CN110684741B - 一种弧菌噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种弧菌噬菌体及其应用。本发明中的噬菌体保藏编号为GDMCC No:60731，对弧菌具有裂解活性，具有较宽的宿主谱，可以有效的杀灭和防治弧菌，从而起到防治水产动物的作用，可以单独或混合使用，毒副作用小，安全性高。

Description

一种弧菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种弧菌噬菌体及其在杀菌和抗菌中的应用。
背景技术
弧菌(Vibrion)广泛分布于海水养殖环境中，一直被认为是许多海水鱼、虾及蟹类的重要致病菌，是一类革兰氏阴性，具有鞭毛，能运动，无芽孢和荚膜的杆状细菌。多数弧菌是兼性厌氧菌，对营养要求不高，嗜盐，在含有NaCl的蛋白胨水中就可以生长，适宜在pH为8.0～9.0的碱性环境中生长。
已发现对海水鱼类具有致病性的弧菌主要是副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和哈维氏弧菌等十几种。海水鱼病害的发生给水产养殖业造成了巨大的损失，目前对于弧菌的防治主要为抗生素防治。但是，抗生素长期大量使用，会带来了诸如环境污染、耐药性产生以及食品安全等问题。另外，抗生素的研发周期长，研发成本高。所以一直在寻求能够有效控制水产养殖病害又环境友好型的新技术、新产品，以部分或完全替代抗细菌药物。
目前，人们关注最多的还是微生物防治，包括拮抗菌防治法、蛭弧菌防治法和噬菌体防治法，这些方法对环境没有污染，且不会破坏生态环境，因此越来越受到人们的重视。
噬菌体为侵染细菌的病毒，在自然界中广泛存在，被认为是地球上丰度和多样性最高的生物。在大多数已经被研究过的生态系统中，细菌和噬菌体是共生关系，它们的丰度比是1:10。研究表明，环境中的噬菌体数量为1031。噬菌体具有宿主专一性强的特点，在侵染宿主菌后，只感染宿主菌不裂解其他菌，不会破坏微生态环境。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，其中温和噬菌体侵入细菌后不会引起宿主细胞裂解，只是将自己的基因组整合到宿主的基因组上，伴随着宿主基因组同步复制，不会引起宿主的细胞裂解，一般不会对宿主细胞产生有害影响。烈性噬菌体通过在短时间内连续完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个阶段，而实现繁殖。烈性噬菌体在进入菌体后会改变宿主的性质，使之成为制造噬菌体的工厂，大量产生新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡。
然而噬菌体具有宿主特异性，只能够裂解一种或者一类细菌，因而使噬菌体治疗在实际应用中存在宿主谱窄的问题，不能有效控制多发性细菌疾病。因此筛选高效广谱的噬菌体是研究噬菌体制剂的关键。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种噬菌体。
因此，本发明的目的之一在于提供上述噬菌体在制备抗弧菌制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种组合物。
本发明所采用的技术方案如下文所述。
一种噬菌体，其分类学名称为：Vibrio alginolyticus bacteriophage，该噬菌体于2019年07月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60731，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
进一步地，所述噬菌体对溶藻弧菌ATCC33787、20-2和H29，副溶血弧菌ZJ2-8都有裂解作用。
进一步地，所述溶藻弧菌H29于2019年07月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60730，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
进一步地，所述噬菌体在40～50℃中放置60min，其活性稳定；在60℃放置60min，效价降低3个数量级；在70℃放置30min，效价降为0。
本发明还提供一种上述噬菌体在制备抗弧菌制剂中的应用。
本发明还提供一种抗弧菌组合物，包括上述噬菌体作为活性成分。
进一步地，所述组合物还包括辅料。
进一步地，所述辅料为缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶和海藻酸盐中的至少一种。
进一步地，所述辅料可以为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖糊精。
进一步地，所述组合物的剂型可以为粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂或膏剂。
本发明还提供一种上述噬菌体或上述组合物在治疗和/或预防弧菌属微生物感染的制剂中的应用。
进一步地，所述应用包括用于在水产养殖中，除去水体和/或养殖动物体表的弧菌。
进一步地，所述弧菌属微生物包括溶藻弧菌和副溶血弧菌。
进一步地，所述溶藻弧菌ATCC33787、溶藻弧菌20-2和溶藻弧菌H29。
进一步地，所述副溶血弧菌为副溶血弧菌ZJ2-8。
本发明还提供一种上述噬菌体或上述组合物在治疗和/或预防动物弧菌病的药物中的应用。
本发明中的噬菌体对弧菌具有裂解活性，具有较宽的宿主谱，可以有效的杀灭和防治弧菌，从而起到防治水产动物的作用，可以单独或混合使用，毒副作用小，安全性高。
附图说明
图1示出了本发明噬菌体的热稳定性测试图；
图2示出了根据本发明的噬菌体对鱼肉样品的溶藻弧菌的杀菌效果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
副溶血性弧菌ATCC17802和溶藻弧菌ATCC33787购自广东省微生物保藏中心；溶藻弧菌H29保藏编号为GDMCC No:60730；溶藻弧菌20-2、副溶血弧菌ZJ2-8和Vibriocampbellii 40-2由海大畜牧兽医研究院提供。
实施例1噬菌体的分离和纯化
采自广州市水产品交易市场排污口的污水样品，利用多层纱布对采集的污水样品进行初步过滤，然后将滤液置于4℃，10,000g，15min离心。取上清液20mL加入事先灭菌的锥形瓶中，并加入20mL双倍浓缩的2216E液体培养基与处在对数期的溶藻弧菌H29菌液400μL，37℃过夜培养。次日，培养液经5000r/min，10min离心，用0.22μm孔径的一次性过滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液0，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
取200μL噬菌体0原液，加入20mL双倍浓缩的2216E液体培养基与400μL对数期的副溶血性弧菌ATCC17802菌液，37℃过夜培养。次日，培养液经5000r/min，10min离心，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液I，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
取200μL噬菌体原液I，加入5mL 2216E液体培养基与200μL对数期的细菌H29菌液37℃过夜培养。次日，培养液经5000r/min，10min离心，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液II，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
取200μL噬菌体原液II，加入5mL 2216E液体培养基与200μL对数期的细菌H29菌液37℃过夜培养。次日，培养液经5000r/min，10min离心，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液III，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
采用双层平板法，用无菌SM缓冲液对噬菌体原液III进行倍比稀释，取对数期的H29细菌菌液100μL与适当稀释梯度的噬菌体稀释液100μL混匀，然后加入到5mL的2216E半固体培养基中，混匀后倒入事先准备的2216E固体琼脂平板上，制成双层平板。凝固后倒置于37℃隔水式电热恒温培养箱中培养。
在双层平板上挑取1个边缘光滑、透明的较大噬菌斑，接种到1mL的无菌SM缓冲液中，4℃过夜。用SM缓冲液将这1mL噬菌体液进行倍比稀释，取适当梯度的噬菌体液100μL与对数生长期的细菌H29菌液100μL中，37℃振荡培养6h。然后4℃10,000r/min离心，上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后，用双层琼脂平板法重复培养5次，即可得到纯化的噬菌体。
实施例2噬菌体的扩增
取实施例1纯化得到的噬菌体，接种到1mL的无菌SM缓冲液中，4℃过夜。取500μL含噬菌体的SM缓冲液与500μL对数期生长的H29细菌菌液于5mL 2216E液体培养基中，37℃振荡培养6h。收集培养液于4℃，10,000×g，15min离心，0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，滤液即为噬菌体增殖液，放于4℃备用。
实施例3噬菌体效价测定
取600μL培养至对数期的细菌H29菌液与60μL实施例2制备得到的噬菌体加入2216E肉汤中，扩增6h左右。取1mL噬菌体增殖液，用0.22μm滤器过滤，即得噬菌体原液。用SM缓冲液对噬菌体增殖液进行连续10倍倍比稀释，取适当稀释度的噬菌体稀释液与菌液混合，静置3-5min铺双层板，37℃培养箱培养8h后进行噬菌斑计数，结果显示该噬菌体效价达到1011pfu/mL以上。
实施例4噬菌体裂谱的确定
将不同的细菌单菌落活化至对数生长期，分别取菌液200μL滴到2216E固体平板中，然后用无菌涂布棒将菌液涂布均匀至吸收，取10μL噬菌体原液分别滴到2216E固体平板表面，在超净台内放置30min后置于37℃培养箱中培养8-12h。观察平板表面是否有噬菌体空斑出现。透明的空斑表明宿主对噬菌体敏感，没有空斑表明宿主对噬菌体不敏感。结果如表1所示。
表1噬菌体裂解谱
菌株编号 菌种 能否被噬菌体裂解(Y/N)
ATCC33787 溶藻弧菌 Y
20-2 溶藻弧菌 Y
H29 溶藻弧菌 Y
ZJ2-8 副溶血弧菌 Y
40-2 Vibrio campbellii N
实施例5噬菌体热稳定性
取效价约108pfu/mL的噬菌体液1.0mL于无菌EP管中，分别于40、50、60、70℃的恒温水浴锅中作用1h，待作用时间结束后取出，进行10倍稀释后用双层平板法进行计数，重复三次取平均值，观察噬菌体效价的变化。
实验结果如图1所示，可以看出，噬菌体在40～50℃中放置60min，其效价变化不大，活性稳定；在60℃放置60min，效价降低3个数量级；在70℃放置30min，效价降为0。说明分离到的噬菌体可以耐受60℃高温。
实施例6噬菌体对鱼肉样品中溶藻弧菌的杀菌效果评价
噬菌体效价：107pfu/mL，100uL
溶藻弧菌计数：107cfu/mL，100uL
噬菌体对鱼肉样品杀菌效果的评价：
a.从市场买回活鱼一条，用灭菌的手术刀剪在超净工作台中，去除鱼皮，将鱼肉切成面积为2*2cm的小块(约1g)，将肉块过火焰，然后放在一次性平皿中备用。
b.在超净工作台中，将100uL菌液均匀涂布在肉块表面。
c.15min后，滴加100uL噬菌体在鱼肉表面。
d.对照组，不滴加噬菌体，加入100uL PBS。
e.将制备好的样品分布置于25℃，于1h，2h，3h和6h对溶藻弧菌进行计数。
实验结果如图2所示，采用噬菌体处理溶藻弧菌污染的鱼肉样品后，样品中的细菌数目在短时间内就显著减少。这说明噬菌体能够快速杀灭样品中的溶藻弧菌，起到食品安全保护剂的作用。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (7)

1.一种噬菌体，其特征在于，其于2019年07月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60731，分类学名称为：Vibrio alginolyticus bacteriophage。
2.一种抗弧菌组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，还包括辅料。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述辅料包括缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶和海藻酸盐中的至少一种。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂或膏剂。
6.如权利要求1所述的噬菌体或如权利要求2～5中任一项所述的组合物在制备治疗和/或预防弧菌属微生物感染的制剂中的应用；所述弧菌属微生物为溶藻弧菌和副溶血弧菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于在水产养殖中，除去水体和/或养殖动物体表的弧菌。
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