CN109790540A - 提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒 - Google Patents

提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109790540A
CN109790540A CN201780058975.1A CN201780058975A CN109790540A CN 109790540 A CN109790540 A CN 109790540A CN 201780058975 A CN201780058975 A CN 201780058975A CN 109790540 A CN109790540 A CN 109790540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
sample
silicon dioxide
dioxide granule
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780058975.1A
Other languages
English (en)
Inventor
佐藤正树
米川俊广
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eiken Chemical Co Ltd
Original Assignee
Eiken Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eiken Chemical Co Ltd filed Critical Eiken Chemical Co Ltd
Publication of CN109790540A publication Critical patent/CN109790540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种从生物体试样中提取核酸的方法。该方法具备：(i)将生物体试样、阴离子型表面活性剂和离液化合物混合而得到溶解液的步骤；(ii)将溶解液、沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子混合而使核酸吸附在二氧化硅粒子上的步骤；(iii)利用清洗液对吸附有核酸的二氧化硅粒子进行清洗的步骤；以及(iv)利用洗脱液将吸附在二氧化硅粒子上的核酸洗脱的步骤，至少步骤(i)和(ii)在超过75℃的温度下进行。

Description

提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒
技术领域
本发明涉及提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒。
背景技术
作为从生物体试样中提取核酸的方法之一，有BOOM法(例如参考专利文献1)。在该方法中，在离液化合物(chaotropic compound)的存在下使核酸吸附在二氧化硅粒子上，将核酸从生物体试样中分离，该离液化合物是从核酸等生物体高分子中夺去水合水而使该生物体分子的高级结构变得不稳定的物质。
作为利用BOOM法的方法，可以列举例如下述方法，该方法具备将生物体试样溶解的步骤、以及在离液化合物和/或烷醇的存在下将二氧化硅等和核酸固定化的步骤，其中，在36～75℃的温度范围内实施该核酸的固定化(例如参考专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平2-289596号公报
专利文献2：日本特表2008-529509号公报
发明内容
发明所要解决的问题
为了提取核酸，需要进行破坏细胞的膜结构、使内容物释放到细胞外的溶解步骤。作为溶解方法之一，在市售的核酸提取试剂盒中广泛采用利用蛋白分解酶的酶溶解法。另外，在从微生物中的革兰氏阳性菌或真菌等具有特殊细胞壁的细胞中提取核酸的情况下，需要另外利用溶菌酶、酵母裂解酶等细胞壁分解酶进行预处理。因此，根据生物材料的种类，所对应的试剂盒或操作规程通常有所不同。
另外，对于大多数采用酶溶解法的试剂盒而言，相对于核酸提取的全部步骤时间，溶解步骤占据了大部分的时间。另外，多数情况下需要进一步进行离心分离步骤。因此，不适合于要求快速性的应用。
本发明是鉴于这样的实际情况而完成的，因此，本发明的目的在于提供能够缩短从生物体试样中提取核酸所要的时间的、提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明提供一种从生物体试样中提取核酸的方法，其具备：(i)将生物体试样、阴离子型表面活性剂和离液化合物混合而得到溶解液的步骤；(ii)将溶解液、沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子混合而使核酸吸附在二氧化硅粒子上的步骤；(iii)利用清洗液对吸附有核酸的二氧化硅粒子进行清洗的步骤；以及(iv)利用洗脱液将吸附在二氧化硅粒子上的核酸洗脱的步骤，至少步骤(i)和(ii)在超过75℃的温度下进行。
上述方法中，优选步骤(iv)在超过75℃的温度下进行。
沸点超过75℃的烷醇可以为1-丙醇。
阴离子型表面活性剂优选为十二烷基硫酸锂。
离液化合物可以为胍盐。
另外，本发明提供一种核酸提取试剂盒，其包含：含有阴离子型表面活性剂的第一溶解用溶液；含有离液化合物的第二溶解用溶液；以及含有沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子的吸附液。
试剂盒中，沸点超过75℃的烷醇可以为1-丙醇。
试剂盒中，阴离子型表面活性剂优选为十二烷基硫酸锂。
试剂盒中，离液化合物可以为胍盐。
发明效果
根据本发明，可以提供能够缩短从生物体试样中提取核酸所要的时间的、提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒。
附图说明
图1(a)～(e)是分别示出利用全自动核酸提取仪得到的核酸的提取量的图。(a)是示出使用含有肺炎球菌的试样的情况下的结果的图，(b)是示出使用含有百日咳菌的试样的情况下的结果的图，(c)是示出使用含有酵母菌的试样的情况下的结果的图，(d)是示出使用含有人II型腺病毒的试样的情况下的结果的图，(e)是示出使用含有甲型流感病毒的试样的情况下的结果的图。
图2(a)、(b)是分别示出利用全自动核酸提取仪得到的核酸的提取量的图。(a)是示出使用在健康人来源样本中添加有含有肺炎球菌的样本的试样的情况下的结果的图，(b)是示出使用在健康人来源样本中添加有含有人II型腺病毒的样本的试样的情况下的结果的图。
图3(a)、(b)是分别示出洗脱温度与核酸的提取量的关系的图。(a)是示出使用含有肺炎球菌的试样的情况下的结果的图，(b)是示出使用含有甲型流感病毒的试样的情况下的结果的图。
具体实施方式
以下，对本具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
本实施方式的从生物体试样中提取核酸的方法具备(i)将生物体试样、阴离子型表面活性剂和离液化合物混合而得到溶解液的步骤。
溶解液例如通过向配置在加热块上的微型管中加入生物体试样、含有阴离子型表面活性剂的第一溶解用溶液以及含有离液化合物的第二溶解用溶液并进行混合、加热而得到。
可以将生物体试样、含有阴离子型表面活性剂的第一溶解用溶液以及含有离液化合物的第二溶解用溶液同时进行混合，也可以将生物体试样与含有阴离子型表面活性剂的第一溶解用溶液或含有离液化合物的第二溶解用溶液中的任意一种溶液混合而得到混合液后，再将该混合液与另一种溶液混合。
本说明书中，“生物体试样”是指供于核酸提取的样本，具体而言，是病毒、噬菌体、细菌、真菌、生物的细胞、组织和器官中的一部分或全部，除了从生物体直接采集的样本以外，还包括从水、土壤、空气等环境中得到的样本。作为生物体试样，可以列举例如血液、咽拭子、鼻咽拭子、咯痰、脑脊液、尿、粪便、唾液等。
核酸可以为DNA和RNA等天然存在的核酸。
作为阴离子型表面活性剂，可以列举例如十二烷基硫酸锂(Lithium DodecylSulfate、LDS)、十二烷基硫酸钠等。从不易在低温下析出的观点考虑，阴离子型表面活性剂优选为十二烷基硫酸锂(Lithium Dodecyl Sulfate、LDS)。
作为离液化合物，可以列举例如胍盐等。胍盐例如可以为(异)硫氰酸胍(GuSCN)和盐酸胍。
在步骤(i)之后，(ii)将溶解液、沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子混合，使核酸吸附在二氧化硅粒子上。
为了使核酸吸附在二氧化硅粒子上，例如，向设置在加热块上并加入有上述溶解液的微型管中添加含有沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子的吸附液并进行混合、加热。
从缩短溶解至吸附所要的时间的观点出发，步骤(i)和步骤(ii)的实施温度为超过75℃的温度，优选为80℃以上，更优选为85℃以上。步骤(i)和步骤(ii)的实施温度优选为100℃以下，更优选为98℃以下，进一步优选为95℃以下。步骤(i)和步骤(ii)的实施温度例如为75～100℃、75～98℃、75～95℃、80～100℃、80～98℃、80～95℃、85～100℃、85～98℃或85～95℃。
通过使步骤(i)和步骤(ii)的实施温度均为超过75℃的温度，能够缩短液温的温度变化所要的时间。因此，能够缩短生物体试样的溶解至核酸的吸附所要的时间。其结果是，也能够缩短核酸的提取所要的时间(从生物体试样的溶解至核酸的洗脱所要的时间)。
步骤(ii)中使用的烷醇的沸点为超过75℃的温度，优选为80℃以上，更优选为85℃以上。步骤(ii)中使用的烷醇的沸点优选为120℃以下，更优选为110℃以下，进一步优选为100℃以下。步骤(ii)中使用的烷醇的沸点例如为75～120℃、75～110℃、75～100℃、80～120℃、80～110℃、80～100℃、85～120℃、85～110℃或85～100℃。
沸点超过75℃的烷醇例如为1-丙醇、乙醇、异丙醇等。
离液化合物的具体例与步骤(i)中的离液化合物的具体例相同。
作为二氧化硅粒子，可以列举由烷基二氧化硅、硅酸铝(也称为“沸石”)、具有氨基的二氧化硅等构成的粒子。从容易集聚的观点出发，二氧化硅粒子优选为磁性二氧化硅粒子。
在步骤(ii)之后，(iii)利用清洗液对吸附有核酸的二氧化硅粒子进行清洗。
步骤(iii)例如可以具备：在吸附有核酸的二氧化硅粒子中添加含有醇和阴离子型表面活性剂的第一清洗液并进行搅拌，然后将吸附有核酸的二氧化硅粒子与第一清洗液分离的步骤；以及在分离后的二氧化硅粒子中添加含有聚乙二醇(Polyethylene Glycol)的第二清洗液并进行搅拌，然后将吸附有核酸的二氧化硅粒子与第二清洗液分离的步骤。
醇可以为2-丙醇、1-丙醇或乙醇。醇可以为它们的混合物。
阴离子型表面活性剂例如可以为十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate、SDS)，也可以为十二烷基硫酸锂。阴离子型表面活性剂可以为它们的混合物。
聚乙二醇(Polyethylene Glycol)的平均分子量可以为200～10000。作为这样的聚乙二醇(Polyethylene Glycol)，可以列举例如聚乙二醇4000(Polyethylene Glycol4000、PEG4000)。本说明书中，聚乙二醇的平均分子量是指根据第十六次修订的日本药典中记载的各Macrogol(聚乙二醇)的平均分子量试验测定的值。
在步骤(iii)之后，(iv)利用洗脱液将吸附在二氧化硅粒子上的核酸洗脱。
核酸可以利用例如下述方法进行洗脱。即，首先，将吸附有核酸的二氧化硅粒子和洗脱液混合并搅拌，然后进行加热。再次搅拌后，将二氧化硅粒子与溶液分离，由此能够将核酸洗脱。
从在短时间内高效地将所吸附的核酸洗脱的观点出发，步骤(iv)的实施温度为超过75℃的温度，优选为80℃以上，更优选为85℃以上。步骤(iv)的实施温度优选为100℃以下，更优选为98℃以下，进一步优选为95℃以下。步骤(iv)的实施温度例如为75～100℃、75～98℃、75～95℃、80～100℃、80～98℃、80～95℃、85～100℃、85～98℃或85～95℃。
通过将步骤(iv)的实施温度与步骤(ii)的实施温度同样地设定为超过75℃的温度，能够在不改变加热块等加热器的加热条件的情况下进行核酸的提取(从生物体试样的溶解至核酸的洗脱)。因此，能够缩短加热器内和溶液的温度变化所要的时间，能够进一步缩短核酸的提取所要的时间(从生物体试样的溶解至核酸的洗脱所要的时间)。
通过使步骤(i)、步骤(ii)和步骤(iv)的实施温度均为超过75℃的温度，能够在短时间内从生物体试样得到高收量的核酸。另外，若步骤(i)、步骤(ii)和步骤(iv)的实施温度均为超过75℃的温度，则能够在同等程度的温度条件下实施步骤(i)、步骤(ii)和步骤(iv)，因此只要单个加热器即可，不需要温度设定不同的多个加热器。
洗脱液可以列举例如灭菌水、低盐浓度的缓冲液等。低盐浓度的缓冲液例如为含有10mM的Tris盐酸(Tris-HCl)的缓冲液。
从上述步骤(i)至步骤(iv)可以手动进行，也可以使用核酸提取仪全自动地进行。
本实施方式的方法所需要的各溶液可以预先进行包装，以核酸提取试剂盒的形式利用。即，核酸提取试剂盒包含含有阴离子型表面活性剂的第一溶解用溶液。阴离子型表面活性剂的具体例与从生物体试样中提取核酸的方法的步骤(i)中的阴离子型表面活性剂的具体例相同。
阴离子型表面活性剂的浓度以生物体试样和第一溶解用溶液的混合液中的浓度计优选为0.01～10质量％，更优选为0.1～5质量％，进一步优选为0.5～3质量％。
第一溶解用溶液可以进一步含有Tris盐酸(Tris-HCl)和乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid、EDTA)。
核酸提取试剂盒可以进一步包含含有离液化合物的第二溶解用溶液。
离液化合物的具体例与从生物体试样中提取核酸的方法的步骤(i)中的离液化合物的具体例相同。
第二溶解用溶液中含有的离液化合物的浓度以生物体试样、第一溶解用溶液和第二溶解用溶液的混合液中的浓度计优选为0.01～5M，更优选为0.1～4.5M，进一步优选为1～4M。
第二溶解用溶液可以进一步含有Tris盐酸(Tris-HCl)。
核酸提取试剂盒可以进一步包含含有沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子的吸附液。
沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子的具体例和优选方式与从生物体试样中提取核酸的方法中的沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子的具体例和优选方式相同。
沸点超过75℃的烷醇的浓度以上述溶解液和吸附液的混合液中的浓度计优选为1～99质量％，更优选为10～90质量％，进一步优选为20～70质量％。
吸附液中含有的离液化合物的浓度以上述溶解液和吸附液的混合液中的浓度计优选为0.01～5M，更优选为0.1～4M，进一步优选为1～4.5M。
核酸提取试剂盒可以进一步包含从生物体试样中提取核酸的方法中的第一清洗液、第二清洗液和洗脱液。
本实施方式的核酸提取试剂盒能够适用于广范围的应用。根据本实施方式的核酸提取试剂盒，能够利用同一试剂盒从血液、咽拭子、鼻咽拭子、咯痰、脑脊液、尿、粪便、唾液等临床试样中含有的细菌、真菌、病毒等广范围的生物材料中提取核酸。此外，可以提供与一般的方法相比能够缩短提取所要的时间的、提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒。
实施例
以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明并不限定于实施例。
使用下述表1所示的细菌和病毒。从培养板上采集肺炎球菌(S.pneumoniae、也称为“S.P”)，悬浮于生理盐水中，通过浊度测定调节至McF#1的菌液浓度，将其用作样本(1)。从培养板上采集百日咳菌(B.pertussis、也称为“B.P”)，悬浮于生理盐水中，通过浊度测定调节至McF#1的菌液浓度，将其用作样本(2)。从培养板上采集酵母菌(S.cerevisiae、也称为“S.C.”)，悬浮于生理盐水中，通过600nm波长下的浊度测定调节至相当于OD＝6.0的菌液浓度，将其用作样本(3)。对A549细胞进行人II型腺病毒(Human Adenovirus 2、也称为“ADV”)的感染培养，将从培养上清回收的回收物用作样本(4)。对MDCK细胞进行甲型流感病毒(H3N2型、也称为“FluA”)的感染培养，将其培养上清用作样本(5)。
[表1]
使用株
肺炎球菌(S.pneumoniae、S.P) ATCC49619
百日咳菌(B.pertussis、B.P) 临床分离株
酵母菌(S.cerevisiae、S.C) BY611
人II型腺病毒(Human Adenovirus 2、ADV) ATCCVR-846
甲型流感病毒(H3N2型、FluA) 临床分离株
作为核酸提取试剂，制备以下所示组成的溶液。
第一溶解用溶液：233.3mM Tris-HCl(pH7.5)、23.3mM EDTA、4.6(w/w)％LDS
第二溶解用溶液：100mM Tris-HCl(pH7.5)、4.25M GuSCN
吸附液：47.3(w/w)％1-丙醇、2.5M GuSCN、二氧化硅磁性粒子
第一清洗液：41.0(w/w)％2-丙醇、1M NaCl、1.1(w/w)％SDS
第二清洗液：9.5(w/w)％PEG4000、1M NaCl
洗脱液：10mM Tris-HCl(pH7.5)
(实施例1：利用全自动核酸提取仪的核酸的提取)
通过下述步骤，使用核酸提取仪以全自动的方式从S.P、B.P、S.C、ADV、FluA中提取核酸。即，首先，在生理盐水200μL中添加S.P样本(1)3μL，得到生物体试样A。同样地在生理盐水200μL中分别添加B.P样本(2)2μL、S.C样本(3)3μL、ADV样本(4)3μL、FluA样本(5)1μL，得到生物体试样B～E。在微型管中将生物体试样A～E与第一溶解用溶液150μL混合后，搅拌7秒钟。然后，在110℃的加热块上加热1分钟。保持用加热块加热的状态，进一步添加第二溶解用溶液350μL，搅拌7秒钟后，在110℃的加热块上加热1分钟。保持用加热块加热的状态，进一步添加吸附液800μL，然后搅拌7秒钟。接着，在110℃的加热块上加热1分钟后，搅拌7秒钟，进一步在110℃的加热块上加热1分钟。将吸附有核酸的二氧化硅磁性粒子与溶液分离后，添加第一清洗液900μL并搅拌7秒钟。再次将吸附有核酸的二氧化硅磁性粒子与溶液分离后，添加第二清洗液900μL并搅拌7秒钟。收集二氧化硅磁性粒子，弃去上清后，添加洗脱液250μL并搅拌7秒钟。在110℃的加热块上静置2分钟后，搅拌7秒钟，将吸附有核酸的二氧化硅磁性粒子与溶液分离，得到核酸提取液I～V。需要说明的是，对液温进行监测，确认在溶解步骤、吸附步骤以及洗脱步骤中液温超过75℃。
以所得到的核酸提取液I～V中的核酸作为模板，进行PCR反应，对核酸进行定量。即，首先，使用下述表2所示的引物组和探针，在以下所示的试剂组成和反应条件下实施PCR。对于实施例1，进行3次同样的提取和定量。将平均值和标准误差的结果示于图1(a)～(e)。
[表2]
PCR反应液的组成和PCR反应的条件
核酸提取液I或IV
2×Premix Ex TaqTM(Takara) 12.5μL
10μM正向引物 0.5μL
10μM反向引物 0.5μL
10μM探针 0.5μL
无脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶的水(Sigma) 6μL
模板 5μL
热变性95℃10秒1次循环
扩增[95℃5秒60℃20秒]40次循环
核酸提取液II
2×Premix Ex TaqTM(Takara) 10μL
10μM正向引物 1.8μL
10μM反向引物 1.8μL
10μM探针 1.0μL
无脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶的水(Sigma) 0.4μL
模板 5μL
热变性95℃15秒1次循环
扩增[95℃3秒57℃30秒]40次循环
核酸提取液III
2×Premix Ex TaqTM(Takara) 12.5μL
50μM正向引物 0.25μL
50μM反向引物 0.25μL
10μM探针 0.5μL
无脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶的水(Sigma) 6.5μL
模板 5μL
热变性95℃10秒1次循环
扩增[95℃5秒60℃20秒]40次循环
核酸提取液V
2×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix(QIAGEN) 12.5μL
50μM正向引物 0.3μL
50μM反向引物 0.3μL
5μM探针 0.5μL
QuantiTect RT Mix(QIAGEN) 0.25μL
20IU/μL核糖核酸酶抑制剂 0.1μL
无脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶的水(Sigma) 6.05μL
模板 5μL
逆转录50℃30分钟1次循环
热变性95℃15分钟1次循环
扩增[94℃15秒56℃75秒]45次循环
(实施例2：利用全自动核酸提取仪的健康人来源试样中的肺炎球菌核酸的提取)
在健康人来源试样中掺混样本(1)并提取出核酸。首先，在咽拭子悬浮液200μL中添加样本(1)3μL，得到生物体试样F。同样地，分别在鼻咽拭子悬浮液200μL中添加样本(1)3μL、在血清200μL中添加样本(1)3μL、在血液(含EDTA-2K抗凝剂)200μL中添加样本(1)3μL、在血液(含柠檬酸钠抗凝剂)200μL中添加样本(1)3μL、在血液(含肝素抗凝剂)200μL中添加样本(1)3μL，得到生物体试样G～K。与实施例1同样地得到核酸提取液VI～X。
对于所得到的核酸提取液VI～X，与实施例1同样地进行PCR反应，对核酸进行定量。
需要说明的是，生物体试样H的制作中，使用利用纯化水将健康人来源的粉末血清复原而得到的试样作为健康人来源试样，实施3次提取和定量，得到N＝3的结果。生物体试样F、G、I、J、K的制作中，分别使用3位捐献者的健康人试样，实施1次提取和定量，作为N＝3的结果。图2(a)中以平均值和标准误差示出N＝3的结果。另外，作为比较对照，还示出实施例1中的提取液I的结果(生理盐水)。
(实施例3：利用全自动核酸提取仪的健康人来源试样中的腺病毒核酸的提取)
使用样本(4)代替样本(1)，除此以外，与实施例2同样地得到核酸提取液，进行PCR反应来定量。将结果示于图2(b)。另外，作为比较对照，还示出实施例1中的提取液IV的结果(生理盐水)。
(实施例4：洗脱温度与肺炎球菌基因组DNA的回收效率的关系)
在洗脱温度为室温(25℃)、50℃、80℃或110℃的设定环境中实施，除此以外，与实施例1同样地由样本(1)的生物体试样A得到提取液，进行PCR反应，对核酸进行定量。将结果示于图3(a)。
(实施例5：洗脱温度与甲型流感病毒基因组RNA的回收效率的关系)
在洗脱温度为室温(25℃)、50℃、80℃或110℃的设定环境中实施，除此以外，与实施例1同样地由样本(1)的生物体试样A得到提取液，进行PCR反应，对核酸进行定量。将结果示于图3(b)。
(参考例1)
使用QIAamp(注册商标)DNA小量提取试剂盒(QIAGEN公司制)，从含有S.P的生物体试样中提取核酸。即，使用样本(1)代替离心沉淀物来作为样品；并且使用10mM Tris-HCl(pH7.5)代替缓冲液AE或纯化水，除此以外，按照试剂盒的推荐操作规程来提取核酸。需要说明的是，试剂盒的推荐操作规程为QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook(第5版)中记载的、Appendix D：Protocol for Bacteria,Isolation of genomic DNA form Gram-positive bacteria(附录D：细菌操作规程-从革兰氏阳性细菌中分离基因组DNA)和Protocol：DNA purification from Tissues(操作规程：从组织中纯化DNA)。对于使用QIAamp(注册商标)DNA小量提取试剂盒(QIAGEN公司制)提取出的核酸，与实施例1同样地进行PCR反应，对核酸进行定量。将结果示于图1(a)。
(参考例2)
使用QIAamp(注册商标)DNA小量提取试剂盒(QIAGEN公司制)，从含有B.P的生物体试样中提取核酸。即，使用样本(2)代替离心沉淀物来作为样品；实施10分钟蛋白酶K处理；并且使用10mM Tris-HCl(pH7.5)代替缓冲液AE或纯化水，除此以外，按照试剂盒的推荐操作规程来提取核酸。需要说明的是，试剂盒的推荐操作规程为QIAamp DNA Mini and BloodMini Handbook(第5版)中记载的、Appendix D：Protocol for Bacteria,Isolation ofgenomic DNA from bacterial plate cultures(附录D：细菌操作规程-从细菌培养板培养物中分离基因组DNA)和Protocol：DNA purification from Tissues(操作规程：从组织中纯化DNA)。对于提取出的核酸，与参考例1同样地对核酸进行定量。将结果示于图1(b)。
(参考例3)
使用QIAamp(注册商标)DNA小量提取试剂盒(QIAGEN公司制)，从含有S.C的生物体试样中提取核酸。即，分别使用样本(3)代替离心沉淀物来作为样品；实施10分钟蛋白酶K处理；并且使用10mM Tris-HCl(pH7.5)代替缓冲液AE或纯化水，除此以外，按照试剂盒的推荐操作规程来提取核酸。需要说明的是，试剂盒的推荐操作规程为QIAamp DNA Mini andBlood Mini Handbook(第5版)中记载的、Appendix E：Protocol for Yeast(附录E：酵母操作规程)和Protocol：DNA purification from Tissues(操作规程：从组织中纯化DNA)。对于提取出的核酸，与参考例1同样地对核酸进行定量。将结果示于图1(c)。
(参考例4)
使用QIAamp(注册商标)MinElute病毒离心柱试剂盒(QIAGEN公司制)，从含有ADV的生物体试样中提取核酸。即，代替试剂盒的推荐操作规程中记载的血浆或血清，使用在生理盐水200μL中添加样本(4)3μL而得到的试样，除此以外，按照试剂盒的推荐操作规程来提取核酸。需要说明的是，试剂盒的推荐操作规程为QIAamp(注册商标)MinElute Virus SpinHandbook(2010年版)中记载的、Protocol：Purification of Viral Nucleic Acids fromPlasma or Serum(操作规程：从血浆或血清中纯化病毒核酸)。
对于使用QIAamp(注册商标)MinElute病毒离心柱试剂盒(QIAGEN公司制)提取出的核酸，与实施例1同样地进行PCR反应来定量。将结果示于图1(d)。
对于实施例1～3和参考例1～4，将提取所要的时间示于下述表3。
[表3]
序列表
<110> 荣研化学株式会社（Eiken Chemical CO., LTD）
<120> 提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒（METHOD FOR EXTRACTING NUCLEICACIDS AND KIT FOR THE SAME）
<130> FP17-0614-00
<150> JP 2016-193987
<151> 2016-09-30
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肺炎球菌正向引物（S.P forward primer）
<400> 1
acgcaatcta gcagatgaag c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肺炎球菌反向引物（S.P reverse primer）
<400> 2
tgtttggttg gttattcgtg c 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肺炎球菌探针（S.P probe）
<400> 3
tttgccgaaa acgcttgata caggg 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 百日咳菌正向引物（B.P forward primer）
<400> 4
atcaagcacc gctttaccc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 百日咳菌反向引物（B.P reverse primer）
<400> 5
ttgggagttc tggtaggtgt g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 百日咳菌探针（B.P probe）
<400> 6
aatggcaagg ccgaacgctt ca 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 酵母菌正向引物（S.C forward primer）
<400> 7
ggactctgga catgcaagat 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 酵母菌反向引物（S.C reverse primer）
<400> 8
atacccttct taacacctgg c 21
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 酵母菌探针（S.C probe）
<400> 9
cccttcagag cgttttctct aaattgatac 30
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺病毒正向引物（ADV forward primer）
<400> 10
gccaccgtgg ggtttctaaa ctt 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺病毒反向引物（ADV reverse primer）
<400> 11
gccgcagtgg tcttacatgc acatc 25
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺病毒探针（ADV probe）
<400> 12
tgcaccaggc cccggctcag gtactccga 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲型流感病毒正向引物（FluA forward primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> m is a or c
<400> 13
ccmaggtcga aacgtaygtt ctctctatc 29
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲型流感病毒反向引物（FluA reverse primer）
<400> 14
tgacagraty ggtcttgtct ttagccaytc ca 32
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲型流感病毒探针（FluA probe）
<400> 15
atytcggctt tgagggggcc tg 22

Claims (9)

1.一种从生物体试样中提取核酸的方法，
其具备：(i)将所述生物体试样、阴离子型表面活性剂和离液化合物混合而得到溶解液的步骤；
(ii)将所述溶解液、沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子混合而使所述核酸吸附在所述二氧化硅粒子上的步骤；
(iii)利用清洗液对吸附有所述核酸的所述二氧化硅粒子进行清洗的步骤；以及
(iv)利用洗脱液将吸附在所述二氧化硅粒子上的所述核酸洗脱的步骤，
至少步骤(i)和(ii)在超过75℃的温度下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(iv)在超过75℃的温度下进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述沸点超过75℃的烷醇为1-丙醇。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述阴离子型表面活性剂为十二烷基硫酸锂。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述离液化合物为胍盐。
6.一种核酸提取试剂盒，其包含：
含有阴离子型表面活性剂的第一溶解用溶液、
含有离液化合物的第二溶解用溶液、以及
含有沸点超过75℃的烷醇、离液化合物和二氧化硅粒子的吸附液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述沸点超过75℃的烷醇为1-丙醇。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其中，所述阴离子型表面活性剂为十二烷基硫酸锂。
9.如权利要求6～8中任一项所述的试剂盒，其中，所述离液化合物为胍盐。
CN201780058975.1A 2016-09-30 2017-09-19 提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒 Pending CN109790540A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-193987 2016-09-30
JP2016193987 2016-09-30
PCT/JP2017/033741 WO2018061877A1 (ja) 2016-09-30 2017-09-19 核酸を抽出する方法及びそれに用いるキット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109790540A true CN109790540A (zh) 2019-05-21

Family

ID=61759667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780058975.1A Pending CN109790540A (zh) 2016-09-30 2017-09-19 提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200032241A1 (zh)
EP (1) EP3521447B1 (zh)
JP (1) JPWO2018061877A1 (zh)
CN (1) CN109790540A (zh)
WO (1) WO2018061877A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958830A (zh) * 2022-06-27 2022-08-30 爱科睿特生物医疗科技(南京)有限公司 一种同时提取病原体dna和rna的试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1572796A (zh) * 2003-05-19 2005-02-02 株式会社日立高新技术 核酸回收方法及核酸回收装置
CN101115833A (zh) * 2005-02-11 2008-01-30 恰根有限公司 分离核酸的方法，该核酸在提高的温度下固定于基质上
CN102834518A (zh) * 2010-01-08 2012-12-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 改进的从磁性玻璃颗粒中的核酸回收
JP2014030364A (ja) * 2012-08-01 2014-02-20 Seiko Epson Corp Ｄｎａの抽出方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4196185B2 (ja) * 2002-07-29 2008-12-17 Ｊｓｒ株式会社 核酸分離方法
US20080268451A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-30 Bruce Seligmann Measurement of an insoluble analyte in a sample
EP2345719A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-20 Qiagen GmbH Method for isolating small RNA

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1572796A (zh) * 2003-05-19 2005-02-02 株式会社日立高新技术 核酸回收方法及核酸回收装置
CN101115833A (zh) * 2005-02-11 2008-01-30 恰根有限公司 分离核酸的方法，该核酸在提高的温度下固定于基质上
CN102834518A (zh) * 2010-01-08 2012-12-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 改进的从磁性玻璃颗粒中的核酸回收
JP2014030364A (ja) * 2012-08-01 2014-02-20 Seiko Epson Corp Ｄｎａの抽出方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018061877A1 (ja) 2019-06-24
US20200032241A1 (en) 2020-01-30
WO2018061877A1 (ja) 2018-04-05
EP3521447B1 (en) 2021-08-11
EP3521447A1 (en) 2019-08-07
EP3521447A4 (en) 2020-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6533468B2 (ja) 目的の核酸の特異的な単離方法
US20190100750A1 (en) Rapid Methods for the Extraction of Nucleic Acids from Biological Samples
WO2020063520A1 (zh) 一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用
JPH10501246A (ja) 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法
EP4065708B1 (en) Method for digesting nucleic acid in a sample
CN106561631A (zh) 一种唾液保存液及其制备方法和应用
JP6713007B2 (ja) 核酸の単離
WO2023114090A2 (en) Signal boost cascade assay
JP5714291B2 (ja) 抗酸菌ｄｎａの抽出精製法
CN109790540A (zh) 提取核酸的方法和该方法中使用的试剂盒
CN107653308B (zh) 一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及试剂盒
CN101979541A (zh) 一种快速共价闭合环状dna纯化试剂盒
CN104694532A (zh) 一种橡胶树白粉病菌rna的提取方法
US20040091875A1 (en) Method for isolating nucleic acids
JP5599013B2 (ja) 血液検体からの微生物核酸の抽出方法
CN101220390B (zh) 一种快速提取植物样本dna的方法
WO2004094634A1 (ja) 核酸の単離方法ならびに核酸単離用のキット及び装置
Oliveri et al. A simple extraction method useful to purify DNA from difficult biologic sources
TR201606310A2 (tr) Genomik dna izolasyon yöntemi ve kiti.
Ishtiaq et al. Optimization of DNA extraction protocol for leaf of narcotic plant Cannabis sativa L.
CN110042097A (zh) 一种从大豆原生质体高效分离纯化rna的方法
US20050282155A1 (en) Viral libraries from uncultivated viruses and polypeptides produced therefrom

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190521

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication