CN115747172A - 一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株及其应用，属于噬菌体技术领域。本发明从鸡白痢沙门氏菌中分离得到一株沙门氏菌烈性噬菌体，生物保藏编号为CCTCCNO：M20221380，对高温和pH值具有双重稳定性，同时对多种沙门氏菌具有裂解活性具有宿主范围广的特点，同时裂解活性高，能够用于沙门氏菌污染的防控和清除，为动物养殖中饲料或饮用水等安全提供保障。

Description

一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株及其应用

技术领域

本发明属于噬菌体技术领域，具体涉及一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株及其应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性细菌，是人类和动物的重要病原体，可引起多种疾病，从自限性胃肠炎到伤寒样疾病，再到全身感染。在畜牧养殖业中，鸡白痢沙门氏菌是危害养鸡业的最严重疾病之一，可引起雏鸡腹泻，成年鸡可持续存在而没有明显的临床症状，并导致垂直和水平传播。目前，由于抗生素的大量使用，预防性给予抗生素导致超级细菌的不断出现，世界上越来越多的国家加入了限抗禁抗的行列，这对沙门氏菌的防控造成了极大的威胁，因而我们探索针对细菌感染的新型或者替代疗法的行动迫在眉睫。

噬菌体是一种可以裂解细菌的病毒，具有特异性，能够专一裂解某一类或某一种特定细菌。噬菌体已被公认为食品中、环境中的潜在抗菌剂。与抗生素相比，噬菌体可特异性感染目标病原菌而不影响正常微生物群，具有自我复制性，对动物和人类无害，并且在没有合适的目标细菌的情况下迅速从宿主中清除。2013年，美国Intralytix公司研制的沙门氏菌噬菌体制剂SalmoFresh得到了美国(FDA)批准并允许上市，这开启了噬菌体制剂的时代。到目前为止，商业认可的噬菌体产品，如Armment，Salmonelex和SalmoFresh已被用于灭活和控制食品中的沙门氏菌。但目前沙门氏菌噬菌体毒株存在高温下裂解失活的问题，大大限制了沙门氏菌噬菌体毒株的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株，对80℃下作用80min仍有活性。

本发明提供了一株耐热沙门氏菌(Salmonella)烈性噬菌体毒株，保藏编号为CCTCC NO：M 20221380。

本发明提供了一种沙门氏菌烈性噬菌体制剂，包括所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株和辅料。

本发明提供了一种抑制沙门氏菌污染的饲料，包括动物饲料和所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂。

优选的，所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株的MOI为1～100。

本发明提供了所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂在制备预防或清除沙门氏菌的产品中的应用。

优选的，所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。

本发明提供了所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂在动物养殖中的应用。

优选的，所述动物养殖包括预防或清除饲料或饮用水中沙门氏菌污染。

优选的，所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。

本发明提供了一株耐热沙门氏菌(Salmonella)烈性噬菌体毒株，保藏编号为CCTCC NO：M 20221380。本发明分离且筛选出了一株耐高温的沙门氏菌噬菌体，在温度50℃以内噬菌体滴度基本保持不变，温度对其没有影响；在70℃和80℃时噬菌体滴度稍微有所下降，但是在80℃下处理80min时，仍有较高的活性。同时本发明提供的烈性噬菌体毒株在pH值为3～11的环境中处理1小时活性稳定。因此，本发明提供的噬菌体毒株对高温和广泛的pH值变化均表现出较强的稳定性。

此外，烈性噬菌体毒株具有较强的裂解活性，在感染复数(MOI)范围分别为10～0.00000001范围内均可以有效抑制沙门氏菌的生长，表明该噬菌体对宿主菌有较强的生长抑制作用。同时，所述烈性噬菌体毒株还具有广谱沙门氏菌裂解活性，例如对鸡白痢沙门氏菌(S.Pullorum)、鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、德比沙门氏菌(S.Derby)、巴拿马沙门氏菌(S.Panama)、阿贡纳沙门氏菌(S.Agona)、印第安纳沙门氏菌(S.India)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.Para-typhi)、霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)等均表现出不同程度的裂解活性，其中对鸡白痢沙门氏菌的裂解活性最强。

生物材料保藏信息

本发明提供的沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage)GSP003，保藏于中国典型培养物保藏中心，单位简称为CCTCC，地址为中国武汉，武汉大学，保藏时间为2022年9月5日。保藏编号为CCTCC NO：M 20221380。

附图说明

图1为沙门氏菌噬菌体GSP003的噬菌斑形态图；

图2为沙门氏菌噬菌体GSP003的透射电镜形态图；

图3为沙门氏菌噬菌体GSP003的基因组注释圈图；

图4为沙门氏菌噬菌体GSP003的最佳MOI实验结果图；

图5为沙门氏菌噬菌体GSP003的一步生长曲线结果图；

图6为沙门氏菌噬菌体GSP003的pH值稳定性结果图；

图7为沙门氏菌噬菌体GSP003的热稳定性结果图；

图8为沙门氏菌噬菌体GSP003在不同的MOI下裂解宿主菌的能力检测结果图；

图9为沙门氏菌噬菌体GSP003清除饲料(A)和饮用水(B)中沙门氏菌的能力结果图。

具体实施方式

本发明提供了一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株，保藏编号为CCTCC NO：M20221380。

在本发明中，所述烈性噬菌体毒株是从鸡白痢沙门氏菌SP005中筛选分离得到的，电镜观察该噬菌体具有多面体的头部和不可伸缩的尾巴。在双层平板上可形成透亮空斑，周围有一圈晕环，边缘整齐。在pH值3～11中作用1小时活性稳定。在80℃下处理80min仍有较高的活性。所述烈性噬菌体毒株的基因组序列提交至GenBank中，登录号为OP394142。

在本发明中，所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株的增殖方法，优选包括以下步骤：

将鸡白痢沙门氏菌培养至OD₆₀₀ 0.4时，挑取噬菌体单斑放入鸡白痢沙门氏菌液中，在37℃振荡培养6h，观察菌液是否变澄清，离心过滤收集上清液，10倍梯度稀释后进行噬菌体效价的测定，储存到4℃冰箱。

本发明提供了一种沙门氏菌烈性噬菌体制剂，包括所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株和辅料。

本发明对所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的噬菌体制剂类型即可。所述辅料根据制剂剂型进行常规选择。本发明对所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制剂种类即可。

本发明提供了一种抑制沙门氏菌污染的饲料，包括动物饲料和所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂。

在本发明中，所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株的MOI优选为1～100，更优选为10。

本发明提供了所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂在制备预防或清除沙门氏菌的产品中的应用。

在本发明中，所述沙门氏菌优选包括鸡白痢沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌，更优选为鸡白痢沙门氏菌。

本发明提供了所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂在动物养殖中的应用。

在本发明中，所述动物养殖优选包括预防或杀灭饲料或饮用水中沙门氏菌污染。所述沙门氏菌优选包括鸡白痢沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。所述动物养殖包括家禽、畜牧等。

下面结合实施例对本发明提供的一株耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

沙门氏菌噬菌体的分离方法

将采集的污水样品10000g/min离心10min去除杂质，取上清备用。取2ml对数生长期的鸡白痢沙门氏菌SP005加入到5mL的LB液体培养基中，与5ml的污水上清混合，放置在37℃摇床增殖过夜。过夜培养的增殖液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，梯度稀释后，取每个梯度液100μl与100μl的宿主菌混合并加入到5ml融化的LB半固体培养基中，放置37℃温箱培养。用小枪头挑取双层平板上的噬菌体单斑放入SM中，梯度稀释，继续用双层平板法检测噬菌体单斑，至少三轮纯化后的噬菌体单斑扩增培养，得到沙门氏菌噬菌体毒株GSP003，检测噬菌体滴度，4℃保存。

观察噬菌体的噬菌斑形态

纯化后的噬菌体液经梯度稀释后，取每个梯度液100μl与100μl的宿主菌混合并加入到5ml熔化的LB半固体培养基中，放置37℃温箱培养。48h后观察噬菌斑的形态。结果如图1所示。该噬菌体在双层平板上形成有晕环透亮的噬菌斑。

电镜观察噬菌体形态

采用磷钨酸负染法，取一滴纯化后的高效价噬菌体液滴于铜网上吸收10min，吸干残余悬液，用2％的磷钨酸(PTA，2％w/v)染色2min，用红外灯将铜网烘干，透射电镜观察，结果如图2所示。该噬菌体经透射电镜观察，该噬菌体形态学分类属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，长尾噬菌体科(Siphoviridae)。

实施例2

噬菌体基因组分析

噬菌体GSP003进行全基因组测序拼接，得到的基因组序列提交至GenBank中，登录号为OP394142。利用RAST(http://rast.nmpdr.org/)在线软件注释基因组，并手动使用NCBI中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具进行验证。利用ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)和VirulenceFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)分析噬菌体基因组中潜在的抗生素耐药性和毒力基因。检测基因组中是否存在溶原相关蛋白。

结果如图3显示，该噬菌体不存在抗生素耐药性和毒力基因，并且不存在溶原相关蛋白，表明该噬菌体不存在潜在的威胁，可以应进行临床应用。

实施例3

噬菌体的裂解谱检测方法

取本实验室保存的各种沙门氏菌菌株，37℃培养过夜，取100μl与5ml LB半固体培养基混合倒双层平板，将噬菌体10倍梯度稀释，将不同梯度的噬菌取10μl点滴到双层平板上，晾干后在37℃培养箱倒置培养6～12h，观察噬菌体对受试菌株的裂解情况，按照公式I计算噬菌体的成斑率。

EOP＝测试菌噬菌体滴度/宿主菌噬菌体滴度公式I

结果表1显示，噬菌体可以裂解多种不同血清型的沙门氏菌，相对较广谱。

表1噬菌体裂解谱

注：++：0.01≤EOP≤1.5；+：EOP<0.01；-：不裂解。

实施例4

噬菌体的最佳感染复数(MOI)的测定方法

取保存好的噬菌体GSP003(10⁹PFU/mL)和培养至对数生长期的鸡白痢沙门氏菌(10⁷CFU/mL)，按照噬菌体：宿主菌＝10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001的浓度比混合。37℃振荡培养4h，于4℃、12000g/min离心1min，离心后即时吸取上清进行梯度稀释，用双层平板法测定噬菌体滴度。产生的最高噬菌体效价即为最佳MOI。

结果如图4所示，当MOI＝0.00001的时候，噬菌体GSP003的裂解效价达到最大值，因而该噬菌体的最佳感染复数为0.0001。

实施例5

一步生长曲线的测定

将噬菌体GSP003和培养至对数期的鸡白痢沙门氏菌SP005按照MOI为0.01混合，将其置于37℃摇床振荡培养10min后，于4℃8000r/min离心10min，弃上清，洗涤菌液至少2次。用等体积的液体LB重悬并混匀。将其置于37℃振荡培养，每10分钟取样一次，取到120min。之后用SM缓冲液进行梯度稀释，通过双层培养法测定噬菌体的滴度，绘制一步生长曲线。

结果如图5可知，每隔10min取样一次，GSP003噬菌体的潜伏期约为10min，之后曲线呈指数性增长，为噬菌体的裂解期，滴度大幅度上升，在50min之后基本处于稳定期。

实施例6

噬菌体温度稳定性的测定方法

取噬菌体GSP003(10⁹PFU/ml)分装于1.5mL EP管中。一共设置7个温度梯度(4℃、25℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃)。置于水浴锅中80min，每隔20min取样检测一次，对其进行连续十倍梯度稀释后，使用双层平板法测定噬菌体在不同温度时的噬菌体滴度。

结果如图6所示，噬菌体GSP003在温度50℃以内噬菌体滴度基本保持不变，温度对其没有影响。结果表明，噬菌体GSP003在70℃和80℃时它的滴度虽然有所下降，但是在80min时，仍有较高的活性。

实施例7

噬菌体pH稳定性的测定方法，取噬菌体GSP003(10⁹PFU/ml)分装于1.5EP管中。一共设置12个pH梯度(2～13)，取100μl GSP003噬菌体悬浮液分别加入900μl的12个不同pH缓冲液中，将其静置于37℃水浴锅中1h。对其进行连续十倍梯度稀释，使用双层平板法测定不同pH时的噬菌体滴度。

结果如图7所示，噬菌体在pH值3～11中作用1小时活性稳定。

实施例8

噬菌体不同MOI在体外裂解活性的检测方法

将对数生长期的100μl鸡白痢沙门氏菌(10⁷CFU/mL)与LB(对照)或噬菌体裂解物以100μl混合，感染复数(MOI)范围分别为10、1、0.1、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001、0.00000001。通过使用生长曲线检测仪Bioscreen C系统(Labsystems Oy,Helsinki,Finland)每30分钟监测和记录600nm(OD₆₀₀)的光密度，监测细菌生长并分析噬菌体的裂解活性。

结果如图8所示，未加噬菌体组OD值迅速增长，噬菌体在不同的MOI下均可以有效抑制鸡白痢沙门氏菌的生长，表明噬菌体GSP003对宿主菌有很好的生长抑制作用。

实施例9

噬菌体GSP003有效控制饲料中的鸡白痢沙门氏菌的污染实验

将浓度为10⁷CFU/mL的鸡白痢沙门氏菌均匀喷洒在鸡饲料中，混合均匀，饲料中细菌的终浓度约为10⁴CFU/g。将噬菌体GSP003以MOI分别为100和10喷洒在饲料上，对照组喷洒PBS。在1h、3h、6h、12h、24h时分多点取样，检测饲料中所含有的细菌量。

检测结果如图9中A所示，在不同的时间可以显著降低饲料中细菌的数量(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)，说明该噬菌体可以有效降低饲料中的鸡白痢沙门氏菌的数量，减少饲料中沙门氏菌传播的风险。

实施例10

噬菌体GSP003控制饮用水中的鸡白痢沙门氏菌的污染

将浓度为10⁷CFU/mL的鸡白痢沙门氏菌加到饮用水中，混合均匀，饮水中细菌的终浓度约为10⁴CFU/mL。以MOI分别为100和10的噬菌体加到水中，对照组加等量的PBS。在1h、3h、6h、12h、24h时分别取样，平板计数检测饮用水中所含有的细菌量。

检测结果如图9中B显示，在不同的时间可以显著降低水中的细菌数量(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)，说明噬菌体GSP003可以有效降低引用水中的鸡白痢沙门氏菌的数量，减少饮用水中沙门氏菌传播的风险。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株耐热沙门氏菌(Salmonella)烈性噬菌体毒株，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO：M 20221380。

2.一种沙门氏菌烈性噬菌体制剂，其特征在于，包括权利要求1所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株和辅料。

3.一种抑制沙门氏菌污染的饲料，其特征在于，包括动物饲料和权利要求1所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或权利要求2所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂。

4.根据权利要求3所述饲料，其特征在于，所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株的MOI为1～100。

5.权利要求1所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或权利要求2所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂在制备预防或清除沙门氏菌的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。

7.权利要求1所述耐热沙门氏菌烈性噬菌体毒株或权利要求2所述沙门氏菌烈性噬菌体制剂在动物养殖中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述动物养殖包括预防或清除饲料或饮用水中沙门氏菌污染。

9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌或/和鼠伤寒沙门氏菌。

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