CN114369579B - 一株高效裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株高效裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体及其应用，属于生物工程技术领域。为了解决现有技术控制食品中的阪崎克罗诺杆菌存在的缺陷，本发明筛选到一株肌尾噬菌体(Myoviridae sp.)JK004，该噬菌体可有效去除阪崎克罗诺杆菌生物膜，同时可有效杀灭材料表面和婴儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌。此外，通过基因组测序和相关检测可知，噬菌体JK004基因组中不存在毒力因子和耐药基因，符合实际应用中的安全性要求，且具有较好的热稳定性、pH稳定性和盐稳定性，对于阪崎克罗诺杆菌具有较强的吸附性和特异性，为防治婴儿配方奶粉及加工设备和环境中阪崎克罗诺杆菌提供了新思路。

Description

一株高效裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及一株高效裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体及其应用，属于生物工程技术领域。
技术背景
阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种重要的食源性致病菌，能够引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血病等，死亡率高达40％至80％。克罗诺杆菌的高致死率及其从多种食品，特别是婴儿配方奶粉中分离出来的情况，表明该食源性致病菌的严重性。因此，建立一种安全有效的方法来控制包括婴儿配方乳粉在内的食品中的阪崎克罗诺杆菌尤为重要。
目前食品生产中对阪崎克罗诺杆菌的控制手段存在诸多弊端。由于阪崎克罗诺杆菌的出色耐热性，并且考虑到对食品的感官和营养方面的负面影响，尤其对于乳制品来说高温灭菌是不合适的，而传统热处理无法使其失活。化学消毒剂等非热处理方法可能导致有毒有害试剂的残留，不适宜在婴儿配方乳粉中应用。研究表明辐照灭菌具有安全性，但消费者接受度低；而超声波作为一种独立使用的方法杀菌能力较弱。因此，需要研究安全有效的阪崎克罗诺杆菌防治方法。
噬菌体是一种以细菌细胞为特异宿主的病毒。它可以通过尾部细胞器将其遗传物质注入宿主细菌并裂解它们。由于噬菌体的高度特异性，它只影响目标细菌或相同种类的相似目标菌株。此外，噬菌体对动植物是无害的，对人类几乎没有有害影响。因此，找到一株能够裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体对于控制食品阪崎克罗诺杆菌污染具有重要意义。
发明内容
本发明为了解决现有技术控制食品中的阪崎克罗诺杆菌存在的缺陷，提供了一株肌尾噬菌体(Myoviridae sp.)JK004，所述噬菌体已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年9月16日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号为CGMCC No.23092。
本发明还提供了噬菌体JK004在裂解阪崎克罗诺杆菌中的应用。
进一步地限定，所述应用为裂解食品生产环境和设备中的阪崎克罗诺杆菌。
本发明还提供了噬菌体JK004在去除阪崎克罗诺杆菌生物膜中的应用。
进一步地限定，所述应用为去除食品生产环境和设备中的阪崎克罗诺杆菌生物膜。
本发明还提供了一种裂解阪崎克罗诺杆菌或去除阪崎克罗诺杆菌生物膜的方法，该方法为使用效价为1×108～1×109pfu/mL的噬菌体；所述噬菌体为肌尾噬菌体JK004，保藏编号为 CGMCC No.23092。
本发明还提供了一种阪崎克罗诺杆菌抑菌剂，所述抑菌剂的有效成分为噬菌体JK004。
进一步地限定，所述噬菌体JK004的效价为1×108～1×109pfu/mL。
进一步地限定，所述应用为裂解聚乙烯、橡胶或不锈钢材料表面的阪崎克罗诺杆菌或去除聚乙烯、橡胶或不锈钢材料表面的阪崎克罗诺杆菌生物膜。
进一步地限定，所述应用为裂解婴儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌。
本发明的有益效果：
附图说明：
图1为噬菌体JK004噬菌斑图；
图2为噬菌体JK004透射电镜图；
图3为噬菌体JK004的热稳定性检测结果图；
图4为噬菌体JK004的pH稳定性检测结果图；
图5为噬菌体JK004的盐稳定性检测结果图；
图6为噬菌体JK004去除生物膜效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：噬菌体JK004的获得及特征分析
(1)宿主菌的活化与保藏
取出在-80℃条件下保存的阪崎克罗诺杆菌冻存管，液态培养后用接种环蘸取阪崎克罗诺杆菌菌液进行三区划线，挑取单菌落至LB液体培养基培养，即获得活化的阪崎克罗诺杆菌菌液。阪崎克罗诺杆菌菌液可与80％的甘油按照3:1的比例装于冻存管中并在-20℃条件下保存。
(2)噬菌体JK004的分离与纯化
噬菌体筛选自面粉工厂中的成品与半成品样品，将固态粉状的样品与无菌双蒸水充分振荡过夜后，4℃条件下，5000rpm离心5min，取上清液10mL加入10mL液体LB培养基中培养，再加入200μL培养至对数早期的C.sakazakii ATCC 29544，37℃振荡培养过夜，5000rpm离心15min，上清液通过0.45μm滤膜过滤除菌后，倒双面平板分离纯化噬菌体，并重复纯化三次以上，并将噬菌体原液于4℃条件下保存。
(3)噬菌体JK004全基因组测序
采用二代Illumina MiSeq测序平台对噬菌体基因组进行测序及分析。序列组装完成后，对编码基因、重复序列等基因组组分进行预测，获取目标基因组的组成情况。最终得到噬菌体JK004为双链DNA，基因组全长93825bp，CG含量32.96％。
噬菌体JK004基因组共预测到了125个编码基因，编码基因长度为84840bp，共占全基因组的90.42％。
对噬菌体JK004进行基因组分析，未检测到已知的毒力因子和耐药性基因，提示JK004 在实际应用中是安全的。
(4)噬菌体JK004的形态学观察
①噬菌斑形态观察
在双层琼脂平板上可以观察到大小相对一致，圆形，边缘清晰，无晕环，直径大小约为 2.2mm的噬菌斑(如图1)。
②噬菌体透射电镜下形态观察
采用磷钨酸负染法，将铜网置于噬菌体滴液中，滤纸吸去多余的液体，滴加磷钨酸(PTA) 水溶液，染色后，自然干燥，即可在透射电镜下观察噬菌体的形态。透射电镜观察到噬菌体头部呈现规则多面体，推测为正二十面体，直径约90nm，具有收缩性尾部，长约230nm(如图2)，结合全基因组测序分析判断噬菌体JK004为有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科。
实施例2：噬菌体JK004在裂解阪崎克罗诺杆菌中的应用
(1)噬菌体JK004宿主范围测定
分别取100μL不同菌株的菌悬液加入到LB琼脂培养基中，混匀倒至已形成培养基的平板内，制备成仅含有菌层的双层平板，并将10μL的效价为109pfu/mL的噬菌体JK004点滴至双层平板上，37℃倒置培养8h，观察是否有噬菌斑出现，实验结果见表1。
表1噬菌体JK004裂解谱
Figure RE-GDA0003422516240000031
注：“+”表示出现噬菌斑；“-”表示未出现噬菌斑。
上述结果表明噬菌体JK004对C.sakazakii ATCC 29544具有裂解特异性。
(2)噬菌体JK004吸附能力测定
取180μL C.sakazakii ATCC 29544菌液与20μL噬菌体原液以MOI＝0.001混合并在37℃水浴中孵育10min后离心，并用双面平板法计算上清中未吸附的噬菌体数量，噬菌体吸附率＝(原始噬菌体数量-未吸附噬菌体数量)/原始噬菌体数量。通过检测可知噬菌体JK004 吸附率达95％。
(3)噬菌体JK004最佳感染复数的测定
按照感染复数分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例，将噬菌体和C.sakazakii ATCC 29544菌液加入到20mL LB液体培养基中，37℃振荡培养6h，离心去除宿主菌，测定上清中的噬菌体效价，产生最高效价的感染复数即为最佳感染复数，结果见表2。
表2噬菌体最佳感染复数测定结果
Figure RE-GDA0003422516240000041
结果可见噬菌体最佳感染复数为0.01，效价最高为8.5×107。
(4)噬菌体JK004的热稳定性
将含有900μL的LB液体培养基于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的水浴中预热60min，待温度稳定后，加入100μL噬菌体原液，经过60min培养后，离心吸取上清，用双层平板法测定上清液中噬菌体效价。
噬菌体JK004的热稳定性检测结果如图3所示，可见在60℃条件下作用1h，噬菌体效价仍保持在107pfu/mL，70℃条件下作用1h，效价有所下降，约为104pfu/mL，80℃条件下作用1h，噬菌体完全失活。
(5)噬菌体JK004的pH稳定性
取900μL pH值3-10的LB液体培养基于37℃水浴至温度稳定，加入100μL噬菌体原液，经过60min培养后，离心吸取上清，用双层平板法测定上清液中噬菌体效价。
噬菌体JK004的pH稳定性检测结果如图4所示，可见pH值4-9时噬菌体效价相对稳定，pH为3和10时噬菌体效价明显下降。
(6)噬菌体JK004的盐稳定性
将900μL不同氯化钠浓度(0％、2％、4％、6％、8％、10％)的LB液体培养基与100μL噬菌体原液混合均匀，在37℃条件下孵育24h、48h、72h后，离心吸取上清，用双层平板法测定上清液中噬菌体效价。
噬菌体JK004的盐稳定性检测结果如图5所示，在0-2％盐浓度时，噬菌体效价基本没有变化。当处于2-10％NaCl质量浓度时，随着盐浓度的提升和作用时间的延长噬菌体的效价随之降低。当处于10％NaCl质量浓度，并作用72h后噬菌体效价约为106pfu/mL。说明噬菌体JK004在高盐环境下仍保持较高的活性。
实施例3：噬菌体JK004在去除阪崎克罗诺杆菌生物膜中的应用
无菌96孔板中每孔加入150μL LB液体培养基与50μL C.sakazakii ATCC 29544菌液，添加葡萄糖至终浓度为1％并密封于湿盒中，在37℃条件下培养48h，弃去多余液体，并用无菌生理盐水清洗两遍去除游离菌体，作为已形成成熟生物膜的96孔板。
在已形成成熟生物膜的96孔板中每孔加入200μL噬菌体(109pfu/mL)，添加葡萄糖至终浓度为1％并密封于湿盒中。在37℃条件下分别于12h、24h、36h和48h后弃去多余液体，并用无菌生理盐水清洗两遍，干燥后，利用250μL 0.1％的结晶紫溶液染色10min后吸取多余液体，无菌生理盐水清洗两遍，置于酶标仪中检测其OD590数值。
噬菌体JK004去除生物膜效果如图6所示，由该图可知，作用12h时后，生物膜抑制率达62％；作用36h后，生物膜抑制率达80％；作用48h后，生物膜抑制率达87％。上述结果说明噬菌体JK004可有效清除已成熟的阪崎克罗诺杆菌生物膜，并进一步抑制生物膜的生长，显示出良好的生物膜清除效果。
实施例4：噬菌体JK004在抑制材料表面的阪崎克罗诺杆菌中的应用
将不锈钢，聚乙烯材料和橡胶切割成50mm×50mm的正方形，材料板经无水乙醇浸泡 30min后用无菌纯净水清洗，自然干燥。将C.sakazakii ATCC 29544菌液，离心弃去上清，并用PBS溶液将沉淀进行重悬，使其细菌浓度调整为106，107，108cfu/mL。分别取100μL不同的浓度宿主菌在不同材质材料板上均匀涂布，自然干燥后滴加100μL浓度为109pfu/mL的噬菌体溶液并均匀涂布。自然干燥后，每隔一小时，用无菌棉均匀刮取板块上的菌体至10mL的无菌生理盐水内，浸泡振荡后离心去除上清液(包含游离噬菌体)，利用平板计数法测量菌体数目。
具体结果如表3所示，宿主菌数目以log-cfu/cm2计算，处理6h后，在聚乙烯表面细菌的附着数量为2.36log，相较于对照组降低了3.33log；橡胶表面细菌的附着数量为1.33log，相较于对照组降低了3.32log；不锈钢表面细菌的附着数量为1.62log，相较于对照组降低了 2.79log。实验组和对照组之间均具有显著性差异，说明噬菌体JK004能够有效的杀灭附着在聚乙烯、橡胶和不锈钢材料上阪崎克罗诺杆菌。
表3噬菌体对聚乙烯、橡胶和不锈钢材料表面阪崎克罗诺杆菌抑菌效果
Figure RE-GDA0003422516240000061
不同的字母表示对照组和实验组之间有显著性差异(P＜0.05)
实施例5：噬菌体JK004在抑制婴儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌中的应用
为了验证噬菌体JK004的普遍适用性，选择四种市面常见品牌婴儿配方乳粉进行试验。先将婴儿配方乳粉与无菌水按照质量体积比1:10复水。吸取5mL 109pfu/mL纯化后的高效价噬菌体(对照组用无菌生理盐水代替)和1mL的C.sakazakii ATCC 29544菌悬液(105cfu/mL)加入到94mL复水的婴幼儿配方乳粉中，充分混匀。将经过以上方式处理后的试验样品静置于4℃和37℃恒温培养箱中，并分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16h取出试验样品，利用平板计数法测量菌体数目。
具体结果如表4所示，4℃条件下作用16h，品牌1中宿主菌数量约为2.4log，相比于对照组下降了1.01log；品牌2中宿主菌数量约为2.46log，相比于对照组下降了1.2log；品牌3中宿主菌数量约为2.57log，相比于对照组下降了0.87log；品牌4中宿主菌数量约为2.24log，相比于对照组下降了1.17log。37℃条件下作用16h，品牌1中相比于对照组下降了8.98log；品牌2中宿主菌数量相比于对照组下降了9.45log；品牌3中宿主菌数量相比于对照组下降了9.03log；品牌4中宿主菌数量相比于对照组下降了9.5log。实验组和对照组之间均具有显著性差异，说明噬菌体JK004能够有效的杀灭婴儿配方乳粉中的阪崎克罗诺杆菌。
表4噬菌体对婴儿配方乳粉的抑菌效果
Figure RE-GDA0003422516240000071
Figure RE-GDA0003422516240000081

Claims (10)

1.一株肌尾噬菌体(Myoviridae sp.)JK004，其特征在于，所述噬菌体的保藏编号为CGMCCNo.23092。
2.权利要求1所述噬菌体JK004在裂解阪崎克罗诺杆菌中的应用，其特征在于，所述阪崎克罗诺杆菌为（C.sakazakii ）ATCC 29544。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为裂解食品生产环境和设备中的阪崎克罗诺杆菌。
4.权利要求1所述噬菌体JK004在去除阪崎克罗诺杆菌生物膜中的应用，其特征在于，所述阪崎克罗诺杆菌为（C.sakazakii） ATCC 29544。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为去除食品生产环境和设备中的阪崎克罗诺杆菌生物膜。
6.一种裂解阪崎克罗诺杆菌或去除阪崎克罗诺杆菌生物膜的方法，其特征在于，使用效价为1×108～1×109pfu/mL的噬菌体；所述噬菌体为肌尾噬菌体JK004，保藏编号为CGMCCNo.23092；所述阪崎克罗诺杆菌为（C.sakazakii） ATCC 29544。
7.一种阪崎克罗诺杆菌抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂的有效成分为权利要求1所述的噬菌体JK004。
8.根据权利要求7所述的抑菌剂，其特征在于，所述噬菌体JK004的效价为1×108～1×109pfu/mL。
9.权利要求7所述抑菌剂的应用，其特征在于，所述应用为裂解聚乙烯、橡胶或不锈钢材料表面的阪崎克罗诺杆菌或去除聚乙烯、橡胶或不锈钢材料表面的阪崎克罗诺杆菌生物膜；所述阪崎克罗诺杆菌为（C.sakazakii） ATCC 29544。
10.权利要求7所述抑菌剂的应用，其特征在于，所述应用为裂解婴儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌；所述阪崎克罗诺杆菌为（C.sakazakii ）ATCC 29544。
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