CN115216453B - 爱德华氏菌特异性噬菌体和其组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了爱德华氏菌特异性噬菌体和其组合物及其应用。分离获得了新型的抑制爱德华氏菌的噬菌体，所述爱德华氏菌是特异性针对杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。所述噬菌体具有强的感染能力和裂解效用，宿主特异性高，其组合对宿主菌具有很好的抑制作用。所述噬菌体可被应用于农业、医学、环境等领域以对抗其细菌宿主，其作为抗生素替代物具有良好的发展前景。

Description

爱德华氏菌特异性噬菌体和其组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和微生物学领域；更具体地，本发明涉及分离的爱德华氏菌特异性噬菌体、其组合物及应用。

背景技术

鱼类的病害问题一直是影响渔业大规模养殖问题。针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成了环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响。

爱德华氏菌是一种革兰氏阴性短杆菌和兼性厌氧的胞内寄生菌，具有周身鞭毛。目前，爱德华氏菌由杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)、鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)。

爱德华氏菌中，杀鱼爱德华氏菌是一类重要的鱼类病原菌，主要引起肠道溃烂、肠道出血和黏膜损伤等，是腹水病的主要病原菌。杀鱼爱德华氏菌的宿主非常广，危害大多数具有较高经济价值的鱼种，包括大菱鲆、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼、鳗鲡、鲻鱼、鲑鱼、鳟鱼、鲆鲽等，其传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高。杀鱼爱德华氏菌感染可以造成鱼类大量死亡，引起巨大的经济损失。目前在水产养殖过程中，主要使用抗生素治疗杀鱼爱德华氏菌的感染。但是随着抗生素的大规模使用，多重耐药菌不断产生，引起了严重的危害。

因此，本领域需要寻求一些抗生素替代物以对杀鱼爱德华氏菌进行病害防控，以减少多重耐药菌的泛滥。

发明内容

本发明的目的在于提供分离的杀鱼爱德华氏菌噬菌体和其组合物及应用。

在本发明的第一方面，提供分离的爱德华氏菌特异性噬菌体，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 20211469(vB_EpP_ZHX)或CCTCC NO：M 20211468(vB_EpM_ZHS)；其中所述爱德华氏菌是杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。

在一个或多个实施方式中，所述的爱德华氏菌特异性噬菌体CCTCC NO：M20211469(vB_EpP_ZHX)包括选自下组的特征：

(a’)包括头部和尾部，头部呈二十面体；

(b’)属于有尾噬菌体目短尾噬菌体科；

(c’)噬菌斑呈透明圆形，直径约为1.2～2.0mm，较佳地1.3～1.9mm，更佳地1.4～1.8mm；

(d’)抑菌的潜伏期为10～30分钟；较佳地15～25分钟；更佳地18～22分钟；

(e’)针对杀鱼爱德华氏菌的裂解量为80～200PFU/细胞；较佳地100～140PFU/细胞；

(f’)针对杀鱼爱德华氏菌的裂解率超过95％；较佳地超过97％。

在一个或多个实施方式中，所述的爱德华氏菌特异性噬菌体CCTCC NO：M20211468(vB_EpM_ZHS)包括选自下组的特征：

(a)包括头部和尾部，头部呈二十面体；

(b)属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科；

(c)噬菌斑呈透明圆形，直径为0.4～1mm，较佳地为0.5～0.9mm，更佳地0.6～0.8mm；

(d)抑菌的潜伏期为20～40分钟；较佳地25～35分钟；更佳地28～32分钟；

(e)针对杀鱼爱德华氏菌的裂解量为100～200PFU/细胞；较佳地130～170PFU/细胞；

(f)针对杀鱼爱德华氏菌的裂解率超过95％；较佳地超过97％。

在一个或多个实施方式中，(a)中所述噬菌体的头部长88±10nm，宽92±10nm，尾部长度为148±10nm；较佳地，所述噬菌体的头部长88±5nm，宽92±5nm，尾部长度为148±5nm。

在一个或多个实施方式中，(a)中所述噬菌体的头部长68±10nm，宽63±10nm，尾部长度为19±5nm；较佳地，所述噬菌体的头部长68±5nm，宽63±5nm，尾部长度为19±2nm。

在一个或多个实施方式中，所述CCTCC NO：M 20211469(vB_EpP_ZHX)与所述CCTCCNO：M 20211468(vB_EpM_ZHS)的组合在可以抑制超过65％、70％、80％、90％、95％、99％，或100％的杀鱼爱德华氏菌生长。

在一个或多个实施方式中，所述CCTCC NO：M 20211469(vB_EpP_ZHX)与所述CCTCCNO：M 20211468(vB_EpM_ZHS)的两者的比例(颗粒数量比例)1～10:10～1；较佳地1～5:5～1；如1～3:3，1～2:2～1，1～1.5:1.5～1，1:1。

在本发明的另一方面，提供所述的噬菌体或噬菌体组合(两种噬菌体的组合)的应用，用于：(1)特异性抑制其细菌宿主；或，(2)制备特异性抑制其细菌宿主的组合物；较佳地，其细菌宿主包括：杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌。

在一个或多个实施方式中，所述的应用为非治疗性的应用；例如针对环境中的所述噬菌体的宿主(如杀鱼爱德华氏菌)进行抑制。

在一个或多个实施方式中，所述鱼类为海水鱼类。

在一个或多个实施方式中，所述鱼类包括(但不限于)：大菱鲆、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼、鳗鲡、鲻鱼、鲑鱼、鳟鱼、鲆鲽。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制爱德华氏菌的组合物，其包含前面任一所述的噬菌体或噬菌体组合；其中所述爱德华氏菌是杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌；较佳地，其还包含生物学可接受的载体；较佳地，所述组合物中噬菌体大于或等于10³PFU/mL。

在一个或多个实施方式中，所述组合物中噬菌体为10³～10¹⁰PFU/mL。

在一个或多个实施方式中，所述组合物中噬菌体为10⁴～10⁹PFU/mL(如10⁵、10⁶、10⁷、10⁸PFU/mL)。

在一个或多个实施方式中，所述的噬菌体组合为CCTCC NO：M 20211469(vB_EpP_ZHX)与CCTCC NO：M 20211468(vB_EpM_ZHS)的组合，两者的在组合中的含量为(颗粒数量比例)1～10:10～1。

在一个或多个实施方式中，CCTCC NO：M 20211469(vB_EpP_ZHX)与CCTCC NO：M20211468(vB_EpM_ZHS)的组合，两者在组合中的含量为(颗粒数量比例)1～5:5～1；如1～3:3，1～2:2～1，1～1.5:1.5～1，1:1。

在一个或多个实施方式中，所述组合物为药物组合物、食品组合物、饲料组合物、清洁剂和/或消毒剂。

在一个或多个实施方式中，所述药物组合物为疫苗组合物；更佳地，该疫苗组合物预防所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病。

在一个或多个实施方式中，所述药物组合物为治疗组合物；更佳地，该治疗组合物治疗所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病；更佳地，所述鱼类疾病包括：炎症疾病。

在一个或多个实施方式中，所述饲料组合物中，所述噬菌体作为饲料添加剂。

在一个或多个实施方式中，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。

在一个或多个实施方式中，所述噬菌体制剂的剂型包括(但不限于)：液体制剂或固体制剂；更佳地包括：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

在本发明的另一方面，提供一种应用前面任一所述的噬菌体制备组合物的方法，包括：扩增培养前面任一所述的噬菌体或噬菌体组合；将之与载体混合，所述的载体为生物学可接受的载体。

在一个或多个实施方式中，所述的载体包括但不限于：溶剂、佐剂、缓冲液、冻干保护剂、润湿剂、渗透剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、充填剂、助剂、表面活性剂或控释剂。

在一个或多个实施方式中，所述扩增培养包括：将所述噬菌体或噬菌体组合接种至细菌宿主培养物(培养液)，从而所述噬菌体侵染其宿主，进行复制；较佳地，其中所述细菌宿主为杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。

在本发明的另一方面，提供一种抑制爱德华氏菌的方法，所述方法包括：以前面任一所述的噬菌体或噬菌体组合、或任一所述的组合物对需要进行细菌抑制的对象进行处理；所述的细菌是能被所述噬菌体感染(侵染)、进而裂解的细菌，包括：杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌。

在一个或多个实施方式中，所述的应用和方法为非治疗性的应用和方法，其不以人或动物为直接的预防或治疗对象(如针对含有病原体的区域(如公共场所，鱼类养殖水)/器具等进行消杀，或针对可能被病原体附着的食物、饲料等进行消杀)。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制爱德华氏菌的试剂盒/药盒，其中所述的爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌，所述试剂盒/药盒包含：前面任一所述的噬菌体或噬菌体组合；或前面任一所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

本发明上述的以及其它的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：

图1、本发明的噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的噬菌斑图。

图2、本发明的噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的电镜图。

图3、本发明的噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的一步生长曲线图。

图4、本发明的噬菌体vB_EpM_ZHS、vB_EpP_ZHX或两种噬菌体的组合对宿主菌EIB202的裂解曲线结果图。

图5、本发明的噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的组合通过抑制宿主菌EIB202、从而对大菱鲆发挥治疗效果的结果图。

具体实施方式

本发明人致力于鱼类无抗病原菌病害防控的研究，以爱德华氏菌为宿主菌，进行广泛的筛选工作，分离获得特异性针对爱德华氏菌的噬菌体，所述爱德华氏菌是杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。本发明的噬菌体具有强的感染能力和裂解效用，宿主特异性高，其组合对宿主菌具有很好的抑制作用。本发明的噬菌体可被应用于农业、医学、环境等领域以对抗其细菌宿主，其作为抗生素替代物具有良好的发展前景。

术语

如本文所用，所述“病原体”是对于人、动物、植物或环境具有危害性的微生物，尤其为对鱼类有危害性的微生物。更具体地，“病原体”是指能由本发明的噬菌体裂解/损坏的微生物，所述微生物包括本发明所述的噬菌体的细菌宿主；较佳地，所述细菌宿主包括：杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌，当本发明的噬菌体作用于所述细菌宿主时，宿主发生裂解/损坏。

本发明中，所述“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，“生物学可接受的载体”是用于将本发明的噬菌体传送给需要处理的对象(包括病原体宿主、病原体所在的环境(场所、器具、食物、饲料等)或病原体宿主所在的环境)的载体。所述的载体可以是但不限于：药学上可接受的载体、食品学上可接受的载体、饲料学上可接受的载体和/或化学上可接受的载体。所述载体通常在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的噬菌体的生物活性的载体。

如本文所使用的，“组合”是指使用多于一种活性物质被联合运用或合并在一起。本发明中，所述“组合”可以是两种噬菌体联合应用所构成的“组合”。

如本文所用，当提及噬菌体或含有其的组合物时，术语“裂解率”、“抗菌活性”和“抗病原体活性”可互换地用于指杀死和/或抑制病原体(尤其是细菌宿主)的生长或繁殖的能力。

噬菌体及其应用

本发明人以大菱鲆源的杀鱼爱德华氏菌为宿主菌，进行了广泛的研究筛选，山东大菱鲆养殖场中的废水中分离得到两株杀鱼爱德华氏菌噬菌体，将天然分离获得的该噬菌体命名为vB_EpP_ZHX、vB_EpM_ZHS，保藏号分别为CCTCC NO：M 20211469(vB_EpP_ZHX)或CCTCC NO：M 20211468(vB_EpM_ZHS)。

本发明的噬菌体是活性生物，一旦获得了本发明的噬菌体，就可以用本领域已知的手段来大批量地制备。这通常是将其与细菌宿主接触、其侵入宿主细胞后大量复制、最终通过裂解宿主细胞而得以释放。

本发明的噬菌体可以是天然分离的vB_EpP_ZHX、vB_EpM_ZHS，也包括其变体，例如对其进行分子遗传操作(如基因组改造)来获得其突变体，从而调整/改进其某一方面的性能，例如通过分子遗传操作(改变其一种或多种蛋白的活性)来进一步促进其侵染宿主的能力、扩展其宿主种类、缩短其在宿主中的潜伏期和/或增强其对宿主的裂解能力。

也即，本发明的噬菌体vB_EpP_ZHX、vB_EpM_ZHS可作为出发噬菌体，通过实验室驯化、遗传育种、分子遗传操作等手段进行进一步改良而获得产量更高或活性更强的衍生型噬菌体。以本发明的vB_EpP_ZHX、vB_EpM_ZHS作为出发噬菌体，通过这些人工操作手段进一步筛选优化获得的噬菌体，也被包含在本发明的整体范围内。

作为一种可选的方式，本发明也提供了分离自本发明的噬菌体的活性生物分子(例如，分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)。由于本发明的噬菌体是全新的，其基因组以及由其基因组所编码的活性多肽也可被包含在本发明中，潜在地其一条多肽或多条多肽的组合也可用于作为抑制细菌宿主的用途或其它用途。所述的抑制可以是部分抑制或全部抑制。例如，分离自所述噬菌体的一条、两条或多条多肽，能够发挥侵染细胞的作用；而其它的一条、两条或多肽多肽则能够发挥溶解细胞的作用。

本发明的噬菌体对水产养殖中的致病性细菌宿主(如杀鱼爱德华氏菌)具有强的裂解效用。根据本发明的实施例，其对于杀鱼爱德华氏菌的裂解率可达97％。从而，可为规模化工业生产噬菌体、用于水产养殖中病原体细菌(尤其杀鱼爱德华氏菌)的抑制提供噬菌体来源。

根据本发明的噬菌体的特点，其具有广泛的应用，包括但不限于如下的应用：

(1)抑制和抑制细菌宿主(如杀鱼爱德华氏菌)的生长；

(2)制备杀灭杀细菌宿主(如杀鱼爱德华氏菌)的产品；

(3)制备抑制细菌宿主(如杀鱼爱德华氏菌)生长的产品；

(4)制备预防和/或治疗细菌宿主(如杀鱼爱德华氏菌)所致鱼类疾病的产品；

(5)制备预防和/或治疗由细菌宿主(如杀鱼爱德华氏菌)引起的炎症反应的产品；

(6)本发明的噬菌体可作为饲料添加剂，或可制备环境消毒剂，作为杀菌的有效成分。

所述的应用中，所述鱼类为可被所述的病原体(细菌宿主)感染的任何鱼类。例如，可以为海水鱼类或淡水鱼类，较佳地为海水鱼类。

本发明的噬菌体可被单独应用，也可与一种或多种其它类型的噬菌体联合应用。

在应用时，本发明的噬菌体或多肽可以单独施用或与载体混合、形成组合物加以施用。

在应用时，本发明的两种噬菌体可组合应用/联合应用，根据本发明的实施例的结果显示，两者的联合应用会产生协同增效的作用(图4)，从而有助于进一步提高针对致病性细菌宿主的抑制作用。

组合物/制剂/试剂盒

本发明提供了一种组合物，其中含有有效量的噬菌体，以及余量的生物学上可接受的载体。本发明的组合物可以另外包含赋形剂或稳定剂。

所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

应理解，只要能够将本发明所述的噬菌体在保持全部或部分活性的情况下递送到所需处理的对象的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为一些优选的方式，所述组合物可以是冻干剂、液体服用剂/注射剂、喷洒剂或喷雾剂。

浓缩型的组合物中活性成分(多肽)的含量较高，如可含有10⁸～10⁹PFU/mL噬菌体含量；而稀释型组合物中活性成分含量较低，例如可以含有10³～10⁶PFU/mL噬菌体含量；中等含量则例如可以是10⁶～10⁸PFU/mL。此外，还可以包含其它合适的成分，如前面所列举的各种生物学上可接受的载体。根据本发明实施例，本发明的噬菌体组合物中，所述噬菌体的剂量大于或等于10³PFU/mL是相对合适的，但考虑到一些特定的应用，本发明也不限于此。

在需要的情况下，本发明组合物中还可以含有其它的活性杀生物剂(可以是生物类杀生物剂，也可以为化学类杀生物剂如抗生素)，以实现通过一次使用而将本发明噬菌体特异性病原体以及其它有害生物进行共同杀灭。

本发明的噬菌体、含有其的宿主细胞或含有其的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。

所述的噬菌体制剂，剂型为口服固体制剂、液体制剂或冻干制剂，可以经过口服、药浴和注射等方式应用于预防和/或治疗杀鱼爱德华氏菌。

本发明的主要优点在于：

(1)筛选、分离到能够专一性高效裂解特定致病性细菌宿主(爱德华氏菌，尤其为杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌)的噬菌体，该噬菌体对水产养殖环境中特定致病性细菌宿主具有强裂解效用，为规模化生产噬菌体、用于水产养殖环境中致病性细菌宿主的防治提供了新的噬菌体源。

(2)本发明提供的噬菌体具有强的感染能力；针对杀鱼爱德华氏菌的潜伏期仅为20-30分钟，爆发量为100-150PFU/细胞；其潜伏期短、裂解量高，是抑制杀鱼爱德华氏菌的优选噬菌体。其组合物在短时间内极显著地阻止杀鱼爱德华氏菌生长。该噬菌体只对鱼源的杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌有裂解作用，不能感染其它细菌，其高度特异性有利于环境安全，故具有毒性低的特点。

(3)本发明提供的噬菌体可用于工业化大规模生产，可由宿主菌杀鱼爱德华氏菌特异性扩增；该噬菌体还可以作为消毒剂用于养殖场水体和养殖池的消毒，从而治疗动物养殖场污染；该噬菌体还用于制备药物，进而用于其细菌宿主、尤其是杀鱼爱德华氏菌引起疾病的预防和治疗。

(4)所述的噬菌体可以清除生物被膜，对微生态环境破坏较小。噬菌体侵染宿主菌后，会产生大量子代噬菌体并进行新一轮感染，从而使用低剂量噬菌体就能起到防治的效果。并且噬菌体的高特异性使得其只能感染其宿主菌，对于环境中的有益菌和哺乳动物细胞没有感染能力。因此，本发明的体作为抗生素替代物具有良好的应用前景。

综上，本发明提供的噬菌体，其具有高效感染、强效裂解、高特异性的特点，其在水产养殖中具有非常理想的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、杀鱼爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的分离鉴定

(1)样品前处理

对辽宁大菱鲆养殖场中废水进行采样，用8层纱布对采集的水样进行过滤，然后将滤液在4℃下进行8000×g离心5min，用孔径为0.22μm的微孔滤膜对离心后的上清液进行过滤，并于4℃保存备用。

(2)噬菌体样品富集培养

取40ml滤液，10ml 5×TSB培养基和1ml对数生长期的杀鱼爱德华氏菌EIB202培养液，加入250ml摇瓶中，以100rpm 28℃过夜培养。取1ml培养液，8000×g离心5min，取离心后的上清液用孔径为0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌。

(3)噬菌体分离

用SM缓冲液对滤液进行梯度稀释，取0.5mL稀释液和0.1mL杀鱼爱德华氏菌EIB202菌悬液混合并常温孵育10min，然后加入55℃左右的半固体TSB培养基，均匀混合后倒于已经提前制备好的TSA固体平板上。在28℃下培养12-24h。观察双层平板上的噬菌斑存在情况。

(4)噬菌体斑纯化

对于平板上出现噬菌斑的情况，用灭菌枪头挑取不同大小的噬菌斑，并于1mL SM缓冲液中反复吹打，放于4℃过夜孵育，然后将噬菌体浸出液进行梯度稀释，用双层平板法观察噬菌斑形态。经过广泛的筛选，本发明获得了两株目标噬菌体，具有优异的保护鱼体免受杀鱼爱德华氏菌侵害的性能、而且特异性强，不对其它物种构成影响，它们的详细的形态鉴定以及性能鉴定见后述。

本发明人将所获得的噬菌体分别命名为vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX。该vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的噬菌斑示意图由图1。

根据图1可知，该杀鱼爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX形成的噬菌斑呈透明圆形，直径分别约为0.6～0.8mm和1.4～1.8mm。

(5)过滤除菌及保存

将纯化后的噬菌体培养液在8000×g离心5min，取离心后的上清液用孔径为0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，在滤液中加入甘油使终浓度为30％，于-80℃保存。

(6)测定噬菌体效价

将噬菌体培养液8000×g离心5min，将上清液过0.22μm滤膜，将滤液用SM缓冲液进梯度稀释，用稀释液制作以杀鱼爱德华氏菌EIB202为宿主菌的双层平板，于28℃恒温倒置培养。

噬菌体效价(pfu/mL)＝噬菌斑个数×稀释倍数。

经测定，所述噬菌体的效价可以达10⁹PFU/mL。

实施例2、噬菌体的形态观察

用磷钨酸负染法对噬菌体样品进行前处理。取20μL经0.22μm滤膜过滤后噬菌体培养液滴加在铜网上，10min后用吸水纸将多余的液体吸干。在室温下静置2min，将20μL 2％磷钨酸染色滴加在铜网上，染色30s后立即用吸水纸吸去将多余的磷钨酸溶液。在室温下静置5min，用透射电子显微镜观察噬菌体形态。杀鱼爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的电镜图如图2。

根据图2所示，噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX头部为二十面体，根据噬菌体分离与命名的规则、以及该噬菌体形态来分析，其属于有尾噬菌体目。噬菌体vB_EpM_ZHS为肌尾噬菌体科，尾部由中空的结构及外鞘组成，该噬菌体头部长88nm，宽92nm，尾部长度为148nm。噬菌体vB_EpP_ZHX为短尾噬菌体科，头部长68nm，宽63nm，尾部长度为19nm。

实施例3、噬菌体生长曲线的测定

将噬菌体与1ml杀鱼爱德华氏菌菌悬液以1:100的感染复数混合，孵育10分钟，在12,000×g下4℃离心2分钟。用1ml TSB培养基重悬沉淀，并重复3次。将悬浮液加入10mlTSB中，并在28℃振荡培养。用双层平板法测定噬菌体效价，每10分钟测定噬菌体的滴度。通过将最终噬菌体滴度除以初始噬菌体滴度来计算爆发大小。所述爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的一步生长曲线图如图3所示。

根据图3，噬菌体vB_EpM_ZHS在感染宿主菌后30min内效价没有明显变化，说明其潜伏期约30min，感染后30-60min内噬菌体的效价逐渐增加，说明噬菌体裂解期约为30min。噬菌体vB_EpP_ZHX的潜伏期约20min，感染后20-40min内噬菌体的效价逐渐增加，说明噬菌体裂解期约为20min。

通过计算，噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的裂解量分别为150PFU/细胞和123PFU/细胞，说明该两种噬菌体有很强的复制能力和裂解能力。

实施例4、噬菌体宿主谱

将所测试的细菌菌悬液涂布于TSA平板上，将10μl爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX分别滴加在平板上，28℃培养12小时。若产生抑菌圈则说明噬菌体对该菌有裂解能力；若无抑菌圈则说明噬菌体无法感染该菌。

结果如表1所示，两株噬菌体都可以感染鱼源的杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiellapiscicida)和鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)，对鲶爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)，保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)，人源的迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和其它种类的细菌(如杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、大肠杆菌Escherichia coli)没有感染能力。证明该噬菌体具有高度特异性。

表1、爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX的宿主谱

实施例5、裂解率实验

取1mL噬菌体vB_EpM_ZHS和vB_EpP_ZHX和1mL杀鱼爱德华氏菌EIB202菌液在28℃孵育10分钟，用SM缓冲液梯度稀释，将稀释液涂布于平板上进行平板菌落计数，于28℃培养24小时。同时以1mL SM缓冲液和1mL宿主菌EIB202菌液在28℃孵育10分钟作为对照组。

噬菌体的裂解率＝(1-实验组菌落数/对照组菌落数)×100％。

测定结果显示，杀鱼爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS或vB_EpP_ZHX的裂解率均能超过97％，对宿主有非常理想的裂解效果，适合在水产养殖过程中使用。

实施例6、噬菌体对宿主裂解曲线

在96孔板中将2μL处于对数生长期的细菌宿主悬浮液和噬菌体溶液以感染复数为10:1加入至100μL 2×TSB培养基，用去离子水将最终体积补充至200μl，28℃振荡培养18h。以不加噬菌体溶液作为对照。用酶标仪每隔1分钟检测OD600，结果如图4所示。

根据图4，当体系中没有加入噬菌体时，随着宿主菌的生长，OD₆₀₀在1小时内缓慢增加，在1-7小时内呈指数增加，在7-18小时内缓慢增加。以噬菌体vB_EpM_ZHS处理的宿主菌生长明显减慢，可以抑制超过25％的宿主菌；以噬菌体vB_EpM_ZHX处理的宿主菌生长明显减慢，可以抑制超过60％的宿主菌；当以噬菌体vB_EpM_ZHX和vB_EpM_ZHS组合(两者等量(1:1)混合处理时，宿主菌无明显生长。

根据上述结果可见，vB_EpM_ZHX和vB_EpM_ZHS各自均能显著地抑制宿主菌，而两者一起应用时则发挥了协同增效作用，对于宿主菌的抑制效果尤其理想。

实施例7、噬菌体治疗杀鱼爱德华氏菌感染效果评价

选取大菱鲆(30克±2克)作为试验用鱼，随机分为3组，分别为噬菌体治疗组(EIB202+Phage(噬菌体vB_EpM_ZHX和vB_EpM_ZHS组合))、攻毒对照组(EIB202)和空白对照组(Mock)，每组20尾。以2×10⁸CFU/ml的杀鱼爱德华氏菌(EIB202)对噬菌体治疗组和攻毒对照组进行浸泡注射攻毒30分钟，空白对照组用PBS溶液浸泡。随后以1×10⁸PFU/ml vB_EpM_ZHX和1×10⁸PFU/ml vB_EpM_ZHS组合对噬菌体治疗组进行浸泡治疗，攻毒对照组和空白对照组用PBS溶液浸泡。养殖40天观察大菱鲆死亡情况。

由图5可见，空白对照组在40天内没有鱼死亡，攻毒对照组的存活率为35％。噬菌体治疗组存活率超过70％。

噬菌体治疗组的存活率均极为显著地高于攻毒对照组，说明本发明所述的杀鱼爱德华氏菌噬菌体可以高效保护鱼体免受杀鱼爱德华氏菌侵害。

同时，本发明人将该噬菌体的应用于多种多样的其它生物以观测其专一性/特异性，结果未观测到对于环境中其它生物的毒副作用。

生物材料的保藏

本发明的杀鱼爱德华氏菌噬菌体vB_EpP_ZHX(Edwardsiella piscicida phagevB_EpP_ZHX)已在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)保藏，保藏日期：2021年11月22日，其保藏编号为CCTCC NO：M 20211469。经保藏中心检测为存活的噬菌体。

本发明的杀鱼爱德华氏菌噬菌体vB_EpM_ZHS(Edwardsiella piscicida phagevB_EpM_ZHS)已在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)保藏，保藏日期：2021年11月22日，其保藏编号为CCTCC NO：M 20211468。经保藏中心检测为存活的噬菌体。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (22)

1.分离的爱德华氏菌特异性噬菌体，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO：M 20211469或CCTCC NO：M 20211468；其中所述爱德华氏菌是杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。

2.权利要求1所述的噬菌体或噬菌体组合的应用，用于制备特异性抑制其细菌宿主的组合物，其细菌宿主包括：杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌。

3.如权利要求2所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述组合物为药物组合物、清洁剂或消毒剂。

4.如权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述药物组合物为疫苗组合物，该疫苗组合物预防所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病。

5.如权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述药物组合物为治疗组合物，该治疗组合物治疗所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病；所述鱼类疾病包括：炎症疾病。

6.如权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。

7.一种用于抑制爱德华氏菌的组合物，其包含权利要求1所述的噬菌体或噬菌体组合；其中所述爱德华氏菌是杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，其还包含生物学可接受的载体。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物中噬菌体大于或等于10³PFU/mL。

10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物中噬菌体为10³～10¹⁰PFU/mL。

11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物中噬菌体为10⁴～10⁹PFU/mL。

12.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的噬菌体组合为CCTCC NO：M20211469与CCTCC NO：M 20211468的组合，两者的在组合中的含量为1～10:10～1。

13.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物、清洁剂或消毒剂。

14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物为疫苗组合物，该疫苗组合物预防所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病。

15.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物为治疗组合物，该治疗组合物治疗所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病；所述鱼类疾病包括：炎症疾病。

16.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。

17.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型包括：液体制剂或固体制剂。

18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型包括：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

19.一种应用权利要求1所述的噬菌体制备组合物的方法，包括：扩增培养权利要求1所述的噬菌体或噬菌体组合；将之与载体混合，所述的载体为生物学可接受的载体。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述扩增培养包括：将所述噬菌体或噬菌体组合接种至细菌宿主培养物，从而所述噬菌体侵染其宿主，进行复制；其中所述细菌宿主为杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌。

21.一种抑制爱德华氏菌的非治疗性的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1所述的噬菌体或噬菌体组合、或权利要求7-18任一所述的组合物对需要进行细菌抑制的对象进行处理；所述的细菌是能被所述噬菌体感染、进而裂解的细菌，包括：杀鱼爱德华氏菌和鳗鲡爱德华氏菌。

22.一种用于抑制爱德华氏菌的试剂盒或药盒，其特征在于，其中所述的爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌或鳗鲡爱德华氏菌，所述试剂盒或药盒包含：

权利要求1所述的噬菌体或噬菌体组合；或

权利要求7-18任一所述的组合物。