CN102181403A - 宽宿主谱噬菌体的人工改造技术的研究 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工改造噬菌体拓宽其宿主谱的方法，属于食品安全检测领域，是生物技术在食品安全检测方面的探索性应用。方法包括野生烈性噬菌体的筛选、较宽裂解谱的烈性噬菌体的筛选K1、噬菌体基因组的人工改造、将敲除后的基因组通过大肠杆菌做中间的载体回转到原噬菌体中，将改造后的基因组通过大肠杆菌top10回转到原先的噬菌体中，并检测改造后的噬菌体的噬菌谱。本发明筛选并得到改造后的一株宽裂解谱噬菌体，实验结果表明该噬菌体可以同时检测5种食源性致病菌，检测时间为3小时，滴度为1×1012CFU/ml，检测灵敏度为95.3％。
Description
技术领域
本发明属食品安全检测领域，是生物技术在食品安全检测方面的探索性应用。
背景技术
近年来，食品安全问题日益突出，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病已成为最严重的公共卫生问题之一，这不仅危害到广大人民群众的切身利益，还影响到经济的可持续发展和社会的和谐稳定。食源性致病菌日趋严重的危害形势提示我们：目前食源性致病菌的检测方法还不能完全满足目前食品安全检测工作的需要，必须进一步建立和完善有效的食品安全检测技术及监控体系，其中重中之重的工作是建立高通量、快速、灵敏的检测方法。本研究以成功筛选的野生型大肠杆菌噬菌体为切入点，进行人工改造噬菌体基因组从而“拓宽”噬菌体宿主谱的研究，探究人工“拓宽”噬菌体宿主谱的可行性，为建立高通量、快速、灵敏的新型食源性致病菌的快速检测方法提供新思路。
发明内容
本发明目的是提供一种可以同时检测多种食源性病原菌的噬菌体。该方法简单，检测时间短。所述方法包括：野生烈性噬菌体的筛选、较宽裂解谱的烈性噬菌体的筛选、噬菌体基因组的人工改造。
1)分离鉴定野生型大肠杆菌烈性噬菌体，人工诱导、培育噬菌体宿主谱
从自然环境中分别筛选几株大肠杆菌的野生型烈性噬菌体，进行噬菌体的培养、增殖并与宿主菌增殖(标准大肠杆菌)培养，根据噬菌斑的大小及透明程度观察并确定噬菌体的天然裂解谱，将筛选到的烈性大肠杆菌噬菌体进行纯化、滴定、保存；
2)初步改造筛选噬菌体裂解谱并进行噬菌体生物学特性的研究
将筛选到的烈性大肠杆菌噬菌体与多种非宿主菌(即主要食源性致病菌：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、肠出血性大肠埃希菌O157：H7、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌)进行交叉培养，观察其天然裂菌谱(方法同上)，筛选获得可供人工改造的较宽裂解谱的烈性噬菌体(K1)(可以筛选3株以上不同裂解谱的噬菌体，分别用于下述实验步骤中，便于提高实验效率，方法基本一致)；
3)噬菌体K1基因组的改造及报告基因的插入
基因组的改造包括基因的插入、删除、定点突变等方式。本研究采用敲除目的基因的方法对基因组进行改造，首先提取噬菌体K1的全基因组DNA并用生物信息学的方法对全基因组DNA分析，找到特异性吸附基因所在位置。选择基因组和特异性基因中都不含有的限制性内切酶酶切位点对K1基因组进行酶切，然后将该片段克隆后再通过重叠PCR方法敲除特异性基因，然后再连接到原先的基因组位置。最后将改造后的片段与其他酶切片段按顺序连接起来，构建报告噬菌体基因组，即获得人工改造后的K1基因组。
具体实施方式
实施例
1分离鉴定野生型大肠杆菌烈性噬菌体，人工诱导、培育噬菌体宿主谱
从自然环境中分别筛选5株大肠杆菌的野生型烈性噬菌体，进行噬菌体的培养、增殖并与宿主菌增殖(标准大肠杆菌)培养，根据噬菌斑的大小及透明程度观察并确定噬菌体的天然裂解谱，筛选到的烈性大肠杆菌噬菌体的噬菌斑的直径在1cm以上，滴度在5×1014CFU/ml以上，并进行纯化保存。
2初步改造筛选噬菌体裂解谱并进行噬菌体生物学特性的研究
将筛选到的烈性大肠杆菌噬菌体与多种非宿主菌(即主要致病性致病菌：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、肠出血性大肠埃希菌O157：H7、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌)进行交叉培养，观察其天然裂菌谱(方法同上)，筛选获得可供人工改造的较宽裂解谱的烈性噬菌体(K1)(可以筛选3株以上不同裂解谱的噬菌体，分别用于下述实验步骤中，便于提高实验效率，方法基本一致)。所获得的较宽噬菌体的噬菌斑的直径在1cm以上，滴度在1×1012CFU/ml以上，并且至少对3种以上的致病菌有裂解作用。
3噬菌体K1基因组的改造及报告基因的插入
基因组的改造包括基因的插入、删除、定点突变等方式。本研究采用敲除目的基因的方法对基因组进行改造，首先提取噬菌体K1的全基因组DNA并用生物信息学的方法对全基因组DNA分析，找到特异性吸附基因所在位置(目前研究结果表明，编码λ噬菌体尾丝的J基因编码的J蛋白是决定噬菌体的特异性吸附，T4系列噬菌体识别宿主特异性的基因是g37p)。选择基因组和特异性基因中都不含有的限制性内切酶酶切位点对K1基因组进行酶切(如果该酶切位点不宜选取，可先选取特异基因外侧的大片段酶切，然后将该片段克隆后再通过重叠PCR方法敲除特异性基因，然后再连接到原先的基因组位置)。最后将改造后的片段与其他酶切片段按顺序连接起来，构建报告噬菌体基因组，即获得人工改造后的K1基因组。(报告基因Luc的插入与特异基因的敲除的顺序不分前后，依实验情况需要决定)
4将改造后的基因组回转到原先的噬菌体中，并检测改造后的噬菌体的噬菌谱
将改造后的基因组转化入大肠杆菌top10中，然后将噬菌体K1侵染转化后的大肠杆菌top10，逐步筛选获得改造后的噬菌体K2，运用实例2中的步骤和方法，筛选并检测改造后的一株宽裂解谱噬菌体，实验结果表明该噬菌体可以同时检测5种食源性致病菌，检测时间为3小时，滴度为1×1012CFU/ml，检测灵敏度为95.3％。
Claims (4)
1.本发明涉及一种人工改造噬菌体拓宽其宿主谱的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：
a)野生烈性噬菌体的筛选：从自然环境中分别筛选几株大肠杆菌的野生型烈性噬菌体，进行噬菌体的培养、增殖并与宿主菌增殖(标准大肠杆菌)培养，根据噬菌斑的大小及透明程度观察并确定噬菌体的天然裂解谱，将筛选到的烈性大肠杆菌噬菌体进行纯化、滴定、保存；
b)较宽裂解谱的烈性噬菌体的筛选K1：将筛选到的烈性大肠杆菌噬菌体与多种非宿主菌进行交叉培养，观察其天然裂菌谱(方法同上)，筛选获得可供人工改造的较宽裂解谱的烈性噬菌体(K1)(可以筛选3株以上不同裂解谱的噬菌体，分别用于下述实验步骤中，便于提高实验效率，方法基本一致)；
c)噬菌体基因组的人工改造：本技术采用敲除目的基因的方法对基因组进行改造，首先提取噬菌体K1的全基因组DNA并用生物信息学的方法对全基因组DNA分析，找到特异性吸附基因所在位置g37p。
2.根据权利要求1a所述的野生烈性噬菌体的筛选，其特征在于所筛选到的噬菌体的噬菌斑的直径在1cm以上，滴度在5×1014CFU/ml以上，保存品应无杂菌。
3.根据权利要求1b所述的较宽裂解谱的烈性噬菌体的筛选，其特征在于筛选到3株以上，能对尽可能多的主要食源性致病菌(即沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、肠出血性大肠埃希菌O157：H7、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌)起裂解作用的噬菌体。
4.根据权利要求1c所述的噬菌体基因组的人工改造，其特征在于敲除每种噬菌体基因组中的特异性吸附基因g37p，将敲除后的基因组通过大肠杆菌做中间的载体回转到原噬菌体中。
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| CN2011100041120A CN102181403A (zh) | 2011-01-11 | 2011-01-11 | 宽宿主谱噬菌体的人工改造技术的研究 |
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Publications (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN102181403A (zh) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107257853A (zh) * | 2014-12-29 | 2017-10-17 | 尹特荣生物科技株式会社 | 新型肠出血性大肠杆菌噬菌体Esc‑CHP‑1及其用于抑制肠出血性大肠杆菌增殖的用途 |
| CN110205306A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-09-06 | 武汉轻工大学 | 蜡样芽胞杆菌噬菌体、噬菌体组合物及抑菌制剂 |
| CN110317793A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-10-11 | 华中农业大学 | 一种主效成分为噬菌体lpee17和lpek22的混合制剂及应用 |
| US11058131B2 (en) | 2015-04-16 | 2021-07-13 | Kennesaw State University Research And Service Foundation, Inc. | Escherichia coli O157:H7 bacteriophage Φ241 |
| CN114606206A (zh) * | 2022-02-14 | 2022-06-10 | 河南师范大学 | 具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体及其构建方法和应用 |
-
2011
- 2011-01-11 CN CN2011100041120A patent/CN102181403A/zh active Pending
Cited By (7)
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| CN110317793B (zh) * | 2019-06-27 | 2020-06-30 | 华中农业大学 | 一种主效成分为噬菌体lpee17和lpek22的混合制剂及应用 |
| CN114606206A (zh) * | 2022-02-14 | 2022-06-10 | 河南师范大学 | 具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体及其构建方法和应用 |
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