有顺序的纯化步骤，首先阴进行离子交换层析，之后进行羟基磷灰石层析，最后进行亲和层析，并且上述纯化步骤之间具有协同作用，能较大程度地去除杂质，最后得到纯度极高的重组仙台病毒样颗粒；所述纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产。

以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、细胞裂解：收集包含有重组仙台病毒样颗粒的细胞，加入细胞裂解液，经破碎后，得到细胞裂解液；

S2、离子交换层析：使用阴离子交换层析柱，对步骤S1中得到的细胞裂解液进行纯化，得到初级提取液；所述阴离子交换层析柱选自Capto-DEAE阴离子交换柱或Capto-Q阴离子交换柱中的一种；

S3、羟基磷灰石层析：使用羟基磷灰石层析柱，对步骤S2中得到的初级提取液进行纯化，得到中级提取液；所述羟基磷灰石层析柱为陶瓷羟基磷灰石层析柱CHT Type Ⅱ；

S4、亲和层析：使用亲和层析柱，对步骤S3中的得到的中级提取液进行纯化，得到重组仙台病毒样颗粒；所述亲和层析柱为Benzamidine Focurose 6B亲和层析柱。

2.如权利要求1所述的重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞裂解液的组分如下：50mM pH为7.4的Tris-HCl缓冲液、150mM NaCl、1% TritonX-100、0.5% SDS、0.5%脱氧胆酸盐、4% β-巯基乙醇和1mM EDTA。

3.如权利要求1所述的重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞破碎采用高压均质的方法进行，具体条件如下：在800～900bar的条件下破碎细胞4～6次。

4.如权利要求1所述的重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述纯化过程具体方法如下：采用50mM pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡4～8个柱体积后上样，之后加入含有250～400mM NaCl、pH为7.0～9.5的50mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，得到初级提取液。

5.如权利要求1所述的重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述纯化的具体方法如下：采用20mM pH 为7.5的 PBS缓冲液平衡5～10个柱体积后上样，之后加入50～150mM pH为8.0～9.5的 PBS缓冲液进行洗脱，得到中级提取液。

6.如权利要求1所述的重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，所述中级提取液进行纯化的具体方法如下：采用含有500mM NaCl、pH为7.4的50mM Tris-HCl缓冲液平衡5～10个柱体积后上样，之后加入组成为50mM Tris-HCl缓冲液、500mM NaCl、20mM对氨基苯甲脒，pH 为7.4的洗脱液进行洗脱，得到重组仙台病毒样颗粒。

7.权利要求1～6任一项所述的重组仙台病毒样颗粒的纯化方法在制备HIV疫苗中的应用。