CN110205306B - 蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂，涉及食品安全技术领域。本发明提供的蜡样芽胞杆菌噬菌体为蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10。所述噬菌体组合物包括所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10。所述抑菌制剂包括所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10中的一种或多种。本发明旨在提供特异性强的噬菌体及噬菌体组合物，具有独特的专一裂解活性，可以有效抑制食品中绝大多数高毒力呕吐型和部分腹泻型蜡样芽胞杆菌的生长。

Description

蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂

技术领域

本发明涉及食品安全技术领域，特别涉及一种蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂。

背景技术

蜡样芽胞杆菌是一种广泛存在于环境中的条件致病微生物，主要是通过污染一些富含淀粉的食品(特别是室温条件下保存的米饭、面制品和豆制品等)而引起食物中毒。我国居民的饮食中米面等植物性高淀粉食物是主食，这些食品容易在种植和加工中污染蜡样芽胞杆菌。芽胞是高度耐热的休眠体能耐受蒸煮烫等普通食品加工，在后续保存中大量繁殖。蜡样芽胞杆菌菌株多样性复杂，既有普通无毒环境株，也有动物益生菌株，但最受人们关注的是食源性致病菌株。这些致病型蜡样芽胞杆菌通过产生不同的毒素引起呕吐或腹泻等症状，其中呕吐型毒素和腹泻型毒素(肠毒素)是主要的致病因素。高毒力呕吐型蜡样芽胞杆菌虽然仅占蜡样芽胞杆菌菌株的1％，但是其呕吐毒素不仅毒力强且高度耐热和强酸，后期各种食品加工手段(例如重新加热、炒制、复蒸煮、油炸等)均无法使之失活，常常导致因炒饭、复蒸煮米饭和粥引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒，其发病急且毒性强，严重时可以致死，所以呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒对我国食品安全危害性很高。部分菌株还会因为芽胞保护进入人体肠道，导致感染，并在肠道内产毒(多达3种以上的肠毒素)，从而引发腹泻腹痛。

噬菌体可特异性裂解病原微生物，目前被作为一种新型抗菌物质而广泛使用。但细菌仍有一定几率通过形成突变株而产生对噬菌体的抗性，而且现有的噬菌体的宿主谱中包括的呕吐型蜡样芽胞杆菌有限，且会裂解部分亲缘较近的无毒或者低毒的芽胞杆菌。因此，亟需发掘出更多的噬菌体以构建具有丰富多样性的蜡样芽胞杆菌噬菌体库以降低细菌产生噬菌体抗性的概率。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂，旨在提供特异性强的噬菌体及噬菌体组合物，对高毒力蜡样芽胞杆菌具有广泛的裂解活性，可以有效抑制食品中高毒力呕吐型和腹泻型蜡样芽胞杆菌的生长。

为实现上述目的，本发明提出一种蜡样芽胞杆菌噬菌体，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为蜡样芽胞杆菌噬菌体(Bacillus cereus bacteriphage)C1E1，其保藏编号为CCTCC NO:M2019230，保藏时间为2019年4月3日。

本发明还提出了一种蜡样芽胞杆菌噬菌体，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为蜡样芽胞杆菌噬菌体(Bacillus cereus bacteriphage)HA3A10，其保藏编号为CCTCC NO:M2019229，保藏时间为2019年4月3日。

本发明还提出一种噬菌体组合物，所述噬菌体组合物包括蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10。

可选地，所述噬菌体组合物中，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的个数比为1：(0.8～1.2)。

本发明还提出了一种抑菌制剂，所述抑菌制剂包括所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10中的一种或多种。

可选地，所述抑菌制剂的剂型为片剂、颗粒剂、粉剂、冻干剂或液体制剂。

本发明技术方案中，通过在中国武汉武昌区东湖楚风园采集的湖水中分离出属肌尾噬菌体科的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1，在中国武汉汉口江滩采集的江水中分离出属长尾噬菌体科的蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10，两种噬菌体天然安全，具有广泛的裂解高毒力蜡样芽胞杆菌的活性，可以有效降解该类细菌产生的生物膜，快速、有效地抑制食品中高毒力呕吐型和腹泻型蜡样芽胞杆菌的生长，不易使蜡样芽胞杆菌产生抗性；且具有特异性强的优点，不仅可以特异性裂解对我国食品安全影响最大的高毒力呕吐型菌株以及部分腹泻型蜡样芽胞杆菌，而且对低毒或无毒的蜡样芽胞杆菌裂解能力低，对与蜡样芽胞杆菌近源的其它芽胞菌株则无裂解能力，对食品、人体、环境中正常微生物菌群不会产生太大影响，不会破坏食用者的肠道菌群平衡。而且，两种噬菌体具有协同作用，包含两种噬菌体的组合物裂解范围更大、抑菌效果更强，让细菌不容易产生抗性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提出的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1的电镜图；

图2为本发明提出的蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的电镜图；

图3为实施例3中各噬菌体液对于大米分离株5-1的抑菌效果变化趋势图；

图4为实施例3中各噬菌体液对于米粉导致的呕吐型食物中毒案例分离的呕吐型毒株WH0805的抑菌效果时间趋势图；

图5为实施例3中各噬菌体液对于豆豉导致的呕吐型食物中毒案例分离的呕吐型毒株KM007的抑菌效果时间趋势图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

蜡样芽胞杆菌通过产生不同的毒素引起呕吐或腹泻等症状，其中呕吐型毒素和腹泻型毒素(肠毒素)是主要的致病因素。部分蜡样芽胞杆菌菌株还具有产生生物膜的能力，生物膜态的蜡样芽胞杆菌其耐受高温和消毒杀菌剂的能力更强，常规的CIP(原位清洗)等清洁手段无法彻底消除生物膜，其危害更严重，能导致食品加工环境的持续性污染。噬菌体可特异性裂解病原微生物，目前被作为一种新型抗菌物质而广泛使用。但细菌仍有一定几率通过形成突变株而产生对噬菌体的抗性，而且现有的噬菌体的宿主谱中包括的呕吐型蜡样芽胞杆菌有限，且会裂解部分亲缘较近的无毒或者低毒的芽胞杆菌，容易破坏肠道菌群和环境中的微生态平衡。因此，亟需发掘出更多的噬菌体以构建裂解蜡样芽胞杆菌范围多样性更丰富的噬菌体库以降低细菌产生噬菌体抗性的概率。

鉴于此，本发明提出了一种蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1。

所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1由发明人从在中国武汉武昌区东湖楚风园采集到的湖水中分离得到，目前已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为蜡样芽胞杆菌噬菌体(Bacillus cereus bacteriphage)C1E1，其保藏编号为CCTCC NO:M2019230，保藏时间为2019年4月3日。所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科，如图1所示，其电镜观察结果显示该噬菌体的头部长度为89.80nm、横径为92.78nm；尾部长度约为220.69nm，尾部底板直径为28.91nm。通过采用双层琼脂平板法对该噬菌体的裂解谱加以测试，测得，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1可裂解10种呕吐型蜡样芽胞杆菌标准株和分离株(NC7401、5958b、IS195、5975C、5-1、15-1、24-1、62-4、KM007以及WH0805)和一种腹泻型蜡样芽胞杆菌标准株(F3502/73R)，且对蕈状芽胞杆菌、韦氏芽胞杆菌等蜡样芽胞杆菌的近源芽胞杆菌不具有裂解性，具有天然安全、特异性强、裂解范围广泛的优点。所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1可以快速、有效地抑制食品中蜡样芽胞杆菌的生长，且可以与宿主共进化从而不易使蜡样芽胞杆菌产生抗性，且不会影响人体、食品、环境中其他正常微生物菌群。而且，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1来源自中国武汉武昌区东湖楚风园采集到的湖水，生产成本较低，利于工业化生产。此外，在对所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1的抑菌性能测试的过程中，发明人还发现该噬菌体对米粥食品基质表现出了较强的抑菌效果。

此外，本发明还提出了一种蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10。

所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10由发明人从在中国武汉汉口江滩处的江水中分离得到，目前已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为蜡样芽胞杆菌噬菌体(Bacillus cereus bacteriphage)HA3A10，其保藏编号为CCTCCNO:M2019229，保藏时间为2019年4月3日。所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3属于有尾噬菌体目、长尾噬菌体科，如图2所示，其电镜观察结果显示该噬菌体的头部长度为66.42nm、横径为58.72nm；尾部长度约为251.13nm。通过采用双层琼脂平板法对该噬菌体的裂解谱加以测试，测得，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10可裂解10种呕吐型蜡样芽胞杆菌标准株和分离株(NC7401、5958b、IS195、5975C、5-1、15-1、24-1、62-4、KM007以及WH0805)和两种腹泻型蜡样芽胞杆菌标准株和分离株(F3502/73R以及2-3)，且对蕈状芽胞杆菌、韦氏芽胞杆菌等蜡样芽胞杆菌的近源芽胞杆菌不具有裂解性，具有天然安全、特异性强、裂解范围主要是高毒力呕吐型和腹泻型蜡样芽胞杆菌的优点。所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10可以快速、有效地抑制食品中蜡样芽胞杆菌的生长，且可以与宿主共进化从而不易使蜡样芽胞杆菌产生抗性，且不会影响人体、食品、环境中其他正常微生物菌群。而且，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10来源自中国武汉汉口江滩处的江水，生产成本较低，利于工业化生产。此外，在对所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的抑菌性能测试的过程中，发明人还发现该噬菌体对米粥食品基质表现出了较强的抑菌效果。

本发明还提出了一种噬菌体组合物，所述噬菌体组合物包括蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10。

蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10天然安全，具有广泛的裂解活性，可以快速、有效地抑制食品中蜡样芽胞杆菌的生长，不易使蜡样芽胞杆菌产生抗性；且具有特异性强的优点，不会损害食品系统中正常微生物菌群，也不会破坏食用者的肠道菌群平衡。而且，由于这两种噬菌体在感染途径上有相似性，当将两种噬菌体组合使用时，两种噬菌体之间可能会促进感染效率，发挥协同作用，同时也可以进一步扩大裂解谱，比单一噬菌体具有更好的抑菌效果。因此，本实施例中，噬菌体组合物包括蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10，应当理解，除蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10外，所述噬菌体组合物还可以包括其他蜡样芽胞杆菌噬菌体，所述噬菌体组合物中各噬菌体之间的混合比例可以根据实际情况进行调整。

本实施例中，基于抑菌效率最优化的考虑，所述噬菌体组合物中，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的个数比优选为1：(0.8～1.2)，例如，可以将个数比为1：1、1:0.8、1:0.9、1：1.1、1:1.2等比例关系的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10组合制成噬菌体组合物。

本发明还提出了一种抑菌制剂，所述抑菌制剂包括所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10中的一种或多种。即所述抑菌制剂可以以蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1为活性组分，由蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1、其他活性组分和辅料共同组成；也可以以蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10为活性组分，由蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10、其他活性组分和辅料共同组成；还可以以蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10为活性组分，由蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1、蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10、其他活性组分和辅料共同组成。所述抑菌制剂可以快速、有效地抑制蜡样芽胞杆菌的生长。

作为制剂，所述抑菌制剂可以根据常规制剂加工方法被加工成多种剂型，其具体剂型可根据实际使用环境进行调整。本实施例中，所述抑菌制剂的剂型可以为片剂、颗粒剂、粉剂、冻干剂或液体制剂。其中，液体制剂可以是混合菌剂，也可以是以混合菌剂为活性成分，添加有其他添加剂的溶液、乳剂或悬浮液等。

本发明还提出了蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1或蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10在制备食物抑菌剂中的应用。

由于蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1可裂解10种呕吐型蜡样芽胞杆菌(NC7401、5958b、IS195、5975C、5-1、15-1、24-1、62-4、KM007以及WH0805)和一种腹泻型蜡样芽胞杆菌(F3502/73R)，蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10可裂解10种呕吐型蜡样芽胞杆菌(NC7401、5958b、IS195、5975C、5-1、15-1、24-1、62-4、KM007以及WH0805)和两种腹泻型蜡样芽胞杆菌(F3502/73R以及2-3)，二者都具有天然安全、特异性强、裂解范围针对高毒力呕吐型和腹泻型蜡样芽胞杆菌的优点，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1可以快速、有效地抑制食品中蜡样芽胞杆菌的生长，且可以与宿主共进化从而不易使蜡样芽胞杆菌产生抗性，因此，可以将蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1或蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10作为活性组分，和其他辅料一起制成食物防腐抑菌剂，以避免蜡样芽胞杆菌产生毒素导致食用者呕吐或腹泻。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1的分离和制备

以呕吐型蜡样芽胞杆菌EFR-1作为敏感指示菌，所述蜡样芽胞杆菌EFR-1为冰淇淋分离株，并于-40℃甘油管冻存。经平板划线活化后，制成菌悬液。

步骤S10、噬菌体的分离：从中国武汉武昌区东湖楚风园湖水中采集湖水作为样品。将样品与等体积的2×LB液体培养基混合均匀，30℃摇床培养12h，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，得到的样品液置于4℃保存。取200μL所述敏感指示菌的菌悬液于10mL无菌离心管中，倒入4mL 47℃恒温的LB半固体培养基，迅速摇晃混合均匀后，倒入固体培养基平板上，待上层LB半固体培养基凝固后，吸取10μL所述样品液点滴在平板上，待所述样品液被吸收后，放入培养箱中培养12h。记录出现噬菌圈或噬菌斑的平板，并刮取存在噬菌体的部分上层半固体培养基于适量的SM buffer中，振荡混匀后，于4℃、11000r/min条件下离心15min，留取上清液，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，得含有蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1的噬菌体液，并置于4℃保存。

步骤S20、噬菌体的纯化：吸取100μL所述噬菌体液与200μL所述敏感指示菌的菌悬液置于无菌的10mL离心管中混合均匀后30℃孵育30min后，倒入4mL 47℃半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层半固体LB培养基凝固后放入30℃培养箱中培养12h。在上述出现单独且清晰透亮的噬菌体平板上，用无菌牙签穿刺挑取单一噬菌斑，置于1mL SM buffer中，振荡混匀后，于4℃、11000r/min条件下离心15min，留取上清液，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，所得经过第一次纯化的噬菌体液置于4℃保存。连续重复4～5次单噬菌斑穿刺进行噬菌体的纯化，直至平板中每个噬菌斑大小均一，得纯化的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1菌液。

步骤S30、噬菌体的增殖：将所述纯化的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1用双层平板法进行增殖培养。取纯化的100μl噬菌体C1E1菌液与200μl敏感菌指示菌的菌悬液置于无菌的10ml离心管中，混合均匀后30℃孵育30min，倒入4ml 47℃半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层半固体LB培养基凝固后放入30℃培养箱中培养12h。吸取3ml SM buffer于双层平板中，将平板内的SM buffer和上层半固体LB培养基刮取到无菌离心管内，振荡混匀后，于4℃、11000r/min条件下离心15min，留取上清液，无菌滤器过滤，得噬菌体液，于4℃保存。连续重复3次，直至上层半固体LB培养基中未长出菌落，得增殖培养的噬菌体C1E1菌液。

步骤S40、效价测定：用SM buffer将所述增殖培养的噬菌体C1E1菌液进行10倍梯度稀释。取200μL敏感菌指示菌的菌悬液与100μL噬菌体稀释液置于无菌的10ml离心管中，混合均匀后30℃孵育30min，倒入4ml 47℃半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层半固体LB培养基凝固后放入培养箱中培养12h，观察适宜稀释倍数的双层平板中噬菌斑数目，并按下述公式计算噬菌体效价，测得效价为1.11×10⁹PFU/ml。。

公式：噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑数目×稀释倍数×10

实施例2蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的分离和制备

以蜡样芽胞杆菌ATCC10987作为敏感指示菌，所述蜡样芽胞杆菌ATCC10987来源于美国典型菌种保藏中心，-40℃甘油管冻存。经平板划线活化后，制成菌悬液。

步骤S100、噬菌体的分离：从中国武汉汉口区江滩处的长江江水中采集江水作为样品。将样品与等体积的2×LB液体培养基混合均匀，30℃摇床培养12h，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，得到的样品液置于4℃保存。取200μL所述敏感指示菌的菌悬液于10mL无菌离心管中，倒入4mL 47℃恒温的LB半固体培养基，迅速摇晃混合均匀后，倒入固体培养基平板上，待上层LB半固体培养基凝固后，吸取10μL所述样品液点滴在平板上，待所述样品液被吸收后，放入培养箱中培养12h。记录出现噬菌圈或噬菌斑的平板，并刮取存在噬菌体的部分上层半固体培养基于适量的SM buffer中，振荡混匀后，于4℃、11000r/min条件下离心15min，留取上清液，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，得含有蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的噬菌体液，并置于4℃保存。

步骤S200、噬菌体的纯化：吸取100μL所述噬菌体液与200μL所述敏感指示菌的菌悬液置于无菌的10mL离心管中混合均匀后30℃孵育30min后，倒入4mL 47℃半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层半固体LB培养基凝固后放入30℃培养箱中培养12h。在上述出现单独且清晰透亮的噬菌体平板上，用无菌牙签穿刺挑取单一噬菌斑，置于1mL SM buffer中，振荡混匀后，于4℃、11000r/min条件下离心15min，留取上清液，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，所得经过第一次纯化的噬菌体液置于4℃保存。连续重复4～5次单噬菌斑穿刺进行噬菌体的纯化，直至平板中每个噬菌斑大小均一，得纯化的蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10菌液。

步骤S300、噬菌体的增殖：将所述纯化的蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10用双层平板法进行增殖培养。取纯化的100μl噬菌体HA3A10菌液与200μl敏感菌指示菌的菌悬液置于无菌的10ml离心管中，混合均匀后30℃孵育30min，倒入4ml 47℃半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层半固体LB培养基凝固后放入30℃培养箱中培养12h。吸取3ml SM buffer于双层平板中，将平板内的SM buffer和上层半固体LB培养基刮取到无菌离心管内，振荡混匀后，于4℃、11000r/min条件下离心15min，留取上清液，无菌滤器过滤，得噬菌体液，于4℃保存。连续重复3次，直至上层半固体LB培养基中未长出菌落，得增殖培养的噬菌体HA3A10菌液。

步骤S400、效价测定：用SM buffer将所述增殖培养的噬菌体HA3A10菌液进行10倍梯度稀释。取200μL敏感菌指示菌的菌悬液与100μL噬菌体稀释液置于无菌的10ml离心管中，混合均匀后30℃孵育30min，倒入4ml 47℃半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层半固体LB培养基凝固后放入培养箱中培养12h，观察适宜稀释倍数的双层平板中噬菌斑数目，并按下述公式计算噬菌体效价，测得效价为1.08×10⁹PFU/ml。

公式：噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑数目×稀释倍数×10

实施例3裂解谱的测定

选择如下表1所示的21株食源性细菌(14株蜡样芽胞杆菌、1株蕈状芽胞杆菌、2株韦氏芽胞杆菌、1株金黄色葡萄球菌、1株肠炎沙门氏菌、1株出血性大肠埃希氏菌和1株阪崎肠杆菌)来做蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3的裂解谱分析，具体操作如下：

分别培养宿主菌菌株至宿主菌液OD₆₀₀＝0.8～1。取200μL所述宿主菌液与4mL47℃恒温的0.4％半固体LB培养基混合，倒双层平板。待上层平板凝固后，吸取10μl样品液滴在平板上，静置15min，样品液被平板吸收后，放入30℃培养箱中培养12h。取生理盐水做对照。观察是否有噬菌斑，并记录裂解情况在表2中。表2中“++”表示清晰噬菌斑；“+”表示模糊噬菌斑；“-”表示无噬菌斑。

表1宿主菌菌株信息表

表2噬菌体C1E1和HA3A10裂解谱

由表2可以看出，噬菌体C1E1和HA3A10均可裂解10株呕吐型蜡样芽胞杆菌，裂解率为100％；此外，噬菌体C1E1还可裂解1株产肠毒素的腹泻型蜡样芽胞杆菌，噬菌体HA3A10还可裂解2株腹泻型蜡样芽胞杆菌。在更为广泛的杀菌谱测试中，两者对绝大多数高毒力呕吐型蜡样芽胞杆菌都表现出极高的裂解率，但是对腹泻型毒株及无毒株的裂解能力有区别，可以裂解部分腹泻型毒株，而对低毒或无毒株的裂解能力较弱。同时，噬菌体C1E1和HA3A10均既不能裂解其它种属的金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、出血性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌，也不能裂解与蜡样芽胞杆菌高度近源同属于蜡样芽胞杆菌群的蕈状芽胞杆菌和韦氏芽胞杆菌。说明本发明提出的噬菌体C1E1和HA3A10具有针对高毒力呕吐型和部分腹泻型蜡样芽胞杆菌的特异性裂解谱，而现有的蜡样芽孢杆菌噬菌体不具备这一特异性。以肌尾噬菌体科属的蜡样芽胞杆菌噬菌体B4为对比例，该噬菌体除了能裂解6株蜡样芽胞杆菌标准株(未区分是否产毒的特性)外，还能裂解近源的蕈状芽孢杆菌，容易破坏肠道微生物菌群。

实施例4噬菌体在米粥中抑菌分析

选取菌株编号为5-1、KM007和WH0805的三种宿主菌配合噬菌体C1E1、噬菌体HA3A10、以及噬菌体组合物做抑菌分析。其中，菌株编号5-1为呕吐型蜡样芽胞杆菌大米分离株，菌株编号KM007、WH0805为蜡样芽胞杆菌食物案例分离株。具体方法如下：

将10g大米和100ml水制成米粥后高温高压灭菌处理，得无菌米粥。

取宿主菌菌株(5-1、KM007、WH0805)平板划线活化(30℃、12h)，并分别挑单菌落于5ml LB中摇床培养(30℃、2h)，得菌液，菌浓度≈10⁵CFU/ml。

取噬菌体培养成噬菌体液。本次试验中，噬菌体液包括：效价为10⁸PFU/ml的噬菌体C1E1液、效价为10⁹PFU/ml的噬菌体C1E1液、效价为10⁸PFU/ml的噬菌体HA3A10液、效价为10⁹PFU/ml的噬菌体HA3A10液、效价为10⁸PFU/ml的噬菌体混合液(C1E1：HA3A10＝1:1)以及效价为10⁹PFU/ml的噬菌体混合液(C1E1：HA3A10＝1:1)。

向无菌米粥中加入1ml菌液混合均匀，同时设置空白组。其中，空白组加入1mlSMbuffer，实验组加入1ml噬菌体液混合均匀，30℃摇床培养20h。期间，每隔4h取样测米粥食品基质中菌浓度，以菌浓度的对数为纵坐标，以取样时间为横坐标，绘制菌浓度变化趋势图(图3至图5)。

从图3至图5中可以看出，噬菌体C1E1、噬菌体HA3A10、以及噬菌体混合液在米粥食品基质中对3株蜡样芽胞杆菌均有抑制作用。同时，还可以看出：(1)当噬菌体浓度从10⁸PFU/ml增加到10⁹PFU/ml，抑菌效果也随之增强；(2)相同浓度下，噬菌体混合液的抑菌效果比单一噬菌体液的抑菌效果明显；(3)单一噬菌体液在相同浓度的条件下，两株噬菌体在食品介质中对同一株蜡样芽胞杆菌也表现出不同的裂解活性；(4)同一株噬菌体在米粥食品介质中对三株不同的呕吐型蜡样芽胞杆菌也表现出不同的抑菌活性，噬菌体对于大米分离株5-1和病原分离株WH0805在米粥中抑菌效果较好，其中对于大米分离株5-1的抑菌效果最为明显，而对于KM007的抑菌效果较差，说明噬菌体在相同的食品介质中对不同的宿主菌也表现出具有差异的裂解活性。本次试验中，噬菌体C1E1、噬菌体HA3A10、以及噬菌体混合液在米粥中对蜡样芽胞杆菌的抑制率可高达99％。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种蜡样芽胞杆菌噬菌体(Bacillus cereus bacteriphage)C1E1，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M 2019230，保藏时间为2019年4月3日。

2.一种蜡样芽胞杆菌噬菌体(Bacillus cereus bacteriphage)HA3A10，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M 2019229，保藏时间为2019年4月3日。

3.一种噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10。

4.如权利要求3所述的噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体组合物中，所述蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和所述蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10的个数比为1：(0.8～1.2)。

5.一种抑菌制剂，其特征在于，所述抑菌制剂包括如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌噬菌体C1E1和如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌噬菌体HA3A10中的一种或两种。

6.如权利要求5所述的抑菌制剂，其特征在于，所述抑菌制剂的剂型为片剂、颗粒剂、粉剂、冻干剂或液体制剂。

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