WO2006011580A1 - ウイルスエンベロープの精製方法 - Google Patents

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Shinichi Ioka
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Genomidea, Inc.
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    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to an industrial purification method of an envelope (for example, Hemagglutinating Virus of Japan, hereinafter referred to as HVJ).
  • HVJ Hemagglutinating Virus of Japan
  • the purified virus envelope can be used as a vector for introducing a biopolymer such as a gene into a cell or a living body.
  • HVJ is a virus belonging to the Paramyxoviridae family that has an envelope and hemaggluton and neuraminidase on its surface. HVJ is attracting attention as a fusion of Erich tumor cells (Okada, Ikeno Journal, 1, 10 3— 1 1 0, 1 9 5 8), and analysis of cell membrane fusion activity (hereinafter referred to as fusion activity) The use as a gene transfer vector has been studied. HVJ is highly immunogenic, and is known to induce CTL when NP protein is produced in large quantities (Cole GA Journal of Immunology 158, 4301-4309 (1997), and there is also a concern that the protein synthesis of the host may be inhibited.
  • HVJ-ribosomes fusion particles
  • Kaneda has developed a highly safe HVJ vector that introduces genes into cells with high efficiency (W001 / 57204). That is, it inactivates the genome of HVJ and other envelopeloinoses, encapsulates a biopolymer such as a gene in its envelope, and uses it as a vector into cells or in vivo. However, at this stage, an efficient purification method for the HVJ envelope has not been established.
  • Kaneda has also developed a method of producing HVJ from eggs and purifying it by the steps of filtration, membrane concentration, ultrafiltration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration (TO03 / 014338).
  • this method two treatments, filtration and membrane concentration, were put in front of the column, and this physical stimulation reduced the activity of HVJ, and it was inevitable that the recovery rate would be reduced due to trapping at this stage.
  • W096 / 27677 an adenovirus purification method using an ion exchange resin and an immobilized metal affinity resin has been developed as a virus purification method.
  • this method could not be used as a method for purifying enveloped virus.
  • a method for purifying adenovirus a method using an ion exchange resin and a hydrophobic resin in combination has also been proposed, but no specific examples have been disclosed.
  • W091 / 00104 discloses a method for purifying the HN and F proteins of enveloped virus by affinity mouthmatography, but this is a virus envelope that is an aggregate of many proteins. It cannot be applied to the purification method.
  • An object of the present invention is to develop a method for purifying a virus envelope with a higher recovery rate and retaining the virus fusion activity.
  • Envelope viruses including HVJ
  • HVJ are complex proteins consisting of several proteins, lipids, and sugar chains, and are generally large particles with a diameter of 100 nanometers.
  • various interactions between HVJ and the support surface could not be fully utilized.
  • the culture supernatant contains various impurities other than HVJ. However, most of them are molecules or particles smaller than HVJ. Most of today's chromatographic carriers have selectivity on the small molecule side. Therefore, they could not properly separate HVJ from the culture supernatant. Therefore, it was necessary to study a purification method suitable for HVJ. The present inventor has intensively studied to solve these problems. As a result, a purification method comprising a hydrophobic chromatography, preferably a combination of hydrophobic chromatography, anion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography, has been established.
  • the present invention provides, as a means for solving the problems, a method for efficiently purifying at a high recovery rate while maintaining the cell fusion activity of the virus envelope.
  • the gist is
  • the surfactant is Tween 80 or Triton . X (Triton X), the method according to (1) to (3 4),
  • the divalent metal ion is calcium or magnesium
  • the divalent metal ion concentration is 0.1 to 10 mM, (4 4) or (4
  • the divalent metal ion concentration is; ⁇ 2mM, (4 4) ⁇ (4 6) described method,
  • Winoles is Buirouinores, Punyawinoles, Henorepesu Inoresu Department, box Huy / Les Department, togaviruses family, corona virus family, the Flaviviridae family, paramyxovirus family, Arenawirusu family, ortho Mikusoui / Les Department, c 0 Donauinoresu Department of Les DOO Roui / Les Department, to, Les old Huy
  • the method according to (1) to (47) which is a virus belonging to a family selected from the group of Rusaceae and Deltaviridae,
  • the virus is Ebola virus, Crimea Congo hemorrhagic fever wi-nores, Nounta wi-nores, Herpes simplex enoures, EB quinoles, Natural pox virus, Cowpox virus, Rubella virus, SARS virus (Hitocorona virus), C Hepatitis B virus, Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, dengue virus, West Nile virus, Russian spring and summer encephalitis virus, swine fever virus, rabies virus, vesicular stomatitis virus, Sendai virus (HVJ), measles virus, Mumps virus, mumps virus, rubella virus, RS virus, Lassa fever virus, influenza virus, human immunodeficiency virus (HIV), human T cell leukemia type I virus (HTLV-1), feline immunodeficiency virus ( FIV), hepatitis B virus (HBV), Virus is a virus selected from the group of hepatitis D virus (1) to (4 8 ') The method according to
  • the virus envelope purified by the present invention can be widely used as a vector for introducing a low-molecular or high-molecular compound into cells or living organisms.
  • a chemotherapeutic agent can be encapsulated and used as an anticancer agent.
  • any nucleic acid can be encapsulated and used for screening the target gene or protein.
  • FIG. 1 is a diagram showing an anion exchange chromatogram of column 1 (Example 1).
  • FIG. 2 shows a hydrophobic chromatogram of column 2 (Example 1).
  • FIG. 3 is a diagram showing a gel filtration matrix of column 3 (Example 1).
  • FIG. 4 is a diagram showing an electrophoretic image of a purified HVJ envelope SDS polyacrylamide (Example 3).
  • Lane 1 Molecular weight marker
  • Lane 2 Cell-derived HVJ (reduced)
  • Lane 3 Chicken egg-derived HVJ (reduced)
  • Lane 4 Cell-derived HVJ (non-reduced)
  • Lane 5 Chicken egg-derived HVJ (non-reduced).
  • gene transfer means in vivo or in vitro the desired gene or gene fragment, natural, synthetic or recombinant, and its function in the target cell. Say to introduce to maintain.
  • the gene or gene fragment introduced in the present invention includes a nucleic acid that is DNA, RNA, or a synthetic analog thereof having a specific sequence.
  • gene transfer, transformation, and transformate are used interchangeably.
  • gene vector refers to a vector in which a foreign gene is encapsulated in a winores envelope.
  • the virus used for the preparation of the gene transfer vector may be a wild type virus or a recombinant virus.
  • the viruses used are: Firoviridae, Bunyawinoles, Henorepesuinores, Boxwirs, Togaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Noramixuinolesidae, A virus belonging to a family selected from the group consisting of the genus Arenawinoles, the genus Noreto Myxoinoles, the Letrouinoleceae, the Hepadnaviridae, the Reoviridae, and the Deltaviridae.
  • these viruses are Ebola virus, Crime-Congo hemorrhagic fever wi-nores, non-tuino hinoles, simple herpes peinos, EB virus, smallpox virus, cowpox virus, rubella virus, SARS virus (Hitocoronavirus) ), Hepatitis C virus, Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, dengue virus, West Nile virus, Russian spring / summer encephalitis virus, swine fever virus, rabies virus, vesicular stomatitis virus, Sendai virus (HVJ), measles virus Mumps virus, mumps wingless, rubella virus, rs wingless, lassa funo wingless, influenza virus, human immunodeficiency virus (HIV), human T cell leukemia type I virus (HTLV-1), feline immunity Incomplete virus (FIV), B Hepatitis Virus (HBV), a reovirus, a virus that is selected from the group consisting of
  • the virus is HVJ.
  • inactivated virus refers to a virus that has inactivated its genome. This inactivated virus is replication defective. Preferably, this inactivation is done by UV treatment or treatment with an alkylating agent.
  • an “attenuated virus” refers to a virus that infects a host with little or no pathogenicity.
  • foreign gene refers to a nucleic acid sequence derived from other than a virus contained in a gene transfer vector.
  • this foreign gene can be a regulatory gene suitable for the expression of the gene introduced by the gene transfer vector (eg, a promoter, enhancer, terminator, and poly A addition signal required for transcription, and translation).
  • the ribosome binding site, the start codon, the stop codon, etc. In another aspect of the present invention, the foreign gene does not contain a regulatory sequence for expression of the foreign gene.
  • the foreign gene is an oligonucleotide or a deconucleic acid.
  • the foreign gene contained in the gene transfer vector is typically a DNA or RNA nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule to be introduced may contain a nucleic acid analog molecule.
  • the molecular species contained in the gene transfer vector may be a single gene molecular species or a plurality of different gene molecular species.
  • HVJ HVJ
  • Sendai virus Sendai virus
  • HAU refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes, and 1 HAU corresponds to approximately 24 million virus particles (Okada, Y et al., Biken Journal 4, 209-213, 1961).
  • the purification method of the present invention is a force that can be achieved only by hydrophobic chromatography, preferably hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography, specifically the following combinations: Includes one of the combinations.
  • a three-step column chromatography is used.
  • the third step is intended for desalination and concentration, so it is performed as necessary.
  • PH of the buffer used for the chromatography one can use the usual P H7 ⁇ 9.
  • pH 7.8 to 8 ⁇ 5 is used.
  • Column 1 can usually be an anion exchange chromatography. Theoretically, almost all of the anion exchanger (DEAP, Q, QAE, DEAE, etc.) Allowed for force 3 ⁇ 4 flights affirmative Demel (DEAP; di ethyl aminopropyK Q; quaternary amine ⁇ QAE; quaternary aminoethyl DEAE; di ethylaminoethyl).
  • DEAP anion exchanger
  • Q quaternary amine ⁇ QAE
  • quaternary aminoethyl DEAE di ethylaminoethyl
  • Tana for example, ANX- Sepharose 4FF (GE Amersham Biosciences, Cat. No. 17-1286-01) with DEAP can be cited.
  • This exchanger is a carrier specialized for capturing macromolecules by the relatively large pore size and the distance between the carrier and the functional group by the propyl group of the DEAP group becoming a spacer.
  • ANX- Sepharose4FF Low Sub also increases selectivity from small molecules to large molecules by reducing the functional group density. This is because chromatographic interactions usually involve multiple functional groups attached to a protein molecule. Common chromatographic supports bind a large excess of functional groups, resulting in a very dense environment. Since the carrier has a structure in which the strings are entangled, it becomes an advantageous environment for a low molecule that can be bound by more points in the space. In other words, ANX- Sepharose 4FF improved the three-dimensional space of functional groups for polymers.
  • a buffer having a pH of 6 to 9 can be used, and examples thereof include Tris-HCl buffer, phosphate buffer, and HEPES buffer.
  • Column 2 can then usually be used with hydrophobic chromatography.
  • a carrier used for hydrophobic chromatography among the commercially available hydrophobic carriers, those having weak hydrophobicity are preferable.
  • Ether And a hydrophobic carrier having an Alkyl group, and a carrier having an Ether group is particularly preferred.
  • Ether-TOYOPEARL650M (Cat. No. 16173) manufactured by Tosoh has an oligoethylene glycol group as its functional group. Oligoethylenedaricol group is considered to have weak hydrophobicity because it has 0H side chain in the carbon chain.
  • Toyopearl is bound by a method that does not involve a spacer, so it appears to be even less hydrophobic than the products of other companies. This can also be predicted from data when comparing Phenyl- Sepharose (with a spacer) and Phenyl-TOYOPEARL.
  • a buffer of pH 6-9 can be used as a buffer for hydrophobic chromatography.
  • Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, B is-Tris / HC 1
  • B is — Trispropane / HC 1
  • Triethanolamine Z Acetic Acid
  • N-Methyljetanolamine Z Acetic Acid
  • HVJ bound to oligoethylene glycol groups elutes by reducing the ammonium sulfate concentration in the buffer, but that alone does not sharpen the peaks and requires a considerable amount of liquid to completely elute. . Therefore, it is effective to add a hydrophilic organic solvent to increase the polarity of the solution.
  • the hydrophilic organic solvent is It can be added in the range of 0.01 to 50%. This concentration is not limited, but is usually 2% to 10%, preferably 3 to 7%, and most preferably 5%.
  • a polyhydric alcohol or a lower alcohol is preferably used as the hydrophilic organic solvent.
  • the lower alcohol in the present invention is not limited as long as it is an alcohol in which one hydroxyl group is added to a lower hydrocarbon having 1 to 6 carbon atoms.
  • a lower hydrocarbon having 1 to 6 carbon atoms Specifically, for example, methanol, ethanol, n-propanol, i-prono Nonorre, n-ptanol monole, i-ptanol monole, t-peptanol etc.
  • the polyhydric alcohol is not limited as long as it is an alcohol in which two or more hydroxyl groups are added to a hydrocarbon having 2 to 6 carbon atoms.
  • ethylene glycol, propylene dalycol, trimethylene glycol examples thereof include glycerin. More preferably, a polyhydric alcohol is used.
  • ethylene glycol is used.
  • Ethylene glycol can be added in the range of 0.01 to 50%. This concentration is not limited, but is usually 2% to 10%, preferably 3 to 7%, and most preferably 5%.
  • HVJ may bind to each other because it is purified at a high ammonium sulfate concentration.
  • a surfactant can be added in the range of 0.001 to 1%, preferably in the range of 0.01 to 0.1%.
  • Tween or Triton X can be used as the surfactant. More preferably, Tween 80 is used. Tween 80 can be added in the range of 0.001 to 1 ° / 0 . Tween 80 is preferably added in an amount of 0.01 to 0.1%. Most preferably, 0.05% is added.
  • gel filtration chromatography can be usually used for column 3. This step is used for concentration and desalination, so it is widely used Gel filtration chromatography can be used.
  • Sepharose 4 FF Cat. No. 17-0149-01
  • Sepharose 6 FF Cat. No. 17-0159-01
  • pH 6-9 buffer As a buffer for gel filtration, pH 6-9 buffer can be used.
  • Examples include diaminopropane / HC 1, piperazine / HC 1, trimethylamine ZHC 1, ethanolamine / HC 1, n-methylmorpholine / HC 1, and the like.
  • a hydrophilic organic solvent may be added to the buffer, and examples of the hydrophilic organic solvent that can be added include those described above.
  • the divalent metal ion is preferably calcium or magnesium. Usually, these metal ions are added in the range of 0.1 to 1 OmM. Preferably, it is added to a concentration of 1 to 2 mM.
  • Example 1 Purification of HV.T by column chromatography
  • the HVJ produced by the suspension cell culture system was purified from the cell culture supernatant obtained by removing the cell by centrifugation and purified by a three-stage chromatography process.
  • each column was used after passing through a 0.25 M sodium hydroxide solution and holding for 8 hours or more before use.
  • the centrifuged culture supernatant was diluted 1: 5 with 5 OmM Tris-HCl buffer pH 7.8. This was passed through column 1 equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 50 mM sodium chloride and adsorbed.
  • Column 1 contains an anion exchange chromatography carrier, AN X—Sepharose 4 FFLow Sub (GE Amersham Biosciences, Cat. No. 1 7-1 2 8 6-0 1) BPG 2 00/5 00 empty column (GE Amersham Biosciences) 3 L packed 20 cm in diameter and 9 centimeters high was used. The linear flow rate was 96 cm / h.
  • the equilibration buffer of 3 volumes of the column volume was passed through, and then washed by passing 50 mM of Tris-HCl buffer containing 1.4 M ammonium sulfate of 5 volumes of the column volume.
  • 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 0.8 M ammonium sulfate, 5% ethylene glycol, and 0.05% Tween 80 was passed. .
  • the absorbance at UV 2800 nm of the force ram passing solution increased, and that portion was recovered. This was used as the column 2 elution fraction.
  • 5% ethylene glycol solution was passed through to regenerate column 2. (See Figure 2)
  • the fraction eluted from column 2 was passed through column 3 equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer solution pH 7.8 containing 150 mM sodium chloride.
  • Column 3 contains Sepharose 4 FF (manufactured by GE Amersham Biosciences, Cat. No. 1 7-0 1 4 9— 0 1), a carrier for gel filtration chromatography, XK 5 0Z6 0 empty column ( GE Amersham Biosciences) with a diameter of 5 cm and a height of 40 cm was used. The linear flow rate was 120 cmzh.
  • the equilibration buffer was passed through the column elution fraction. At this time, the absorbance at UV 2880 nm of the force ram passing solution increased, and the portion was recovered. This was the column 3 elution fraction. (See Figure 3)
  • HVJ solution containing 0.1% methylcellulose in a final concentration of 0.1% was prepared by adding 0.5% methylcellulose in an amount equivalent to 1 volume of 4% to the column 3 elution fraction. This was filtered through a 0.45 micron sterile filtration filter. By rapidly freezing this in liquid nitrogen and storing it at 180 ° C, high-purity HVJ could be stably stored for a long time.
  • Tris (Hydroxymethyl) Minomethane, sodium chloride, calcium chloride dihydrate, magnesium chloride hexahydrate, sodium hydroxide, ethylene glycol, ammonium sulfate, and Tween 80 are manufactured by Wako Pure Chemicals or Sigma Special grades made by the company were used.
  • Hydrochloric acid was a 6 standard product manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the 0.5% methylcellulose added as a stabilizer for purified products was manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • a hydrophilic filter filter Millipak Gamma a Gold (Nippon Millipore) with a pore size of 0.45 microns was used. Comparative Example 1. Purification of HV. Ding by membrane concentration and column chromatography Cell culture supernatant obtained by cell removal treatment by centrifugation of HVJ produced by floating cell culture system was concentrated to the outer membrane. And three-stage kumatography.
  • the membrane concentrator and each column were used after passing through a 0.25 M sodium hydroxide solution and holding for 8 hours or more before use in order to inactivate endotoxin (typically Holding for about a week can completely remove viable bacteria and endotoxin).
  • the centrifuged culture supernatant was filtered through a 1.2-m milliguard filter to remove particles. This was concentrated to 600 mL using a pelicon membrane concentrator.
  • the concentrated culture supernatant obtained in (1) was passed through column 1 equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 150 mM sodium chloride.
  • Column 1 contains Sephar ⁇ se 6 FF (GE Amersham Biosciences), a carrier for gel filtration chromatography, and BPG 1 0 0/5 0 0 empty column (GE Amersham Biosciences) diameter 10 SE Inch, 2.5 L filled with a height of 33 cm was used. The linear flow rate was 1550 cmZh. The equilibrated puffer was then passed through. At this time, the absorbance at UV 2880 nm of the column passing solution increased, and a portion thereof was recovered. This was used as the column 1 elution fraction.
  • column 1 elution fraction 1 was passed through column 2 equilibrated with 5 O mM Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 50 mM sodium chloride and adsorbed.
  • Column 2 is Q—Sepharose FF (GE Amersham Biosciences), which is a carrier for ion exchange chromatography, and BPG 200/500 aerodynamic ram (GE Amersham Biosciences), 20 cm in diameter, high A 2 L container filled to 6.5 cm was used. The linear flow rate was 70 cm / h.
  • one column of equilibration buffer of 5 times the column volume was passed.
  • 50 mM Tris-HCl buffer solution pH 7.8 containing 0.45 M sodium chloride was passed.
  • the absorbance at UV 28 80 nm of the force ram passing liquid increased, and the portion was recovered. This was used as the column 2 elution fraction.
  • 2M sodium chloride was passed through to regenerate column 2.
  • the fraction eluted from column 2 was passed through column 3 equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 containing 150 mM sodium chloride.
  • Column 3 contains Sepharose 6 FF (manufactured by GE Amersham Biosciences), a gel filtration chromatographic carrier, and BPG 1 00Z 5 00 aerodynamic ram (manufactured by GE Amersham Biosciences), diameter 10 cm, height 3
  • a 2.5 L container filled with 3 cm was used.
  • the linear flow rate was 1550 cm Zh.
  • the equilibration buffer was passed through the column elution fraction. At this time, the absorbance at UV 2800 nm of the column passing solution increased, and the portion was recovered. This was the column 3 elution fraction.
  • a 1/4 volume equivalent of 0.5% methylcellulose was added to the column 3 eluate to prepare a HVJ solution containing a final concentration of 0.1% methylcellulose. This was filtered through a 0.45 micron
  • HVJ The activity of HVJ was measured by sialic acid degrading enzyme (neuraminidase, NA) activity and agglutination activity of chicken erythrocytes (hemadalchunic activity, HA). Both are proportional to the concentration and amount of recovered virus, and are also quantitative.
  • Table 1 shows the residual activity of HVJ in Example 1 of the present invention by these two methods and the recovery rate by NA activity value.
  • Table 2 shows the recovery rate when the comparative example was used. Comparison of Tables 1 and 2 clearly shows the excellent effect of the present invention.
  • HVJ electrophoresis was performed on SDS-PAGE gel with 4 1 1 2 Q / o.
  • HVJ was solubilized using a membrane protein solubilizer suitable for viruses (Sigma CelLyt ic— M Cat. No. C2978) and electrophoresed as it was.
  • a reduction sample was obtained by adding mercaptoethanol and heating at 95 ° C for 10 minutes.
  • HVJ was purified by anion exchange chromatography after culturing in fertilized chicken eggs and treated in the same way. This was electrophoresed at a constant voltage of 100 V for 2.5 hours, stained with SYPROR uby fluorescent staining solution (SYPRO Ruby Protein Gel Stain Cat. No.
  • the purified viral envelope can be used as a vector for introducing a biopolymer such as a gene into a cell or a living body.
  • an inactive virus envelope for example, HVJ
  • HVJ inactive virus envelope
  • the method of the present invention can also be applied to the purification of non-inactivated envelope virus.

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Abstract

ウイルス（例えばセンダイウイルス（Hemagglutinating Virus of Japan, ＨＶＪ））エンベロープの工業的精製方法を提供する。具体的には、不活性化されたウイルスエンベロープをイオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを併用して精製することにより、ウイルスの細胞融合活性を保ちつつ、かつ高回収率で精製する方法を提供する。精製されたウイルスエンベロープは遺伝子などの生体高分子を細胞や生体内に導入するベクターとして使用され得る。またこの方法は弱毒型のエンベロープウイルスの精製にも用いることができる。

Description

明細書
ウィルスエンベロープの精製方法
技術分野
本発明は、 ウイノレス （例えばセンダイウイノレス （Hemagglutinating Virus of Japan, 以下 H V J ))エンベロープの工業的精製方法に関する。 精製されたウィルスエンベロープは、 遺伝子などの生体高分子を細胞や 生体内に導入するベクターとして使用され得る。 背景技術
遺伝子機能解析や遺伝子治療のために、 培養細胞や生体組織に遺伝子 を導入する目的で、 多くのウィルス法、 非ウィルス法が開発されてきた (Mulligan, Science, 260, 926〜932， 1993年および Ledley, Human Gene Therapy, 第 6卷、 1129〜1144、 1995年）。 一般に細胞へ遺伝子を導入す るためには、 ウィルス法が効果的である。 しかし、 ウィルスベクターを 用いる方法は、 親ウィルス由来の遺伝子導入とその発現の可能性、 免疫 原性、 および宿主ゲノム構造の改変の可能性があり、 安全性の面で問題 がある。 一方、 リボソーム等を用いる非ウィルス法の多くは、 細胞障害 性および免疫原性はウィルス法より低いが、 培養細胞や生体組織内への 遺伝子導入効率においてはウィルスベクターに比べて劣る傾向にある。
HVJ は、 エンベロープを有し、 その表面にはへマグルチュンおよびノ イラミニダーゼを有する、 パラミクソウィルス科に属するウィルスであ る。 HVJ はエーリ ッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され （岡田、 微 研ジャーナル、 1、 1 0 3— 1 1 0 , 1 9 5 8年）、 細胞膜融合活性 （以 下融合活性とする） の解析が進められるとともに遺伝子導入ベクターと しての利用が検討されてきた。 HVJは免疫原性が高く、 特に NPタンパク 質が大量に生産されると CTLを誘導することが知られており （Cole G. A. ら Journa l of Immuno logy 158, 4301〜4309， 1997 年）、 さらに宿主の タンパク質合成が阻害される懸念もある。 そこで遺伝子やタンパク質を 封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいた HVJ と を融合することで、 融合粒子 （HVJ—リボソーム） を作製する方法が考案 され、これにより細胞や生体への非侵襲の遺伝子導入が可能となった（米 国特許第 5， 631， 237号、 Dzauら、 Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA, 93, 1 1421 〜11425， 1996 年および金田ら、 Mo l ecul ar Medi c ine Today, 5， 298〜 303， 1999年）。 しかし、 この方法はゥイノレスとリボソームという二つの 異なるべシクルを調製しなければならないという煩雑性があり、 また HVJ—リポソームは HVJ粒子より平均直径が 1 . 3倍大きくなり、 HVJ単 独より融合活性が十分の一以下に低下することが明らかとなった。
金田は細胞に高効率で遺伝子を導入し、 かつ高い安全性を持つ HVJベ クタ一を開発した （W001/57204号公報）。 即ち、 HVJをはじめとするェン ベロープウイノレスのゲノムを不活性化し、 そのエンベロープ中に遺伝子 等の生体高分子を封入し、 それを細胞や生体内へのベクターとして用い るものである。 しかしこの段階では HVJエンベロープの効率のよい精製 方法は確立されていなかった。
さらに金田は鶏卵で HVJを産生し、 それをろ過、 膜濃縮、 限外濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 限外濾過というステップで精製する方 法を開発した （TO03/014338号公報）。 しかしながらこの方法はカラムの 前にろ過と膜濃縮という二つの処理が入り、 この物理的な刺激によって HVJ の活性が落ち、 またこの段階で捕捉されることによる回収率の低下 が避けられなかった。
W096/27677号公報では、 ウィルスの精製方法としてはイオン交換樹脂 と固定化金属親和性樹脂を利用したアデノウィルスの精製法が開発され ている。 しかしアデノウイルスはエンベロープを持たないため、 この方 法はエンベロープウィルスの精製方法として使用できなかった。 さらに アデノウィルスの精製法において、 イオン交換樹脂と疎水性樹脂を併用 する方法も提案しているが具体的な実施例は開示されていなかった。 また、 W091/00104号公報はエンベロープウィルスの HNタンパク質、 F タンパク質をァフィ二テイク口マトグラフィ一で精製する方法を開示し ているが、 これは多くのタンパク質の集合体であるウィルスェンベロー プを精製する方法には適用できない。
したがって、 上記のような問題を解決し、 ウィルスエンベロープを効 率よく製造するために、 HVJ の活性を保ちながらさらに高回収率を有す る精製法の開発が望まれていた。 発明の開示
本発明の課題は、 より高い回収率で、 かつウィルスの融合活性を保持 したままウィルスエンベロープを精製する方法を開発することである。
HVJ を含むエンベロープ型ウィルスは、 数種のタンパク質、 脂質、 糖 鎖からなる複合タンパク質で、 一般的に直径数 1 0 0ナノメートルの大 きな粒子であり、 それゆえ表面電荷が複雑で、 非常に高い疎水性を有す ると予想された。 したがって、 比較的小さな分子を分離するために設計 された、 細孔径 （担体表面にある多孔の一つあたりの口径） がより小さ く、 単体あたりの表面積を小さく した、 高分離能を謳っている最近のク 口マトグラフィー担体では、 HVJ と担体表面の種々の相互作用を十分に 生かすことができなかった。 つまり、 HVJ のような大きく、 疎水性の高 い分子を分離するには、 HVJ が担体内部を分配可能なルーズな細孔径ま たは十分な表面積と、 HVJ が結合できる十分な官能基間の距離、 十分な 結合定数と適切な解離定数を有する相互作用が必要であった。
培養上清は、 HVJ 以外の様々な不純物を含んでいる。 しかしそのほと んどは HVJより小さい分子あるいは粒子である。 今日のクロマトグラフ ィー用担体では、 そのほとんどが、 小サイズの分子側に選択性を持たせ てあるため、 それらでは培養上清からの HVJの適切な分離ができなかつ た。 従って、 HVJ に適した精製法を検討する必要があった。 本発明者は これらの問題を解決するため鋭意検討を重ねた。 その結果、 疎水性クロ マトグラフィ一から成る精製法、 好ましくは疎水性ク口マトグラフィー と陰ィオン交換ク口マトグラフィーおよび/またはゲルろ過クロマトグ ラフィーを組み合わせた精製法を確立するに至った。
即ち、 本発明は課題の解決手段として、 ウィルスエンベロープの細胞 融合活性を有したまま、 かつ高回収率で、 効率よく精製する方法を提供 するものである。
その要旨は、
( 1 ) ウィルスエンベロープの精製において、 疎水性クロマトグラフィ 一を用いることを特徴とする方法、
( 2)前記疎水性ク口マトグラフィ一の官能基が弱疎水性基である、（ 1 ) 記載の方法、
( 3) 前記疎水性クロマ トグラフィーの官能基がオリゴエチレングリコ ール基またはフエニル基である、 （ 1 ) または （2) 記載の方法、
(4) 前記疎水性クロマ トグラフィ一の官能基がオリゴエチレングリコ ール基である、 （ 1 ) 〜 （ 3) 記載の方法、
( 5 ) 前記疎水性ク口マトグラフィ一とイオン交換樹脂ク口マトグラフ ィ一および Zまたはゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせることを 特徴とする、 （ 1 ) 〜 （4 ) 記載の方法、
( 6 ) イオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを組 み合わせることを特徴とする、 （5) 記載の方法、
( 7) 第一のクロマトグラフィーにイオン交換樹脂、 第二のクロマトグ ラフィ一に疎水性樹脂を用いる、 （5) または （6 ) 記載の方法、
( 8 ) イオン交換クロマトグラフィ一が陰イオン交換ク口マトグラフィ 一である、 （ 5 ) 〜 （ 7 ) 記載の方法、 ( 9) イオン交換クロマ トグラフィ一が弱陰イオン交換ク口マ トグラフ ィーである、 （ 5) 〜 （ 8 ) 記載の方法、
( 1 0) イオン交換クロマ トグラフィ一の官能基がジェチルアミノプロ ピル （DEAP) 基である、 （ 5 ) 〜 （ 9 ) 記載の方法、
( 1 1 ) ィオン交換ク口マ トグラフィ一の官能基が低密度置換型（Low Sub)である、 （ 5) 〜 （ 1 0) 記載の方法、
( 1 2) クロマトグラフィ一のパッファ一が pH7〜9である、 （ 1 ) 〜 （ 1 1 ) 記載の方法、
( 1 3) クロマトグラフィーのバッファーが pH 7.8〜8.5である （ 1 ) 〜 （： L 2 ) 記載の方法、
( 1 4) イオン交換ク口マ トグラフィ一に用いるバッファーが塩化ナ ト リ ゥムまたは塩化力リ ゥムを含む、 （ 5 ) 〜 （ 1 3) 記載の方法、
( 1 5) イオン交換クロマ トグラフィ一の試料吸着時のバッファーが塩 化ナトリ ウム ひ.01〜； L50mMを含む、 （ 5 ) 〜 （ 1 4) 記載の方法、
( 1 6 ) イオン交換クロマ トグラフィーの試料吸着時のバッファ一が塩 化ナトリ ウム 30〜70mMを含む、 （ 5) 〜 （ 1 5) 記載の方法、
( 1 7 ) ィオン交換クロマ トグラフィ一の洗浄時のバッファ一が塩化ナ トリ ウム 150mM〜250mMを含む、 （ 5) 〜 （ 1 6 ) 記載の方法、
( 1 8 ) イオン交換ク口マトグラフィ一の洗浄時のバッファーが塩化ナ トリ ウム 190〜230mMを含む、 （ 5) 〜 （ 1 7) 記載の方法、
( 1 9) イオン交換ク口マ トグラフィ一の溶出時のバッファーが塩化ナ トリ ウム lOOmM〜； LOOOmMを含む、 （ 5 ) 〜 （ 1 8 ) 記載の方法、
( 2 0 ) ィオン交換クロマ トグラフィ一の溶出時のバッファ一が塩化ナ トリ ウム 290〜330mMを含む、 （5) 〜 （ 1 9) 記載の方法、
(2 1 ) 疎水性クロマ トグラフィーに用いるバッファーが硫酸アンモニ ゥム、 硫酸ナトリ ゥムまたは塩化ナト リ ゥムを含む、 （ 1 ) 〜 （2 0) 記 載の方法、 ( 2 2) 疎水性クロマトグラフィ一の吸着時のバッファーが硫酸アンモ ニゥム 1.0M~2.5Mを含む、 （ 1 ) 〜 （2 1 ) 記載の方法、
( 2 3) 疎水性クロマトグラフィ一の吸着時のバッファーが硫酸アンモ -ゥム 1, 8〜2· 2Mを含む、 （ 1 ) 〜 （2 2) 記載の方法、
( 2 4) 疎水性クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが硫酸アンモ ニゥム 1.0〜1.6Mを含む、 （ 1 ) 〜 （2 3) 記載の方法、
(2 5) 疎水性ク口マトグラフィ一の洗浄時のパッファ一が硫酸ァンモ -ゥム 1.2〜1.5Mを含む、 （ 1 ) 〜 （2 4) 記載の方法、
( 2 6 ) 疎水性ク ロマトグラフィ一の溶出時のバッファーが硫酸アンモ -ゥム 0.01〜1.5Mを含む、 （ 1 ) 〜 （2 5) 記載の方法、
(2 7) 疎水性クロマトグラフィ一の溶出時のバッファーが硫酸アンモ ニゥム 0.6〜1· 0Mを含む、 （ 1 ) 〜 （ 2 6 ) 記載の方法、
(2 8 ) 疎水性クロマトグラフィ一の溶出時のバッファーが親水性有機 溶媒を含む （ 1 ) 〜 （2 7 ) 記載の方法、
(2 9 ) 親水性有機溶媒が多価アルコールまたは低級アルコールである ( 2 8 ) 記載の方法、
(3 0) 多価アルコールがエチレングリコールである （2 8 ) または （2 9) 記載の方法、
( 3 1 ) エチレンダリコールの濃度が 0.01〜50%である、 （2 8 ) 〜 （3 0 ) 記載の方法、
( 3 2 ) エチレングリコールの濃度が 2〜； 10%である、 （2 8 ) 〜 （3 1 ) 記載の方法、
( 3 3 ) エチレングリコールの濃度が 3〜7%である、 （2 8) 〜 （3 2 ) 記載の方法、
( 3 4 ) 疎水性クロマトグラフィ^-の溶出時のバッファーが界面活性剤 を含む、 （ 1 ) 〜 （3 3 ) 記載の方法、
( 3 5 ) 前記界面活性剤が、 ツイーン 80(TWeen80)またはトライ ト ン X(Triton X)である、 （ 1 ) 〜 （ 3 4) 記載の方法、
( 3 6 ) 疎水性クロマトグラフィ一の溶出時のバッファーがツイーン 80 0.001〜1%を含む、 （ 1 ) 〜 （3 5 ) 記載の方法、
( 3 7 ) 疎水性クロマトグラフィ一の溶出時のバッファーがツイーン 80 0.01〜0.1%を含む、 （ 1 ) 〜 （3 6 ) 記載の方法、
( 3 8 ) 疎水性クロマトグラフィーにおいて、 試料吸着後、 吸着時温度 から 5 °C以上温度を下げることによって溶出させることを特徴とする、 ( 1 ) 〜 （ 3 7 ) 記載の方法、
( 3 9 ) 溶出時の温度が （室温一 5 ) °C~ 4 °Cの範囲である、 （ 3 8 ) 記 載の方法、
(4 0 ) 疎水性クロマトグラフィーにおいて、 試料吸着後、 吸着時パッ ファーの pHを 0. 5以上上げることによって溶出させることを特徴とす る、 （ 1 ) 〜 （3 9 ) 記載の方法、
(4 1 ) 溶出時の pHが 6〜 1 0の範囲である、 （4 0 ) 記載の方法、 (4 2 ) 疎水性クロマトグラフィーに続き、 ゲルろ過クロマトグラフィ 一を行う、 （ 1 ) 〜 （4 1 ) 記載の方法、
( 4 3 )ゲルろ過ク口マトグラフィ一の担体がセファロースである、（ 1 ) 〜 （4 2 ) 記載の方法、
(4 4 ) ゲルろ過クロマトグラフィ一に用いるバッファーに 2価の金属 イオンを添加する、 （ 1 ) 〜 （4 3 ) 記載の方法、
( 4 5 ) 2価の金属ィオンがカルシウムまたはマグネシウムである、 （ 4
4 ) 記載の方法、
(4 6 ) 2価の金属イオン濃度が 0. l〜10mMである、 （4 4 ) または （4
5 ) 記載の方法、
( 4 7 ) 2価の金属イオン濃度が ；！〜 2mMである、 （4 4 ) 〜 （4 6 ) 記 載の方法、
(4 8 ) ゥイノレスがブイロウイノレス科、 プニヤウイノレス科、 へノレぺスゥ イノレス科、 ボックスウイ/レス科、 トガウィルス科、 コロナウィルス科、 フラビウィルス科、 パラミクソウィルス科、 ァレナウィルス科、 オルト ミクソウイ/レス科、 レ ト ロウイ/レス科、 へハ0ドナゥイノレス科、 レ才ウイ ルス科、 デルタウィルス科の群から選択される科に属するウィルスであ る （ 1 ) 〜 （47) 記載の方法、
(4 9) ウィルスがエボラ出血熱ウィルス、 クリ ミァ ' コンゴ出血熱ゥ イノレス、 ノヽンターゥイノレス、 単純へノレぺス ゥイノレス、 EBゥイノレス、 天然 痘ウィルス、 牛痘ウィルス、 風疹ウィルス、 SARSウィルス (ヒ トコロナ ウィルス）、 C型肝炎ウィルス、 日本脳炎ウィルス、 黄熱ウィルス、 デン グ熱ウィルス、 西ナイルウィルス、 ロシア春夏脳炎ウィルス、 ブタコレ ラウィルス、 狂犬病ウィルス、 水疱性口内炎ウィルス、 センダイウィル ス (HVJ)、 はしかウィルス、 おたふく風邪ウィルス、 ムンプスウィルス、 風疹ウィルス、 RSウィルス、 ラッサ熱ウィルス、 ィンフルェンザウイノレ ス、 ヒ ト免疫不全ウィルス （HIV)、 ヒ ト T細胞白血病 I型ウィルス (HTLV- 1)、 ネコ免疫不全ウィルス （FIV)、 B型肝炎ウィルス （HBV)、 レ ォウィルス、 D型肝炎ウィルスの群から選択されるウィルスである （ 1 ) 〜 （4 8') 記載の方法、
(5 0) ウィルスが HVJである （ 1 ) 〜 （4 9) 記載の方法、
(5 1 ) ウィルスエンベロープが弱毒型または不活性化ウィルスェンべ ロープである （ 1 ) 〜 （5 0) 記載の方法、
(5 2) ウィルスエンベロープが不活性化ウイノレスエンベロープである ( 1 ) 〜 （5 1 ) 記載の方法、
に関する。
また、 本発明により精製されたウィルスエンベロープは、 細胞や生体 に低分子あるいは高分子化合物を導入するベクターとして広く利用する ことが出来る。 例えば W02004/039406に開示されているように、 化学療 法剤 を封入 して抗がん剤 と して用 い る こ と ができ る。 ま た W02004/046353 で示されているように、 任意の核酸を封入して目的遺伝 子やタンパク質のスクリーユングに用いることもできる。 図面の簡単な説明
図 1は、 カラム 1の陰イオン交換クロマトグラムを示す図である （実施 例 1 )。
図 2は、 カラム 2の疎水性クロマトグラムを示す図である （実施例 1 )。 図 3は、カラム 3のゲルろ過ク口マトグラムを示す図である（実施例 1 )。 図 4は、 精製された HVJエンベロープの SDSポリアク リルァミ ド電気泳 動像を示す図である （実施例 3 )。 レーン 1 ：分子量マーカー、 レーン 2 ： 細胞由来 HVJ (還元）、 レーン 3 :鶏卵由来 HVJ (還元）、 レーン 4 :細胞 由来 HVJ (非還元）、 レーン 5 :鶏卵由来 HVJ (非還元）。 発明を実施するための最良の形態
本明細書で使用される場合、 「遺伝子導入」 とは、 生体内またはインビ トロにおいて、 標的細胞内に、 天然、 合成または組み換えの所望の遺伝 子または遺伝子断片を、 導入された遺伝子がその機能を維持するように 導入することを言う。 本発明において導入される遺伝子または遺伝子断一 片は、特定の配列を有する DNA、 RNAまたはこれらの合成アナログである 核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、 トランスフエクシヨン、 およびトランスフエタ トは、 同意味 （義） に使 用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子ベクター」、「遺伝子導入ベクター」、 または 「ウイノレスエンベロープベクター」 とはゥイノレスエンベロープ中 に外来遺伝子を封入したベクターをいう。 遺伝子導入ベクターの調製の ために使用されるウィルスとしては、 野生型ウィルスであっても、 組み 換え型ウィルスであってもよレヽ。 本発明の一つの局面において、 使用されるウィルスは、 フイロウィル ス科、 ブニャウイノレス科、 へノレぺスゥイノレス科、 ボックスウイ.ルス科、 トガウィルス科、 コロナウィルス科、 フラビウィルス科、 ノ ラミクソゥ イノレス科、 ァレナウイノレス科、 才ノレ ト ミクソゥイノレス科、 レ ト ロウイノレ ス科、 へパドナウィルス科、 レオウィルス科、 およぴデルタウィルス科 からなる群から選択される科に属するウィルスである。
また、 好ましくはそれらのウィルスはエボラ出血熱ウィルス、 クリ ミ ァ · コンゴ出血熱ゥイノレス、 ノヽンターゥイノレス、単純へノレぺスゥイノレス、 EB ウィルス、 天然痘ウィルス、 牛痘ウィルス、 風疹ウィルス、 SARSウイ ルス （ヒ トコロナウィルス）、 C型肝炎ウィルス、 日本脳炎ウィルス、 黄 熱ウィルス、 デング熱ウィルス、 西ナイルウィルス、 ロシア春夏脳炎ゥ ィルス、ブタコレラウィルス、狂犬病ウィルス、水疱性口内炎ウィルス、 センダイウィルス （HVJ)、 はしかウィルス、 おたふく風邪ウィルス、 ム ンプスゥイノレス、 風疹ウィルス、 RSゥイノレス、 ラッサ熱ゥイノレス、 イ ン フルェンザウィルス、 ヒ ト免疫不全ウィルス （HIV)、 ヒ ト T細胞白血病 I型ウィルス （HTLV- 1)、 ネコ免疫不全ウィルス （FIV)、 B型肝炎ウィル ス （HBV)、 レオウィルス、 D 型肝炎ウィルスからなる群から選択される ウィルスである。
さらに好ましくはそのウィルスは、 HVJである。
本明細書で使用される場合、 「不活性化ウィルス」 とは、 ゲノムを不活 性化したウィルスをいう。 この不活性化ウィルスは、 複製欠損である。 好ましくは、 この不活性化は、 UV処理またはアルキル化剤による処理に よってなされる。
本明細書で使用される場合、 「弱毒型ウィルス」 とは、 宿主に感染して も全くあるいはほとんど宿主に病原性を示さないウィルスをいう。
本明細書で使用される場合、 「外来遺伝子」 とは、 遺伝子導入ベクター 内に含まれる、 ウィルス以外由来の核酸配列をいう。 本発明の一つの局 面において、 この外来遺伝子は、 遺伝子導入ベクターによって導入され た遺伝子が発現するために適切な調節遺伝子 （例えば、 転写に必要なプ 口モーター、 ェンハンサー、 ターミネータ一、 およびポリ A付加シグナ ル、 ならびに翻訳に必要なリボゾームの結合部位、 開始コ ドン、 終止コ ドンなど） と作動可能に連結される。 本発明の別の局面において、 外来 遺伝子は、 この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。 本発明 のさらなる局面において、 外来遺伝子は、 オリゴヌクレオチドまたはデ コィ核酸である。 遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、 代表 的には DNAまたは RNAの核酸分子であるが、 導入される核酸分子は、 核 酸アナログ分子を含んでもよい。 遺伝子導入ベクター内に含まれる分子 種は、 単一の遺伝子分子種であってもよく、 複数の異なる遺伝子分子種 であってもよレヽ。
本明細書において 「HVJ」 および 「センダイウィルス」 は同意味 （義） に用いられる。
本明細書において、 「HAU」 とは、 ニヮ トリ赤血球 0. 5%を凝集可能なゥ ィルスの活性をいい、 1 HAU は、 ほぼ 2400 万ウィルス粒子に相当する ( Okada, Y ら、 Biken Journal 4， 209〜213、 1961)。
本発明の精製法は、疎水性クロマトグラフィーのみでも可能である力 好ましくは疎水性クロマトグラフィ一とイオン交換ク口マトグラフィー および/またはゲルろ過ク口マトグラフィ一であり、具体的には以下の組 み合わせのいずれかを含む。
( 1 ) 疎水性クロマトグラフィー
( 2 ) 疎水性ク口マトグラフィ一とイオン交換ク口マトグラフィ一の組 み合わせ （順不同）
( 3 ) 疎水性クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの組み 合わせ （順不同）
( 4 ) 疎水性クロマトグラフィーとィオン交換クロマトグラフィ一とゲ ルろ過クロマトグラフィーの組み合わせ （順不同）
また、 最も好ましくは三ステップのカラムク口マトグラフィーを用い る。 ただし第三ステップは脱塩と濃縮を目的としているので、 必要に応 じて行う。 クロマトグラフィ一に用いるバッファーの pH は通常 PH7〜9 を用いる。 好ましくは pH 7. 8〜8· 5を用いる。
通常、 カラム 1には陰イオン交換ク口マトグラフィーを用いることが できる。 理論上はほぼ全ての陰イオン交換体 （DEAP、 Q、 QAE、 DEAEなど） 力 ¾便用可肯 でめる (DEAP； di ethyl aminopropyK Q； quaternary amine^ QAE； quaternary aminoethyl DEAE ; di ethylaminoethyl)。 タナましい具 体例としては、 例えば DEAP を持った ANX- Sepharose4FF ( GEアマシャム バイオサイエンス社、 Cat. No. 17-1286-01) を挙げることができる。 こ の交換体は比較的大きな細孔径と、 DEAP基のプロピル基がスぺーサーと なり担体と官能基との距離が伸びることで、 高分子を捕捉するのに特化 した担体である。 また ANX- Sepharose4FF Low Subは官能基を低密度にす ることで、 小さい分子から、 大きな分子へ選択性を高めている。 その理 由は、 通常クロマトグラフィーの相互作用は、 タンパク質 1分子に対し て、 複数の官能基が結合するためである。 一般的なクロマトグラフィー 担体は、 大過剰の官能基を結合するため、 非常に高密度な環境になる。 担体は紐が絡まりあったような構造であるので、 空間的により多くボイ ントで結合できる低分子に有利な環境となる。 つまり官能基の立体空間 を高分子用に改善したのが ANX- Sepharose4FFである。イオン交換ク口マ トグラフィ一に用いるバッファーとしては、 p H 6〜 9のバッファーが 使用でき、 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 H E P E S緩衝 液等が挙げられる。
次にカラム 2には通常疎水性ク口マトグラフィーを用いることができ る。 疎水性クロマトグラフィーに用いる担体の例としては、 市販されて いる疎水性担体の中でも、 疎水性の弱いものが好ましく、 例えば、 Ether 基、 Alkyl基等を有する疎水性担体が挙げられ、 と りわけ Ether基を有 する 担体が好ま しい。 好ま しい具体例 と して は、 東 ソ ー製 Ether - TOYOPEARL650M (Cat. No. 16173) は、 その官能基にオリ ゴェチレ ングリコール基を有している。 オリゴエチレンダリコール基は、 炭素鎖 中に 0H基の側鎖を持っために、疎水性が弱められていると考えられてい る。 これは高い疎水性を持つタンパク質は、 一般的に使用される疎水性 クロマトグラフィー担体である Butyl基や Pheny 基では互いの結合力が 強すぎるため分離が不十分になり、 結果として回収率が下がるために開 発された担体である。 またトヨパールの官能基は、 スぺーサーを介さな い方法で結合しているため、 他社の製品より疎水性がさらに低くなつて いる と思われる。 これは Phenyl- Sepharose (スぺーサーあ り ） と Phenyl-TOYOPEARLを比較した時のデータからも予想できる。 なお通常は、 Butyl基や Phenyl基等を有する疎水性ク口マトグラフィ一でウィルスを 精製することは難しいが、 通常品 （市販品） よりも官能基を低密度化し た場合には、 より小さなウィルスでも精製可能となる。 疎水性クロマト グラフィ一のバッファ一としては、 p H 6〜 9のバッファーが使用でき、 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 H E P E S緩衝液、 B i s - T r i s / H C 1、 B i s —T r i sプロパン/ H C 1 、 トリエタノ ールァミン/ H C 1 、 トリエタノールァミン Z酢酸、 N—メチルジェタ ノールァミン/ H C 1、 N—メチルジェタノールァミン Z酢酸、 ジエタ ノールァミン / H C 1、 1 , 3—ジァミ ノプロパン/ H C 1 、 ピペラジ ン Z H C 1、 トリメチルァミン Z H C 1 、 エタノールァミン/ H C 1、 n—メチルモルホリン Z H C 1等が挙げられる。 オリ ゴエチレングリ コ ール基に結合した HVJは、 バッファ一中の硫酸アンモニゥムの濃度を下 げることで溶出するが、 それだけではピークがシャープではなく、 完全 に溶出するまでにかなりの液量を要する。 そこで溶液の極性を上げるた めに親水性有機溶媒を添加することが有効である。 親水性有機溶媒は、 0. 01〜 5 0 %範囲で添加することができる。この濃度は限定されなレ、が、 通常は 2 %〜 1 0 %であり 、 好ましくは 3〜 7 %であり、 最も好ましく は 5 %である。 親水性有機溶媒は好ましくは多価アルコールまたは低級 アルコールを用いる。 本発明における低級アルコールとしては、 炭素数 1〜 6の低級炭化水素に水酸基が 1つ付加したアルコールであれば限定 されないが、 具体的には、 例えばメタノール、 エタノール、 n—プロパ ノーノレ、 i —プロノ ノーノレ、 n—プタノ一ノレ、 i ープタノ一ノレ、 tープ タノ一ル等を挙げることができる。 また多価アルコールも炭素数 2〜 6 の炭化水素に水酸碁が 2つ以上付加したアルコールであれば限定されな いが、具体的には、例えばエチレングリコール、プロピレンダリコール、 トリメチレングリコール、 グリセリン等を挙げることができる。 さらに 好ましくは多価アルコールを用いる。 最も好ましくはエチレンダリコー ルを用いる。 エチレングリコールは 0. 01〜 5 0 %範囲で添加することが できる。 この濃度は限定されないが、 通常は 2 %〜 1 0 %であり、 好ま しくは 3〜7 %であり、 最も好ましくは 5 %である。 エチレングリコー ルを添加するとピークがシャープになり、 溶出体積は力ラム体積の半分 程度になり、 精製と濃縮を同時に行えるようになる。 また、 このステツ プでは高い硫酸アンモ-ゥム濃度で精製しているため、 HVJ 同士が結合 する可能性がある。 この結合を防止するため、 溶出バッファーには界面 活性剤を添加することが有効である。界面活性剤は、 0. 001〜 1 %の範囲、 好ましくは 0. 01〜0. 1 %の範囲で添加することができる。 界面活性剤は ツイーン（Tween)やトライ トン X (Tri ton)を用いることが出来る。 より 好ましくは Tween80を用いる。 Tween80は 0. 001〜 1 °/0の範囲で添加する ことが出来る。 Tween80は好ましくは 0. 01〜0. 1 %添加する。 最も好まし くは 0. 05 %添加する。
さらにカラム 3には通常ゲルろ過ク口マトグラフィーを用いることが できる。 このステップは濃縮と脱塩のために行うので、 汎用されている ゲルろ過ク口マトグラフィーを使用できる。例えば GEアマシャムバイ才 サイエンス社の S e p h a r o s e 4 F F (Cat. No. 17—0149—01) や S e p h a r o s e 6 F F (Cat. No. 17 - 0159 - 01)を用いることができる。 ゲルろ過に用いるバッファーとしては、 p H 6〜 9のバッファーが使用 でき、 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 H E P E S緩衝液、 B i s — T r i s /H C 1 , B i s - T r i sプロパン/ H C 1 、 ト リ エタノールァミン/ H C 1 、 トリエタノールァミン/酢酸、 N—メチル ジエタノールァミン ZHC 1 、 N—メチルジェタノールァミン /酢酸、 ジエタノールァミン/ H C 1 、 1， 3—ジァミノプロパン/ HC 1 、 ピ ペラジン/ H C 1 、 トリメチルァミン ZH C 1 、 エタノールァミン/ H C 1、 n—メチルモルホリ ン/ H C 1等が挙げられる。 なお、 バッファ 一には親水性有機溶媒を添加してもよく、 添加可能な親水性有機溶媒と しては、 上記と同様のものが挙げられる。
また、 ゲルろ過クロマトグラフィ一に用いるバッファーおよび/また は最終精製物にノィラミニダーゼの安定剤として 2価の金属イオンを添 加することが有効である。 2 価の金属イオンは好ましくはカルシウムま たはマグネシウムである。 通常これらの金属イオンは 0.1〜 1 OmMの範 囲で添加する。 好ましくは 1〜 2mMの濃度になるように添加する。 実施例
続いて本発明を具体的に説明するため、 以下に実施例を掲げるが、 本 発明はこれらに限定されない。 実施例 1 . カラムクロマトグラフィーによる HV.Tの精製
浮遊細胞培養系により産生した HVJを遠心分離により除細胞処理を行 つて得られた細胞培養上清から、 3段階のクロマトグラフィー工程によ り精製した。 まず、各カラムはエン ドトキシンの不活化をするために、使用前に 0. 2 5M水酸化ナトリ ゥム溶液を通液して、 8時間以上保持した後に使用 した。
( 1 ) イオン交換樹脂クロマ トグラフィー
遠心分離した培養上清を 5 OmM トリス塩酸緩衝液 pH7. 8で等倍に 希釈した。これを 5 0 mM塩化ナトリ ゥムを含む 5 0 mM トリス塩酸緩衝 液 pH7. 8で平衡化したカラム 1に通液して吸着させた。 カラム 1には 陰イオン交換クロマトグラフィー用担体である AN X— S e p h a r o s e 4 F F L o w S u b ( G Eアマシャムバイオサイエンス社製、 C a t . N o . 1 7 - 1 2 8 6 - 0 1 ) を B P G 2 00/5 00空カラム (G Eアマシャムバイオサイエンス社製） に直径 20センチ、 高さ 9セ ンチに充填した 3 Lのものを使用した。線流速は 9 6 c m/hで行った。 さらにカラム体積の 3倍容の平衡化バッファーを通液した後、 カラム体 積の 8倍容の 2 1 0 mM塩化ナトリ ウムを含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝 液 p H 7. 8を通液して洗浄した。 カラム 1からの HVJの溶出は 3 1 0 mM塩化ナトリ ゥムを含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 p H 7. 8を通液 した。 このときカラム通過液の UV 28 0 n mにおける吸光度が上昇す るのでその部分を回収した。 これをカラム 1溶出画分とした。 最後に 2 M塩化ナトリゥムを含む 5 0 mM トリス塩酸緩衝液を通液してカラム 1 を再生した。 （図 1参照）
( 2 ) 疎水性樹脂クロマトグラフィー
次いでカラム 1溶出画分に 4 M硫酸アンモニゥム溶液を等容添加して 2M 硫酸アンモニゥムを含む溶液を調整した。 これを 2M硫酸アンモニ ゥムを含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 p H 7. 8で平衡化したカラム 2 に通液して吸着させた。 カラム 2には疎水性相互作用クロマトグラフィ 一用担体である E t h e r -TOYO P EAR L 6 5 0 M (東ソ一社製、 C a t . N o . 1 6 1 7 3) を B P G 1 00/5 00空カラム （GEァ マシャムバイォサイエンス社製) に直径 1 0センチ、 高さ 1 2. 5セン チに充填した 1 Lのものを使用した。線流速は 1 9 0 c mZhで行った。 さらにカラム体積の 3倍容の平衡化バッファーを通液した後、 カラム体 積の 5倍容の 1. 4 M硫酸ァンモユウムを含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝 液を通液して洗浄した。 カラム 2からの HVJの溶出には 0. 8M硫酸ァ ンモニゥム、 5 %エチレングリ コール、 および 0. 0 5 %Tw e e n 8 0を含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 p H 7. 8を通液した。 このとき力 ラム通過液の UV 2 8 0 n mにおける吸光度が上昇するのでその部分を 回収した。 これをカラム 2溶出画分とした。 最後に 5 %エチレングリコ ール溶液を通液してカラム 2を再生した。 （図 2参照）
(3) ゲルろ過クロマトグラフィー
さらに、 カラム 2溶出画分を 1 5 0 mM塩化ナトリ ウムを含む 5 0 m Mトリス塩酸緩衝液 p H 7. 8で平衡化したカラム 3に通液した。 カラ ム 3にはゲルろ過クロマトグラフィー用担体である S e p h a r o s e 4 F F (G Eアマシャムバイオサイエンス社製、 C a t . N o . 1 7 - 0 1 4 9— 0 1 ) を XK 5 0Z6 0空カラム （GEアマシャムバイオサ ィエンス社製） に直径 5センチ、 高さ 4 0センチで充填した 0. 8 の ものを使用した。 線流速は 1 20 c mZhで行った。 カラム溶出画分に 次いで平衡化バッファーを通液した。 このとき力ラム通過液の UV 2 8 0 nmにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。 これをカラ ム 3溶出画分とした。 （図 3参照）
カラム 3溶出画分に 0. 5 %メチルセルロースを 1 Z 4容相当量を添 加して、 最終濃度 0. 1 %メチルセルロース含有 HVJ溶液を調製した。 これを 0. 4 5 ミクロンの無菌ろ過フィルターでろ過した。 これを液体 窒素で急速凍結して、 一 8 0°Cで保存することで、 高純度の HVJを長期 間、 安定的に保存できた。
バッファ一等に使用した主な試薬で、 トリス （ヒ ドロキシメチル） ァ ミノメタン、 塩化ナトリ ゥム、 塩化カルシウム 2水和物、 塩化マグネシ ゥム 6水和物、 水酸化ナトリ ウム、 エチレングリ コール、 硫酸アンモニ ゥム、 および Tw e e n 8 0は和光純薬製、 またはシグマ社製の特級品 を使用した。 塩酸は和光純薬社製の 6規定規格品を使用した。 精製品の 安定化剤として添加した 0. 5 %メチルセルロースは、 和光純薬社製の ものを使用した。 精製品の無菌ろ過には孔径 0. 4 5 ミクロンの親水化 ろ過フィルター M i l l i p a k G a mm a G o l d (日本ミ リポア 社） を使用した。 比較例 1. 膜濃縮おょぴ、 カラムクロマトグラフィーによる HV.丁の精製 浮遊細胞培養系により産生した HVJを遠心分離により除細胞処理を行 つて得られた細胞培養上清を、 限外膜濃縮と 3段階のク口マトグラフィ 一工程により精製した。
まず、 膜濃縮装置、 および各カラムはエンドトキシンの不活化をする ために使用前に 0. 2 5 M水酸化ナトリ ウム溶液を通液して、 8時間以 上保持した後に使用した （一般的に一週間程度の保持により、 生菌なら びにエンドトキシンを完全に除去できる）。
( 1 ) ろ過と膜濃縮
遠心分離した培養上清を 1 . 2 mのミ リガードフィルターでろ過し て粒子を除去した。 これをペリコン膜濃縮装置を用いて 6 0 0 mL に濃 縮した。
( 2 ) ゲルろ過クロマトグラフィー （カラム 1 )
1 5 0 mM塩化ナトリ ゥムを含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 p H 7. 8で平衡化したカラム 1に （ 1 ) で得られた濃縮培養上清を通液した。 カラム 1にはゲルろ過クロマ トグラフィ一用担体である S e p h a r ο s e 6 F F (G Eアマシャムバイオサイエンス社製） を B P G 1 0 0 / 5 0 0空カラム （G Eアマシャムバイオサイエンス社製） に直径 1 0セ ンチ、 高さ 3 3センチに充填した 2. 5 Lのものを使用した。 線流速は 1 5 0 c mZhで行った。 次いで平衡化パッファーを通液した。 このと きカラム通過液の UV 2 8 0 nmにおける吸光度が上昇するのでその部 分を回収した。 これをカラム 1溶出画分とした。
( 3) イオン交換クロマトグラフィー (カラム 2 )
次いでカラム 1溶出画分 1 5 0 mM 塩化ナトリ ウムを含む 5 O mMト リス塩酸緩衝液 p H 7. 8で平衡化したカラム 2に通液して吸着させた。 カラム 2にはイオン交換クロマトグラフィー用担体である Q— S e p h a r o s e F F ( G Eアマシャムバイオサイエンス社製） を B P G 2 0 0 / 500空力ラム (GEアマシャムバイォサイエンス社製) に直径 2 0センチ、 高さ 6. 5センチに充填した 2 Lのものを使用した。 線流速 は 70 c m/hで行った。 さらにカラム体積の 5倍容の平衡化バッファ 一を通液した。 カラム 2からの HVJの溶出には 0. 4 5 M塩化ナトリ ウ ムを含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液 p H 7. 8を通液した。 このとき力 ラム通過液の UV 2 8 0 n mにおける吸光度が上昇するのでその部分を 回収した。 これをカラム 2溶出画分とした。 最後に 2M塩化ナトリウム を通液してカラム 2を再生した。
(4) ゲルろ過クロマトグラフィー （カラム 3)
カラム 2溶出画分を 1 5 0 mM塩化ナトリ ウムを含む 5 0 mMトリス 塩酸緩衝液 p H 7. 8で平衡化したカラム 3に通液した。 カラム 3には ゲルろ過クロマ トグラフィー用担体である S e p h a r o s e 6 F F (G Eアマシャムバイオサイエンス社製） を B P G 1 00Z 5 00空力 ラム （G Eアマシャムバイオサイエンス社製） に直径 1 0センチ、 高さ 3 3センチで充填した 2. 5 Lのものを使用した。 線流速は 1 5 0 c m Zhで行った。 カラム溶出画分に次いで平衡化バッファーを通液した。 このときカラム通過液の UV 2 8 0 nmにおける吸光度が上昇するので その部分を回収した。 これをカラム 3溶出画分とした。 カラム 3溶出画分に 0. 5 %メチルセルロースを 1 / 4容相当量を添 加して、 最終濃度 0. 1 %メチルセルロース含有 HVJ溶液を調製した。 これを 0. 4 5 ミクロンの無菌ろ過フィルターでろ過した。
バッファ一等に使用した主な試薬で、 トリス （ヒ ドロキシメチル） ァ ミノメタン、 塩化ナトリ ウム、 塩化カルシウム 2水和物、 塩化マグネシ ゥム 6水和物、 水酸化ナトリ ウムは和光純薬製、 またはシグマ社製の特 級品を使用した。 塩酸は和光純薬社製の 6規定規格品を使用した。 精製 品の安定化剤として添加した 0. 5 °/0メチルセルロースは、 和光純薬社 製のものを使用した。 精製品の無菌ろ過には孔径 0. 4 5 ミクロンの親 7 化ろ過フィルター M i l l i p a k G a mm a G o l d (日本ミ リ ポア社） を使用した。 実施例 2. 精製した HV.Tの活性測定と回収率
HVJの活性は、 シアル酸分解酵素 （ノイラミニダーゼ、 NA) 活性と、 ニヮ トリ赤血球の凝集活性 （へマダルチュン活性、 HA) により測定し た。 いずれも、 回収したウィルスの濃度、 量に対して比例関係にあり定 量性もある。 この 2つの方法による本発明実施例 1における HVJの残存 活性と、 NA活性値による回収率を表 1に示した。 比較例を用いた場合 の回収率を表 2に示した。 表 1、 2の比較により、本発明による優れた効 果が明らかである。
(表 1 ) (本発明、 実施例 1 ) ステップ 体積（mL) NA活性（mU/tnL) 全 NA (mU) 回収率（NA %) HA (U) 開始原料 10250 297. 0 3044066 100. 0
カラム 1 1200 1891. 4 2269735 74. 6
カラム 2 450 3524. 0 1585790 52. 1
カラム 3 500 3627. 6 1813813 59. 6
ろ過 625 3027. 2 1892022 62. 2
最終生成物
(不活性化ウィルス） 590 2066. 1 1218993 40. 0 5120
(表 2 ) (従来の精製法、 比較例 1 ) ステップ 体積 (mL) NA活性（mU/mL) 全 NA (mU) 回収率（NA %) HA (U) 開始原料 10800 71. 9 775982 100. 0
ろ過 10800 51. 1 551397 71. 1
膜濃縮 600 903. 4 542069 69. 9
カラム 1 1000 573. 4 573351 73. 9
カラム 2 1000 373. 8 373770 48. 2
カラム 3 1050 393. 8 413483 53. 3
ろ過 1300 218. 3 283804 36. 6
最終生成物
(不活性化ウィルス） 1 120 159. 7 178864 23. 1 2560 実施例 3 . S D S— P A G Eによる精製 HVJの純度分析
HVJ の電気泳動は、 4一 1 2 Q/oの S D S— P A G Eゲルで行った。 ゥ ィルスに適した膜タンパク質の可溶化剤（シグマ社 CelLyt i c— M Cat. No. C2978) を用いて HVJを可溶化して、 そのまま電気泳動したものを非 還元処理サンプル、 可溶化後に 2—メルカプトエタノールを添加して 9 5 °Cで 1 0分加熱処理を施したものを還元処理サンプルと した。 また一 般的手法との比較として受精鶏卵で培養後にしょ う尿液を陰イオン交換 クロマトグラフィ一で精製した HVJも同様の処理をした。 これを 1 0 0 Vの定電圧で 2 . 5時間電気泳動して、 S Y P R O R u b y蛍光染色液 (バイオラッ ド社 SYPRO Ruby Protein Gel Stain Cat. No. 170-3125) にて染色後、 蛍光イメージングシステムでゲルを解析した。 電気泳動の 結果を図 4に示した。 従来の鶏卵から精製する方法と比較しても同純度 の HVJエンベロープを得ることができた。 産業上の利用可能性
ウィルスエンベロープをその細胞融合活性を保ちつつ、 かつ高回収率 で精製する方法を提供できる。 精製されたウィルスエンベロープは遺伝 子などの生体高分子を細胞や生体内に導入するベクターとして使用され 得る。
本発明の方法を用いれば、 従来方法に比較して高い回収率で不活性ゥ ィルスエンベロープ （例えば HVJ) をその融合活性を保持したまま精製 することができる。 従って、 ウィルスエンベロープを工業的に製造する 際に有用である。 また、 本発明の方法は不活性化されていないェンベロ ープウィルスの精製にも適用することができる。 本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 4— 2 1 9 3 8 1 (出願日 ： 2 0 0 4年 7月 2 7 日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て 包含されるものである。

Claims

請求の範囲
I . ウィルスエンベロープの精製において、 疎水性クロマトグラフィー を用いることを特徴とする方法。
2 . 前記疎水性クロマトグラフィーの官能基が弱疎水性基である、 請求 の範囲 1記載の方法。
3 . 前記疎水性ク口マトグラフィ一の官能基がオリゴエチレングリコー ル基またはフヱニル基である、 請求の範囲 1または 2記載の方法。
4 . 前記疎水性ク口マトグラフィ一の官能基がオリゴエチレングリコー ル基である、 請求の範囲 1ないし 3記載の方法。
5 . 前記疎水性クロマトグラフィーとイオン交換樹脂クロマトグラフィ 一および Zまたはゲルろ過ク口マトグラフィーを組み合わせることを特 徴とする、 請求の範囲 1ないし 4記載の方法。
6 . イオン交換クロマトグラフィ一と疎水性クロマトグラフィーを組み 合わせることを特徴とする、 請求の範囲 5記載の方法。
7 . 第一のクロマトグラフィーにイオン交換樹脂、 第二のクロマトダラ フィ一に疎水性樹脂を用いる、 請求の範囲 5または 6記載の方法。
8 . イオン交換ク口マトグラフィ一が陰イオン交換ク口マトグラフィー である、 請求の範囲 5ないし 7記載の方法。
9 . イオン交換クロマトグラフィ一が弱陰イオン交換クロマトグラフィ —である、 請求の範囲 5ないし 8記載の方法。
1 0 . イオン交換クロマトグラフィ一の官能基がジェチルァミノプロピ ル （DEAP) 基である、 請求の範囲 5ないし 9記載の方法。
I I . イオン交換クロマトグラフィ一の官能基が低密度置換型（Low Sub) である、 請求の範囲 5ないし 1 0記載の方法。
1 2 . クロマトグラフィ一のバッファーが pH7〜9である、請求の範囲 1 ないし 1 1記載の方法。
1 3 . クロマトグラフィ一のバッファ一が pH 7. 8〜8. 5である請求の範 囲 1ないし 1 2記載の方法。
1 4 . イオン交換クロマトグラフィ一に用いるバッファーが塩化ナトリ ゥムまたは塩化力リ ゥムを含む、 請求の範囲 5ないし 1 3記載の方法。
1 5 . イオン交換ク口マトグラフィ一の試料吸着時のバッファーが塩化 ナトリウム 0. 01〜150mMを含む、 請求の範囲 5ないし 1 4記載の方法。
1 6 . イオン交換クロマトグラフィ一の試料吸着時のバッファーが塩化 ナトリウム 30〜70mMを含む、 請求の範囲 5ないし 1 5記載の方法。
1 7 . イオン交換クロマトグラフィ一の洗浄時のバッファ一が塩化ナト リウム 150mM〜250mMを含む、 請求の範囲 5ないし 1 6記載の方法。 1 8 . イオン交換クロマ トグラフィーの洗浄時のバッファーが塩化ナト リ ウム 190〜230mMを含む、 請求の範囲 5ないし 1 7記載の方法。
1 9 . イオン交換クロマトグラフィ一の溶出時のバッファ一が塩化ナト リウム 100mM〜1000mMを含む、 請求の範囲 5ないし 1 8記載の方法。 2 0 . イオン交換クロマトグラフィ一の溶出時のパッファ一が塩化ナト リウム 290〜330mMを含む、 請求の範囲 5ないし 1 9記載の方法。
2 1 . 疎水性クロマトグラフィ一に用いるバッファーが硫酸アンモユウ ム、 硫酸ナトリゥムまたは塩化ナトリ ゥムを含む、 請求の範囲 1ないし 2 0記載の方法。 .
2 2 . 疎水性クロマ トグラフィ一の吸着時のバッファーが硫酸アンモ- ゥム 1. 0M〜2. 5Mを含む、 請求の範囲 1ないし 2 1記載の方法。
2 3 . 疎水性クロマ トグラフィ一の吸着時のバッファーが硫酸アンモニ ゥム 1. 8〜2. 2Mを含む、 請求の範囲 1ないし 2 2記載の方法。
2 4 . 疎水性クロマトグラフィ一の洗浄時のバッファ一が硫酸ァンモニ ゥム 1. 0〜1. 6Mを含む、 請求の範囲 1ないし 2 3記載の方法。
2 5 . 疎水性クロマ トグラフィーの洗浄時のバッファーが硫酸アンモ- ゥム 1. 2〜1. 5Mを含む、 請求の範囲 1ないし 2 4記載の方法。
2 6 . 疎水性クロマトグラフィ一の溶出時のバッファーが硫酸アンモェ ゥム 0. 01〜1. 5Mを含む、 請求の範囲 1ないし 2 5記載の方法。
2 7 . 疎水性クロマトグラフィ一の溶出時のバッファーが硫酸アンモニ ゥム 0. 6〜1. 0Mを含む、 請求の範囲 1ないし 2 6記載の方法。
2 8 . 疎水性ク口マトグラフィ一の溶出時のバッファーが親水性有機溶 媒を含む請求の範囲 1ないし 2 7記載の方法。
2 9 . 親水性有機溶媒が多価アルコールまたは低級アルコールである請 求の範囲 2 8記載の方法。
3 0 . 多価アルコールがエチレングリコールである請求の範囲 2 8また は 2 9記載の方法。
3 1 . エチレングリコールの濃度が 0. 01〜50%である、 請求の範囲 2 8 ないし 3 0記載の方法。
3 2 . エチレンダリコールの濃度が 2〜10%である、 請求の範囲 2 8な いし 3 1記載の方法。
3 3 . エチレンダリコールの濃度が 3〜7%である、 請求の範囲 2 8ない し 3 2記載の方法。
3 4 . 疎水性クロマ トグラフィ一の溶出時のバッファーが界面活性剤を 含む、 請求の範囲 1ないし 3 3記載の方法。
3 5 . 前記界面活性剤が、 ツ イ ーン 80 (Tween80)または トライ ト ン X (Triton X)である、 請求の範囲 1ないし 3 4記載の方法。
3 6 . 疎水'!"生ク ロマ トグラフィーの溶出時のバッファーがツイーン 80 0. 001〜1 °/。を含む、 請求の範囲 1ないし 3 5記載の方法。
3 7 . 疎水性ク ロマ トグラフィーの溶出時のバッファーがツイーン 80 0. 01〜0. 1 %を含む、 請求の範囲 1ないし 3 6記載の方法。
3 8 . 疎水性クロマトグラフィーにおいて、 試料吸着後、 吸着時温度か ら 5 °C以上温度を下げることによって溶出させることを特徴とする、 請 求の範囲 1ないし 3 7記載の方法。
3 9 . 溶出時の温度が （室温一 5 ) °C〜4 °Cの範囲である、 請求の範囲 3 8記載の方法。
4 0 . 疎水性クロマトグラフィーにおいて、 試料吸着後、 吸着時バッフ ァ一の pHを 0 . 5以上上げることによって溶出させることを特徴とする、 請求の範囲 1ないし 3 9記載の方法。
4 1 .溶出時の pHが 6〜 1 0の範囲である、請求の範囲 4 0記載の方法。 4 2 . 疎水性クロマトグラフィ一に続き、 ゲルろ過クロマトグラフィー を行う、 請求の範囲 1ないし 4 1記載の方法。
4 3 . ゲルろ過クロマトグラフィーの担体がセファロースである、 請求 の範囲 1ないし 4 2記載の方法。
4 4 . ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるバッファーに 2価の金属ィ オンを添加する、 請汆の範囲 1ないし 4 3記載の方法。
4 5 . 2価の金属イオンがカルシウムまたはマグネシウムである、 請求 の範囲 4 4記載の方法。
4 6 . 2価の金属イオン濃度が 0. l〜10mMである、 請求の範囲 4 4また は 4 5記載の方法。
4 7 . 2価の金属イオン濃度が l〜2mMである、請求の範囲 4 4ないし 4 6記載の方法。
4 8 . ゥイノレスがフィロウイノレス科、 ブェャゥイノレス科、 へノレぺスウイ ノレス科、 ボックスウイノレス科、 トガウイノレス科、 コロナウイノレス科、 フ ラビウィルス科、 ノ ラミクソウィルス科、 ァレナウィルス科、 オルトミ クソウィルス科、 レトロウイルス科、 へパドナウィルス科、 レオウィル ス科、 デルタウィルス科の群から選択される科に属するウィルスである 請求の範囲 1ないし 4 7記載の方法。
4 9 . ウィルスがエボラ出血熱ウィルス、 クリ ミァ · コンゴ出血熱ウイ ノレス、 ハンターウィルス、 単純へノレぺスゥイノレス、 EBゥイノレス、 天然痘 ゥイノレス、 牛痘ゥイノレス、 風疹ウイノレス、 SARSウイノレス （ヒ トコ口ナウ ィルス）、 C型肝炎ウィルス、 日本脳炎ウィルス、 黄熱ウィルス、 デング 熱ウィルス、 西ナイルウィルス、 ロシア春夏脳炎ウィルス、 プタコレラ ウィルス、 狂犬病ウィルス、 水疱性口内炎ウィルス、 センダイウィルス
(HVJ)、 はしかウィルス、 おたふく風邪ウィルス、 ムンプスウィルス、 風疹ウィルス、 RS ウィルス、 ラッサ熱ウィルス、 インフルエンザウィル ス、 ヒ ト免疫不全ウィルス （HIV)、 ヒ ト T細胞白血病 I 型ウィルス
(HTLV- 1)、 ネコ免疫不全ウィルス （FIV)、 B型肝炎ウィルス （HBV)、 レ ォウィルス、 D 型肝炎ウィルスの群から選択されるウィルスである請求 の範囲 1ないし 4 8記載の方法。
5 0 . ウィルスが HVJである請求の範囲 1ないし 4 9記載の方法。
5 1 . ウィルスエンベロープが弱毒型または不活性化ウィルスェンベロ ープである請求の範囲 1ないし 5 0記載の方法。
5 2 . ウィルスエンベロープが不活性化ウィルスエンベロープである請 求の範囲 1ないし 5 1記載の方法。
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