CN103282498A

CN103282498A - 用于细胞永生化的方法和载体

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Publication number: CN103282498A
Application number: CN2011800523329A
Authority: CN
Inventors: 托比亚斯·迈; 汉斯约尔格·豪泽; 弗兰齐斯卡·舒勒; 珍妮特·绍尔斯; 罗兰德·舒赫特
Original assignee: HELMHOLTZ INFEKTIONSFORSCHUNG
Current assignee: HELMHOLTZ INFEKTIONSFORSCHUNG
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2013-09-04
Also published as: EP3257943A2; DK3257943T3; AU2011325439A1; EP3257943A3; CA2814704C; US9453203B2; CA2814704A1; EP3257943B1; WO2012059223A1; US20130273550A1; JP6147191B2; AU2011325439B2; JP2014503190A; EP2635682B1; EP2635682A1; JP2016165265A

Abstract

本发明涉及不依赖于细胞类型的用于细胞永生化的方法和载体。其还涉及使用本发明的方法或载体产生的细胞或细胞系。本发明还涉及该细胞或细胞系在体外应用中以及在疾病治疗中的用途。

Description

用于细胞永生化的方法和载体

背景技术

细胞系用于基础研究以及应用学科例如蛋白质生产、药物开发和毒性测试中，并且还用于再生医学方法的疗法中。现有细胞模型的问题是他们缺乏生物相关性或者无法得到足量的细胞。但是，分子过程的阐明在很大程度上依赖于合适的细胞系。因此，对于现代生命科学而言，令人极为感兴趣的是可以足够的量产生的反映体内特性的细胞。

基本上，细胞可得自两种不同来源：它们可以作为原代细胞从个体/动物中分离，或者它们由细胞系提供。原代细胞的优点是它们接近地反映细胞在体内的特性。遗憾的是，该高生物相关性与若干缺点相关，例如繁琐且耗时的分离过程、批与批之间的高可变性及复杂的培养条件。阻碍原代细胞的更广泛应用的主要限制是其显著限制扩增的有限的增殖能力。在另一方面，细胞系是从肿瘤分离的或者是基于原代细胞自发或诱导的永生化而产生的。细胞系的细胞可不受限地得到，它们是均质的，示出恒定的特性，易于操作和维持。但是，这些细胞因此缺乏分离出它们的组织的许多特征和标志物。

建立新细胞系的主要限制是：(i)不可预测性，例如，原代细胞材料的自发永生化的不可预测性；(ii)只借助于已知的永生化基因(例如，SV40大T抗原(TAg)或乳头瘤病毒的病毒癌基因E6/E7)的常规永生化方案导致细胞生理学的极大改变这一事实。因此，这些细胞系不再反映体内状态的生理学，因而在这些细胞系统中生物相关性消失；(iii)不存在通用的系统，即没有能够从任何细胞类型、不同供体及不同物种建立细胞系的单一永生化基因。

自发永生化可发生在得自肿瘤的原代细胞材料中，或者在罕见的情况下也发生在非恶性或良性原代细胞中。这些细胞系易于维持和扩增直至建成稳定增殖的细胞系。该过程的总体成功率低，因此必须可获得大量的原代细胞材料。因为该过程的随机性，所以无法对所得细胞系的特性施加影响，并且大多数所得细胞系并不合适地反映其来源。

常规永生化方案通常利用癌基因的重组表达，所述癌基因例如人端粒酶的催化亚基(hTert)、SV40大T抗原(TAg)、多梳蛋白(polycombprotein)Bmi1或人乳头瘤病毒的病毒癌基因E6/E7、病毒癌基因E1A/E1B。频繁使用的永生化基因是hTert，已证实其可用于多种细胞类型的扩增(Bodnar AG，Ouellette M，Frolkis M等.Science.1998年1月16日；279(5349)：349-352.)。它通过维持端粒的末端起作用。端粒是线性染色体最末端处的重复DNA延伸。这些延伸不能在复制过程中通过DNA聚合酶复制，因此随着每一轮复制端粒逐渐地缩短。可以通过最终可导致永生化的hTert的重组表达来解决该“末端复制问题”。被扩增并用于组织工程的细胞类型包括例如牛肾上腺皮质细胞(参考)、人真皮内皮细胞(Yang J等，Nat Biotechnol.2001年3月；19(3)：219-224)和人间充质干细胞(Simonsen JL等，Nat Biotechnol.2002年6月；20(6)：592-596)。

但是，端粒酶组成型表达的延长诱导导致恶变前表型的基因表达变化(Milyavsky等，Cancer Res.2003年11月1日；63(21)：7147-7157)。另外，hTert的使用限于某些人细胞类型，因为其它细胞类型需要若干基因的协同作用来高效永生化(Kiyono T等，Nature.1998年11月5日；396(6706)：84-88)。此外，相对于来自其它哺乳动物的细胞(例如，鼠细胞)，人细胞需要不同的永生化策略(Rangarajan，A.，等，Cancer Cell，2004年8月；6(2)：171-83)。这导致hTert无法建立鼠细胞系的事实。另一常用于永生化的基因是TAg。TAg是已知调节许多蛋白质活性的病毒癌基因。在这些蛋白质中，认为对于永生化而言最重要的是p53和pRb。TAg与p53的结合抑制p53介导的生长控制。但是，p53失活也导致对DNA损伤应答的干扰，其进而导致宿主细胞染色体的DNA损伤。TAg还干扰pRb(成视网膜细胞瘤蛋白)肿瘤抑制因子。通过该相互作用/抑制，转录因子E2F被活化，这是细胞进展通过细胞周期的原因。但是，TAg仅可用于建立啮齿类动物细胞系。对于人细胞的永生化，(i)只有TAg是不够的并且因此必须使用第二癌基因，其通常为hTert，以及(ii)所得细胞系的特征通常在于总体改变的核型，其最可能是由于p53驱动的DNA损伤应答的失活。

促进永生化的另一些基因是人乳头瘤病毒的E6和E7蛋白。它们干扰细胞周期控制和凋亡的调节。E7通过与pRB家族成员结合来抑制它们的功能，从而通过破坏pRb-E2F复合物在细胞进入S期时促进细胞周期进展。另一方面，已知E6促进p53的降解，从而通过p53破坏生长控制。E6的另一功能是诱导通过维持端粒长度来支持细胞永生化的端粒酶活性。对于人细胞的永生化而言，需要E6和E7这两种蛋白质。但是，这些基因的组合主要对上皮细胞的永生化起作用。另一缺点是这些基因诱导基因组不稳定性，使得所建立的细胞系是多倍体。

其它癌基因似乎是细胞类型特异性的，因为它们只对某些物种的非常有限的细胞类型起作用，例如，HoxA9/HoxB9对鼠巨噬细胞(Wang等，Nat Methods.2006年4月；3(4)：287-93.)。其它实例是(i)使鼠/啮齿类动物巨噬细胞永生化的v-myc癌基因(Pirami等，Proc Natl Acad Sci U S A.1991年9月1日；88(17)：7543-7.)，(ii)易于永生化人B淋巴细胞的EB病毒(Henle等，Science.1967年9月1日；157(792)：1064-5.)或(iii)建立鼠胚胎内皮细胞的多瘤中T抗原(Williams等，Cell.1989年6月16日；57(6)：1053-63.)。

总而言之，这样的常规永生化技术极经常产生极大改变的或突变的细胞系。为了绕过这个问题，采取可控制永生化基因的作用的方法。例如，在WO2010/000491A1中，将至少两种永生化基因置于转录调节控制下。在该设置中，将永生化基因引入原代细胞中并通过外界刺激活化，其导致相应原代细胞的永生化。外界刺激的撤销进而导致永生化基因的失活。该步骤在这些永生化细胞系中高效地诱导衰老表型-特征在于完全生长停滞的细胞状态并且其为肿瘤抑制机制。因此，WO2010/000491A1中所述的技术产生仅用于非常专门的研究领域的细胞系。

因此，本领域仍需要不依赖于物种和细胞类型的用于从多种原代细胞产生细胞系的方法。

发明概述

本发明涉及用于使具有有限寿命的细胞永生化的方法，其包括以下步骤：

(i)提供具有有限寿命的细胞，

(ii)从以下类别的至少两类中各自向所述细胞提供至少一种基因、基因产物或其功能替换：

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或基因产物或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或基因产物或其功能替换，

并任选地提供促进选择已转导细胞的一种或更多种基因或基因产物。

此外，本发明涉及使用该方法可产生的细胞或细胞系。另外，本发明涉及包含至少一个表达盒的载体，所述表达盒包含与至少一种基因有效连接的表达控制序列；或涉及各包含至少一个表达盒的载体组合，所述表达盒包含与至少一种基因有效连接的表达控制序列，其中所述载体或载体组合指导各自选自以下类别之一的至少两种基因以及任选的促进选择已转导细胞的一种或更多种基因或基因产物的表达：

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或其功能替换。

本发明还涉及所述细胞或细胞系或者所述载体或载体组合在以下中的用途：细胞测定(例如，测试细胞对化合物的应答)、建立3d细胞培养模型组织工程、与一种或更多种不同细胞系的细胞共培养，和/或细胞包封。此外，本发明涉及所述细胞或细胞系或者所述载体或载体组合用于治疗或预防退行性疾病、器官或细胞的损伤/功能失常、感染性疾病、与免疫系统相关的病症、癌症、心理病症或肥胖症。

本发明的该概述不必然描述本发明的全部特征。

发明详述

在下文中对本发明进行详述之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语与本领域普通技术人员所通常理解的含义相同。

优选地，本文所使用的术语如″A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和Kolbl，H.编著.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland)中所述的定义。

在本说明书的正文中引用了若干文献。无论是在上文中还是在下文中，本文所引用的文献(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南、GenBank序列提交登记号等)均通过引用整体并入本文。本文中的内容都不应解释为承认本发明因在先发明而不具有先于这些公开内容的权利。

在下文中，将对本发明的要素进行描述。这些要素以特定实施方案列举，但是，应理解，它们可以以任何方式及任何数目组合以产生其它实施方案。不应将以多种方式描述的实施例和优选的实施方案解释为本发明仅限于明确描述的实施方案。应理解该描述是为了支持和涵盖这样的实施方案：与任意数目的所公开的和/或优选的要素组合的明确描述的实施方案。此外，除非上下文中另有指明，否则应认为本申请中全部所述元素的任何变更和组合由本申请的说明书公开。

在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文中另有要求，否则应理解措辞“包含”及变体例如“包括”和“含有”表示包含所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容清楚地另有指明，否则未使用数量词时包括复数的情况。

(i)提供具有有限寿命的细胞，

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或基因产物或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或基因产物或其功能替换，

及任选地提供促进选择已转导细胞的一种或更多种基因或基因产物。

在一个优选的实施方案中，所述方法还在步骤(ii)之后包括在永生化细胞中终止或减慢增殖，诱导衰老和/或诱导分化的任选的步骤(iii)。优选地，这通过部分或完全沉默、失活和/或去除所述基因或基因产物或其功能等同物来实现，例如使用DNA重组酶例如cre重组酶(Salmon等，MolTher.2000年8月；2(4)：404-14)，或可通过例如四环素来启动和关闭的启动子系统，如

或

系统。

术语“具有有限寿命的细胞”指不分裂细胞，即在其生命过程中不分裂的细胞；和/或缓慢分裂的细胞，即在其来源生物体中不以通过细胞分裂产生其它细胞作为主要或唯一目的的细胞；和/或具有衰老机制的细胞，即在从组织中分离之后经历有限数目的细胞分裂以停止分裂的原代细胞；和/或进入凋亡的细胞，即从组织分离之后直接进入细胞凋亡或者从组织分离之后在进入凋亡之前经历有限数目的细胞分裂的原代细胞。因此，该术语排除胚胎干细胞。在一个优选实施方案中，其指来自外胚层、内胚层或中胚层谱系的细胞。所述细胞可以是生长停滞的细胞(例如，阻断在细胞周期的不同阶段的细胞，即，G0、G1、S、G2、前期、前中期和中期)、非增殖细胞、有丝分裂后细胞或非有丝分裂细胞、静息细胞、良性细胞、衰老细胞、体外分化的胚胎干细胞、体外分化的经诱导多能干细胞、终末分化的细胞，优选为原代细胞。优选的细胞是选自以下的细胞：脂肪细胞、成体干细胞、星形细胞、B细胞、心肌细胞、软骨细胞、角膜上皮细胞、树突细胞、内分泌细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、粒细胞、造血细胞、造血干细胞、肝细胞、角质形成细胞、肠上皮细胞、肝细胞、I型肺上皮细胞、II型肺上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、乳腺上皮细胞、黑素细胞、系膜细胞、间充质干细胞、肌细胞、成肌细胞、自然杀伤细胞、神经元细胞、神经元干细胞、嗜中性粒细胞、成骨细胞、胰腺β细胞、周细胞、前脂肪细胞、祖细胞、前列腺上皮细胞、肾上皮细胞、肾近端小管细胞(renal proximal tubule cell)、视网膜色素上皮细胞、塞尔托利细胞(sertoli cell)、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞、基质细胞、T细胞及所述细胞类型的亚类型。所述细胞是非哺乳动物细胞(例如，来自鱼或鸟物种)或哺乳动物细胞(例如，来自小鼠、大鼠、猴、猪、狗、猫、牛、绵羊、山羊)，优选为人细胞。

在本发明的一个优选的方面中，所述具有有限寿命的细胞来自具有已知对医学治疗产生特定应答之特定遗传背景(例如，疾病相关)的个体或个体组，其中所述特定遗传背景优选地与野生型相差至少一个突变、缺失、重复(duplication)、SNP相关变异和/或染色体畸变。可能通过所提及机制之一发生改变的基团是与药物代谢相关的那些基因。其包括细胞色素P450酶的不同同工型，例如同工型CYP2D6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP1A1、CYP3A4、CYP3A5、CYP2A6、CYP2B6、CYP2E1。

另一些可能受影响的基因是参与药物转运的那些，例如三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)家族的转运子。总计有48个已知的ABC基因，其中ABCB1(P-糖蛋白，多药耐药性[MDR]1)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP、MXR、ABCP)和ABCC2(MRP2)是最突出的。另外，吸收转运子例如有机阴离子转运蛋白(OATP)(例如，OATP1B1和OATP1B3)可通过上述机制改变其功能。

已知另一些参与药物代谢的基因对遗传背景也有这样的依赖性，例如硫代嘌呤s-甲基转移酶(TPMT)、N-乙酰转移酶2(NAT2)、UDP葡萄糖醛酸转移酶1家族多肽A1(UGT1A1)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、酯酶、硫醇甲基转移酶、儿茶酚-O甲基转移酶(COMT)、谷胱甘肽-S-转移酶、组胺甲基转移酶、还原酶、氧化酶、醛氢化酶、单胺氧化酶B、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、三甲胺N-氧化酶、二氢嘧啶脱氢酶。

此外，治疗应答也可以是基因型特异性的。这源自可以通过突变(例如单核苷酸多态性)来调节疾病相关靶基因(例如，G-蛋白偶联受体、离子通道、激酶或酶)的表达的事实。一个实例是阿尔茨海默病，其中载脂蛋白E(APOE)的变体决定发生阿尔茨海默病的风险。APOE-4等位基因与发生阿尔茨海默病的风险相关，而APOE-2等位基因似乎保护免受阿尔茨海默病。另一实例是血管紧张素I转化酶ACE，它是目前用作抗高血压药剂的ACE抑制剂药物家族(卡托普利、依拉普利)的靶标。这些ACE相关多态性变体与例如以下的适应症相关：高血压、动脉粥样硬化、中风、左心室肥厚、心肌梗塞易感性、糖尿病性肾病、阿尔兹海默病。对于哮喘，也已鉴定出受基因型影响的若干药物应答通路。其中有靶向以下的药物：糖皮质激素受体(倍氯米松)、β2-肾上腺素能受体(Albuterol)、5-脂氧合酶(齐留通(zileuton))、半胱氨酸白三烯1受体拮抗剂(扎鲁司特)或毒蕈碱受体3(异丙托溴铵(Ipratropium))。

在癌症中，若干基因例如硫代嘌呤甲基转移酶(TPMT)或二氢嘧啶脱氢酶包括于代谢性抗癌剂中。癌症还突出了一个生物可具有给定基因的不同基因变体的事实。当将癌细胞与非恶性细胞进行比较时，这些差异就显现出来。这些差异可用于靶向治疗。这样的基因变体的实例是人表皮生长因子受体2、融合蛋白BCR-ABL、BRCA1、BRCA2或K-ras。

术语“使细胞永生化”指赋予一种或更多种细胞以超出其天然的程度(即原来的增殖能力)分裂或增殖的能力，例如在其原来的生物体中或者分离并在细胞培养物中维持时的能力。在一个优选实施方案中，所述细胞获得无限的分裂或增殖的能力。术语“永生化的细胞”还包括永生化后的细胞，即这样的细胞，其已经用本发明的方法永生化，但其中增殖被终止或减慢和/或其中已经根据所述方法的上述任选步骤(iii)诱导了衰老和/或分化。因此，除“使细胞永生化”外，可替换地使用术语“扩增细胞”。在本发明意义内的永生化细胞不是转化的细胞，即它们不是致瘤的。永生化细胞优选地为非致瘤的，其中非致瘤细胞优选为显示出以下特征中的至少一个、两个或全部三个的细胞：(i)在软琼脂中不生长，(ii)确实显示出接触抑制，和/或(iii)在免疫受损小鼠(例如SCID小鼠、RAG2γc小鼠或裸鼠)中不引起肿瘤生长。更优选地，所述永生化细胞基本保留所述永生化细胞所基于的所述具有有限寿命的细胞的分化特异性生理特性。基本保留分化特异性生理特性意为细胞或细胞系保留待使用永生化细胞进行研究的具有有限寿命的细胞的至少一个特性。主要地，这将与具有有限寿命之细胞的主要功能(primary function)相关。所述特性明显取决于细胞类型，除下述非限制性实例之外，本领域技术人员还可参照本领域中已知的用于检查细胞特性的方法。保留其所基于的内皮细胞的至少一个特性的永生化内皮细胞系可通过比较来源细胞(即，具有有限寿命的细胞)的一个或更多个以下标志物的表达来表征：CD31(Pecam-1)、Tie2、VEGFR1、VEGFR2(CD309)、CD105、von Willebrand因子和凝血因子VIII，优选CD31、CD105。此外，内皮细胞可通过CD54(ICAM1)、CD62E(E-选择素)和CD106(VCAM)的可诱导表达来表征。该诱导可通过例如TNFα来实现。内皮细胞系还可通过功能测定来表征，所述功能测定检测内皮NO合酶(eNOS)的活性，检测乙酰化形式的低密度脂蛋白(acLDL)的摄取，或者证实细胞系在胞外基质(例如matrigel)上形成管状结构。另外，内皮细胞系可通过移植后的血管形成来表征，例如在免疫受损小鼠中。

永生化软骨细胞细胞系可通过转录因子Sox9或Sox10的表达来表征。另外，软骨细胞细胞系可通过胞外蛋白例如不同胶原蛋白(胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白X)、蛋白聚糖或软骨素4-硫酸盐的产生来表征。

永生化上皮细胞系(例如来自肺、角质形成细胞、肠或肾的上皮细胞)可在功能上通过值为大于50Ω/cm²的跨上皮电阻(TEER)的产生来表征。另外或可替选地，上皮细胞可在功能上通过测定物质通过相应上皮细胞的单层的通透性来表征。另外或可替选地，上皮细胞还可通过外流转运蛋白来表征，所述外流转运蛋白例如p-糖蛋白、多药耐药性基因1a(Mdr1a)、多药耐药性相关蛋白(MRP)1、MRP2、MRP4、MRP5或ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)。神经元细胞系可通过以下的表达来表征：βIII-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、芳香L-氨基酸脱羧酶(AADC)、多巴胺转运子(DAT)、胆碱O-乙酰转移酶(ChAT)、LIM同源框转录因子1、β(LMX1B)和微管相关蛋白2(MAP2)。神经元细胞还可通过测量动作电位来表征。已建立的心肌细胞系可在功能上通过自发搏动来表征。另外，它们还表达2型肌钙蛋白T(心脏)(TnTc)、肌细胞增强因子2C(MEF2C)、肌球蛋白，轻链7，调节性(MYL2A)、肌球蛋白，重链7，心肌，β(MYH7)或NK2转录因子相关，基因座5(NKX2.5)。已建立的肝细胞可通过以下的表达来表征：白蛋白、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子4、α(HNF4a)、细胞角蛋白18(CK18)、Sox17、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EPBa)、α-1-抗胰蛋白酶或Mrp2。另外，肝细胞系可在功能上通过测量药物代谢I期组分(通过细胞色素p450之一，例如，CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4或CYP2E1)和药物代谢II期组分(例如，通过UDP-葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽S-转移酶、磺基转移酶、N-乙酰转移酶或氨基酸N-酰基转移酶)的活性或胆汁输出(通过ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员11(ABCB11))来表征。由胰腺β细胞建立的细胞系可通过以下的表达来表征：ISL LIM同源框1(ISl-1)、Pax6、NKx6.1、Pdx-1、激素原转化酶1/3或激素原转化酶2。它们可在功能上表征为应答于葡萄糖分泌胰岛素。T淋巴细胞细胞系可通过CD3、CD4、CD8、CD25、CD28或T细胞受体的表达来表征。它们可在功能上通过测量细胞毒素(例如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素)的释放来表征。B-淋巴细胞细胞系可通过CD19、CD20或IL7受体的表达来表征。另外，它们可在功能上通过抗体的产生来表征。由间充质干细胞建立的细胞系可通过CD73、CD105或CD271的表达来表征。它们可在功能上通过其分化为成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞的能力来表征。由造血干细胞或造血祖细胞建立的细胞系可通过c-kit、Sca1、CD34、CD150、CD48或CD244的表达来表征。它们可在功能上通过其分化为所有种类的血细胞类型的能力来表征，所述血细胞类型例如骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板或树突细胞)和淋巴细胞(T细胞、B细胞或NK细胞)。另外，它们可在功能上通过其在体外形成集落(CFU-集落形成单位)的能力来表征。它们还可通过在放射或损坏宿主骨髓的其它治疗(例如环磷酰胺)之后其拯救个体(例如，小鼠)的能力来表征。

因此，本发明还涉及使用本发明的方法可产生的细胞或细胞系。优选地，在至少两种以下类别的每一类中所述细胞包含至少一种基因、基因产物或其功能替换以及任选的促进选择已转导细胞的一种或更多种基因或基因产物：

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或基因产物或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或基因产物或其功能替换。

本发明还涉及包含至少一个表达盒的载体，所述表达盒包含与至少一种基因有效连接的表达控制序列，或涉及各包含至少一个表达盒的载体组合，所述表达盒包含与至少一种基因有效连接的表达控制序列，其中所述载体或载体组合指导各自选自以下类别之一的至少两种基因以及任选的促进选择已转导细胞的一种或更多种基因或基因产物的表达：

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或其功能替换。

术语“有效连接”表示重组基因或编码序列与一个或更多个表达控制序列以使得当引入细胞时核酸序列表达的方式连接，其中表达的时间和量取决于表达控制序列。术语“表达盒”指能够表达重组基因或编码序列的核苷酸序列。表达盒包含与一个或更多个重组基因或编码序列有效连接的一个或更多个表达控制序列，以实现由基因或编码序列编码的蛋白质产物在细胞中表达或者实现RNA分子(例如，充当调节子的RNA分子，例如miRNA)表达。优选地，选自上述类别中的每一类的至少两种或三种基因包含在一个载体上，优选地在一个表达控制序列的控制下。在后者的实施方案中，优选至少两个或三个基因被转录为一个mRNA，但独立地翻译。这可通过引入所谓的内部核糖体进入位点(IRES)来实现。

在许多实施方案中，所述载体是病毒载体，优选为逆转录病毒载体，更优选为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体；非病毒载体，优选为质粒、细菌人工染色体或粘粒；和/或非整合载体例如附加体载体(episomal vectors)、微环(minicircle)或非整合逆转录病毒或慢病毒载体。在又一实施方案中，所述表达盒包含允许去除、调节或沉默其中所含基因的系统。这样的系统的实例是使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶例如cre重组酶(Salmon等，Mol Ther.2000年10月；2(4)：404-14)、Flp重组酶、Phi31整合酶、大范围核酸酶或改造的锌指核酸酶；或者使用转录调节系统，所述转录调节系统例如Tet系统、T-Rex系统、AIR系统、红霉素系统、PIP系统、Rheoswitch系统、cumate系统、香豆霉素系统、NICE系统。

可通过本领域中已知的转导方法将包含表达盒的载体引入细胞，例如，质粒转导，其可通过例如电穿孔、磷酸钙转染或脂质体转染来实现或者通过用病毒载体感染细胞。表达盒可以整合或不整合入染色体，或者可存在于染色体外，例如，作为微环或者以其他附加体形式，其可通过例如EB病毒核抗原(EBNA)或SV40大T抗原维持。另一实例是递送染色体外表达盒，其由病毒例如腺病毒递送。

在一个实施方案中，在提及上述两种方法时，用其产生的细胞或细胞系和所述载体或载体组合、所述基因或基因产物是细胞基因或基因产物。此外，优选至少一种基因、基因产物或其功能替代物来自类别(a)，即，特别优选类别(a)与(b)以及类别(a)与(c)的组合。甚至更优选至少一种基因、基因产物或其功能替换来自类别(a)、(b)和(c)的每一类。

术语“促进BMP信号转导活化的基因”指编码这样的基因产物的基因，所述基因产物诱导通过BMP I型受体(BMPR-I)的信号转导(例如BMPR-IA(ALK3)和BMPR-IB(ALK6)所属的)。这些受体可例如由内源配体例如BMP2或BMP4活化。BMPR-I受体的下游信号转导活化R-SMAD蛋白。SMAD1、SMAD5和SMAD8是BMP信号转导的与共同伴侣SMAD(co-SMAD；SMAD4)形成复合物的R-SMAD。然后，该R-SMAD与co-SMAD复合物易位入核以调节靶基因的转录(Miyazono等，J Biochem.2010年1月；147(l)：35-51.)。因此，术语“促进BMP信号转导活化的基因产物”指编码的蛋白质。这样的基因的优选实例编码DNA结合抑制因子(Id)家族的成员，其为包含螺旋-环-螺旋(HLH)结构域但不含碱性结构域(basic domain)的转录调节因子。因此，这些蛋白质是显性抑制(dominant negative)螺旋-环-螺旋蛋白质。在促进BMP信号转导活化的基因的上下文中，术语“其功能替换”指编码BMP2、BMP4、ALK3、ALK6、SMAD1、SMAD5、SMAD8的基因。优选地，术语“Id基因或Id蛋白质的功能替换”是调节Id基因家族成员之表达的基因或编码蛋白。所述Id家族成员优选地选自：Id1、Id2、Id3和Id4。Id基因家族成员的功能替换优选为上调一个或更多个Id基因家族成员的基因。Id家族成员例如通过以下上调：参与β-联蛋白/T细胞因子(TCF)信号转导通路、骨形态发生蛋白信号转导通路(BMP)、Erk/MAPK信号转导通路、哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路、成纤维细胞生长因子(FGF)-2信号转导通路、JAK2-STAT5信号转导通路的基因、活化蛋白(activin)、HiF-1、h-ras、Sp1、AP-1、E2F1、Pax3、Pax7、n-Myc或c-Myc。另外，Id基因家族成员通过突变的p53通路上调。

术语“参与维持多能性的基因”指编码这样的基因产物的基因，所述基因产物参与(i)多能性回路(Loh等，Cell Cycle.2008年4月1日；7(7)：885-91.Molecular framework underlying pluripotency)和/或(ii)体细胞的重编程(Maherali和Hochedlinger，Cell Stem Cell.2008年12月4日；3(6)：595-605，Guidelines and techniques for the generation of inducedpluripotent stem cells.)。因此，术语“参与维持多能性的基因产物”指编码的蛋白。在一个优选实施方案中，所述参与维持多能性的基因或基因产物选自：Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Lin28、miR290簇(miR290cluster)、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4、Utf1、Tcl1和Dppa3。这样的基因产物的优选实例是其靶基因参与维持多能性的转录调节子。该类的优选成员包括：Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4和Utf1。优选的是所述选择包括：Nanog、Klf4和/或Sox2，更优选Nanog、Sox2；或Nanog和Sox2。或者，特别优选Klf4。

术语“促进细胞周期进展的基因产物”指促进通过以下细胞周期之一的进展的基因：G1/G0期、S期、G2期和M期(The Cell，第二版，AMolecular Approach，Geoffrey M Cooper.Boston University，Sunderland(MA)：Sinauer Associates；2000)。优选地，这样的基因编码这样的基因产物，所述基因产物通过失活肿瘤抑制因子基因p53、p21、pRB、p16Ink4a、p19ARF、p14ARF或p27或所编码蛋白质的至少一种来起作用。优选地，所述促进细胞周期进展的基因或基因产物直接或间接活化至少一种细胞周期蛋白或抑制其阻遏。在一个优选实施方案中，促进细胞周期进展的基因来源于细胞或病毒。细胞来源的促进细胞周期进展的基因的优选实例选自：Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、β-联蛋白、Lmo2、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白b、细胞周期蛋白d、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7和Rex，并且其中所述选择优选地包括Fos、Myc、RhoA、Myb、β-联蛋白、Lmo2、Yap1、Suz12Ezh2、Bmi1和/或Rex，更优选Fos、Myc和/或Ezh2。病毒来源的促进细胞周期进展的基因的优选实例选自：E7、Core、E1a、E1b、E6、vGPCR、Sv40大T抗原，其中所述选择优选地包括E7、Core、E6和/或SV40大T抗原，更优选E7和core。

在每种情况下，除非所提及的蛋白质是病毒蛋白质(例如E7或Sv40大T抗原)，否则优选使用各个所示基因的哺乳动物、更优选人、猿或啮齿动物的同源物。包括所示基因的变体，其保留根据类别(a)、(b)和/或(c)的基因的相应能力，并且各基因编码的蛋白质与分别在下表1中显示的基因所编码的人、小鼠或病毒蛋白质有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、98％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的氨基酸同一性。优选地，在各参考蛋白质的全长上确定同一性水平。

在一个特别优选的实施方案中，所述促进细胞周期进展的基因或基因产物选自：Fos、E7、Ezh2和Myc，最优选Myc。所述参与维持多能性的基因或基因产物选自Nanog和Sox2，所述Id家族成员选自：Id1、Id2、Id3和Id4。

在另一实施方案中，选自Bcl-2、Bcl-X1、HoxB4、Tlx1、vGPCR、HoxA9、Hoxb8、Stat3、ZFP217中的一种或更多种其它基因表达于所述细胞中，其中所述选择优选地包括Bcl-2、HoxA9和/或ZFP217。

特别地，优选的组合包括至少：(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Nanog；和(c)EZH2；或(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Nanog；和(c)Fos；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Nanog；和(c)Myc；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Nanog；和(c)E7；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Sox2；和(c)EZH2；或(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Sox2；和(c)Fos；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Sox2；和(c)Myc；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Sox2；和(c)E7；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Klf4；和(c)EZH2；或(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Klf4；和(c)Fos；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Klf4；和(c)Myc；(a)Id1、Id2、Id3或Id4，优选Id2；(b)Klf4；和(c)E7。

类别a)、b)和/或c)的另一些优选基因组合包括以下基因组合或者由以下基因组合组成：

(i)Id2、Fos、TAg、Id3、E7、Bcl2、Core、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog、Sox2、Ezh2和Rex；

(ii)Id3、E7、Core、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog、Ezh2和Rex；

(iii)core、Id1、Lmo2和Nanog；

(iv)RhoA和Ezh2；

(v)Id2、Fos、Id3、E7、core、Id1和Myc；

(vi)E7和Myc；

(vii)Myb、E7、HoxA9、Core和Myc；

(vii)Id2、Fos、βcat、TAg、Id3、E7、E6、HoxA9、Bmi1、core、Klf4、Id1、Myc、Lmo2和Nanog；

(viii)Sox2、RhoA、Ezh2和Rex；

(ix)Id2、Fos、Id3、core、Klf4、Id1、Nanog、Ezh2和Id4；

(x)Id2、Fos和Id3；

(xi)Klf4、Id1、Lmo2、Yap1和Nanog；

(xii)Sox2、Ezh2、Rex；

(xiii)Id2、Fos、Myb、Id3、E7、Id1、Myc、Nanog、Ezh2和Rex；

(xiv)Fos、Id3、Bmi1、Yap1和Nanog；

(xv)Id2、Fos和Id3；

(xvi)Suzl2、Id4和Rex；

(xvii)Id2、Fos、βcat、TAg、E7、E6、Id1和Myc；

(xviii)Id2、Fos、Id1和Myc；

(xix)Id2、Id1和Myc；

(xx)Id2、Fos和Id1；

(xxi)Fos、Id1和Myc；

(xxii)Id2、Fos、Myc；

(xxiii)Id2、Fos、Myb、Id3和Bcl2；

(xxiv)Id2、Fos、Id3、HoxA9、Id1、Nanog和Ezh2；

(xxv)Id1、Id3、Fos、Ezh2和Nanog；

(xxvi)E7、HoxA9、Sox2和Ezh2；

(xxvii)Id1、Id3、Fos、TAg、E7、HoxA9、Nanog、Sox2和Ezh2；

(xxviii)TAg、Id3、E7、E6、Lmo2、Nanog、Ezh2和ZFP217；

(xxxix)Id2、TAg、E7和Myc；

(xxx)Fos、βcat、TAg、E7、Id1和Myc；

(xxxi)Id2、Fos、TAg、E7和Myc；

(xxxii)Id2、Fos、Id3、E7、core、Klf4、Id1、Lmo2、Nanog、Sox2和Ezh2；

(xxxiii)Fos、Nanog和Ezh2；

(xxxiv)Id2、Fos、TAg、Id3、core、Id1、Lmo2和Nanog；

(xxxv)Id3、E7、Id1、Lmo2、Yap1、Nanog和Ezh2；

(xxxvi)Id2、Fos、Id1和Ezh2；

(xxxvii)Id2、Fos、E7、core、Lmo2和Nanog；

(xxxviii)Id2、Fos、βcat、Id3、E7、Id1、Lmo2和Ezh2；

(xxxix)Id2、E7、Nanog和Ezh2；

(xl)Id2、Myb、Id3、E7、E6、Myc、Yap1、Nanog和Ezh2；

(xli)Id2、Fos、Id3、E7、E6、core、Id1、Lmo2、Yap1、Nanog、Sox2和Ezh2；

(xlii)Id2、Fos、E7、Id1、Lmo2、Yap1、Nanog和Sox2；

(xliii)E7、E6、Bmi1、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog和Sox2；

(xliv)Id2、E7、Myc、Nanog、Sox2和Ezh2；

(xlv)Id2、Fos、Id3、E7、E6、Bcl2、HoxA9、Bmi1、Klf4、Id1、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2和Gli1；

(xlvi)Fos、Id3、E7、Id1、Nanog和Sox2；

(xlvii)Id2、Fos、Id3、E7、HoxA9、Id1、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2和Gli1；

(xlviii)Id3、HoxA9、Myc和core；

(xlix)Myb、Id3、core和Myc；

(1)Id3、Myc、Bcl2、Bmi1和HoxA9；

(li)PymT、Bcl2、Myc、Id3和HoxA9；

(lii)PymT、Myc、core和βcat；

(liii)Id1和Myc；

(liv)Id2和Myc；

(lv)Id3和Myc；

(lvi)Id4和Myc；

(lvii)βcat和Myc；

(lviii)βcat和PymT、Myc；

(lix)βcat和Myc、Bmi1；

(lx)Myc、BcL2和βcat；

(lxi)Myc、HoxA9和ID3；

(lxii)βcat和Myc；

(lxiii)core、Myc和ID3；

(lxiv)Id3、core、Lmo2和Ezh2；

(lxv)Id3、E7、E6、Yap1和Nanog；

(lxvi)Myc、Klf4；

(lxvii)Fos、E7、Klf4、Lmo2；

(lxviii)TAg、Klf4；

(lxix)TAg、core、Klf4；

(lxx)Id3、Klf4、Id4；

(lxxi)Fos、E7、Klf4；

(lxxii)Fos、E7、Klf4、ID4；

(lxxiii)TAg、core；

(lxxiv)ID2、ID3、core；

(lxxv)Bcl2、core、Myc、Rex；

(lxxvi)Id3、Bcl2、core、Myc；

(lxxvii)TAg、Myb、ID3、core、Myc；

(lxxviii)ID2、Bcl2、core、Myc；

(lxxix)TAg、ID3、Bcl2、core、Rex；

(lxxx)TAg、E6、Bcl2、core、ID4、Rex；

(lxxxi)TAg、ID3、Bcl2、core、Myc、Rex；

给定基因或基因产物的“功能替换”指另一基因或基因产物的基因敲低或基因敲除等，其中该另一基因或基因产物拮抗给定基因或基因产物。基因或基因产物敲除可通过本领域中已知的所有合适的方法来实现，例如通过锌指技术或者通过同源重组。基因或基因产物敲低可例如通过RNAi(例如，siRNA、shRNA或反义寡核苷酸)、miRNA技术、吗啉代(morpholinos)、核酶和蛋白质竞争来实现。优选地，通过使用与拮抗给定基因或基因产物的基因或基因产物特异性结合的抗体，或者通过拮抗给定基因或基因产物的基因或基因产物的显性抑制突变体来实现蛋白质竞争。给定基因或基因产物的功能替换还可通过添加导致落入类别(a)、(b)或(c)之一的基因活化或者抑制或下调拮抗类别(a)、(b)和/或(c)的给定基因或基因产物的基因或基因产物的化学物(例如，低分子量分子)来实现。

促进选择已转导细胞的基因或基因产物可以是促进细胞在对细胞存活和/或分裂不利的环境中存活和/或分裂或者便于细胞鉴定和/或分离的基因或基因产物。优选地，所述任选的促进选择已转导细胞的基因或基因产物选自：抗生素(如氯霉素、杀稻瘟菌素

嘌呤霉素、组氨醇、潮霉素B、新霉素、zeocin、博来霉素)、荧光标志物(例如、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、远红荧光蛋白例如HcRedl)、表面标志物(例如截短CD34、低神经生长因子受体)和基因编码标签(例如生物素标签、卤素标签、snap标签)或将非荧光分子转化为荧光分子的酶(例如，β-半乳糖苷酶)。

一般而言，所有上述基因的表达是组成的、可调节的和/或可诱导的。例如，表达可通过使用本领域中已知的合适的启动子来调节。对于组成型表达而言，已知的管家基因启动子或组成型病毒启动子特别合适。实例包括组成型病毒CMV、SV40、RSV、MLV和SFFV启动子。组成型哺乳动物启动子的实例是PGK、泛素和EF1α启动子。可调节的或可诱导的启动子(其中数百种已为本领域技术人员所知)优选地由物理因素(例如，光、温度等)或生物/化学因素(蛋白质、化合物等)来诱导。

例如，对于可调节/可诱导表达而言，可采用转录调节系统，例如基于tet调节系统的转录调节系统。Tet调节系统在本领域中是已知的，例如，描述于Corbel，S.Y等(2002，Curr.Opin.Biotechnol.13：448-452)中。通常，将四环素或Doxocycline分子用作tet系统的合适配体。其它转录系统包括但不限于AIR系统、红霉素系统、PIP系统、Rheoswitch系统、cumate系统、香豆霉素系统、NICE系统和T-Rex系统。该调节方法的另一变化方案是将转录活化因子与在结合小分子后介导二聚作用和/或核输入的结构域相融合。实例是雷帕霉素调节系统，生物素或类固醇结合结构域与转录活化因子相融合。

用于调节表达的另一些系统依赖于DNA修饰酶的使用。在这样的设置中，表达盒的侧翼为各DNA修饰酶的识别位点。可用于该目的的酶包括例如cre重组酶、Flp重组酶、Phi31整合酶、大范围核酸酶或经改造的锌指核酸酶。

用以调节表达的另一系统是将各基因与促进与小分子结合的结构域相融合。该方法的一个实例是雌激素结合结构域。

用以调节永生化基因的功能的另一方法是重组蛋白的受控降解。在该设置中，将去稳定化结构域(destabilization domain)与重组基因相融合。当该构建体被引入哺乳动物细胞时，该基因被表达，但蛋白质迅速降解。添加稳定去稳定化结构域的小分子也引起各重组蛋白的稳定。使得在蛋白质水平进行该调节的若干系统描述于例如Iwamoto等，Chem Biol.2010年9月24日，17(9)：981-8和Banaszynski等，Cell.2006年9月8日；126(5)：995-1004中。

可调节或可诱导的基因表达特别可用于上述的本发明方法的任选步骤(iii)。基因表达也可以是细胞类型特异性的，其可通过细胞类型特异性启动子或细胞类型特异性增强子或者通过启动子和增强子二者的组合来实现，例如对于心肌细胞而言的αMHC或Myh6启动子、对于内皮细胞而言的tie2启动子或ICAM2启动子、对于树突细胞而言的CD11c启动子、对于肝细胞而言的白蛋白或α1抗胰蛋白酶或甲胎蛋白启动子、对于肠上皮细胞而言的vilin或细胞角蛋白18启动子、对于神经元细胞而言的tau或巢蛋白启动子或者对于胰β细胞而言的胰岛素启动子。

在一个优选实施方案中，所述基因、基因产物或功能等同物(i)只提供于步骤的一部分具有有限寿命之细胞中和/或(ii)只表达于一部分所述细胞中。其中，提供有所述基因、基因产物或功能等同物的一部分细胞可大于表达或产生所述基因、基因产物或功能等同物的一部分细胞。该实施方案的一个优点是可以永生化未与其他细胞分离和/或不能从其他细胞分离(例如因为细胞数目太小，该类型的细胞与其他细胞物理连接(使得不便于、难以或无法分离)，或者通过用于细胞分离的已知方法不能接近的细胞)的特定细胞类型。该实施方案的原理是与一种或更多种其他细胞类型在一起的一种细胞类型比其他细胞分裂得更快，因此其竞争过所述其他细胞或其生长超过所述其他细胞，从而便于在永生化之前可不便于、难以或无法进行的其分离。

本发明还涉及本发明的细胞或细胞系或者载体或载体组合在以下中的用途：细胞测定(例如，测试细胞对化合物的应答)、3d细胞培养模型的建立、组织工程、与一种或更多种不同细胞系的细胞共培养，和/或细胞包封，即(i)通过人造半透膜保护移植细胞免受免疫排斥，潜在地允许移植(同种异体移植或异种移植)而无需免疫抑制，或者(ii)允许解毒，例如应对急性肝衰竭，或者(iii)允许疾病例如糖尿病中的代谢。

本发明还涉及本发明的细胞或细胞系或者载体或载体组合在治疗或预防以下中的用途：退行性疾病、器官或细胞损伤/功能失常(例如，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多系统萎缩、尼曼匹克病、动脉粥样硬化、进行性核上性麻痹、癌症、泰-萨克斯病(Tay-Sachs Disease)、糖尿病、心脏病、圆锥角膜、炎性肠病(IBD)、前列腺炎、骨关节炎、骨质疏松症、类风湿性关节炎、亨廷顿病、肝硬化、年龄相关黄斑变性、急性肝衰竭、痴呆、中风、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨损伤、贫血、哮喘、高血压、癫痫、慢性疼痛)、感染性疾病(例如乙型、丙型肝炎、HIV、流行性感冒)、与免疫系统相关的病症(例如，移植物对宿主反应(graft-versus-host reaction)、变态反应、全身性红斑狼疮、败血症、多发性硬化症、银屑病)、癌症、心理病症(例如创伤、压抑、精神分裂症)或肥胖。

附图简述

以下附图仅为本发明的示例，并且不应以任何方式解释为限制如由所述权利要求书所示的本发明的范围。

图1：转导永生化慢病毒载体的永生化表达盒的设置。将第三代慢病毒载体用作基因表达盒的骨架。以3′LTR的缺失(其感染后破坏5′启动子的活性)使所有慢病毒载体自失活。编码永生化基因的表达盒包含SV40启动子和单独的永生化基因(无选择盒)或与选择标志物新霉素组合(有选择盒)。在后者的情况下，新霉素的转录通过内部核糖体进入位点(Polio-IRES)起始。在表达盒的3′设置乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)。通过PCR确定所建立细胞系中基因的存在。为此，将结合于SV40启动子中的引物用作正向引物，并且将特异性识别各永生化基因的引物用作反向引物。在没有选择盒的条件下转导以下基因：PymT、HoxA9、Bmi1、Id3、Myb、core、Klf4、Oct3/4、Rex1、Bcl2。在有选择盒的条件下转导以下基因：Myc、β-cat、Id1、TAg、Fos、E2f1、Jun、Ns1、Sox2、Id2、Lmo2、Nanog、Nfe212、Yap1、E7、E6、Gli1、Suz12、Ezh2、Zfp217、RhoA、v-Myc、Id4。PRE：乙型肝炎病毒转录后调节元件；cppt：中央聚嘌呤道(central polypurine tract)；immo.基因：上述扩增基因之一；RSV：劳氏肉瘤病毒启动子；PCR-for：正向引物；PCR-Rev：反向引物；Polio-IRES：脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点；SV40-Pro：SV40启动子。

图2：不同细胞类型的永生化。感染并扩增所示人原代细胞。所示为所建立细胞系的累积群体加倍(cumulative population doubling)的有代表性的实例。在所有情况下，使用模拟感染作为对照。在角膜上皮细胞和成骨细胞的情况下，这些细胞在感染后14天停止其分裂，并因此未包含于图中。

图3：永生化的数字代码。所示为引起各细胞类型永生化的感染。对于不同细胞类型使用了以下缩写：人成纤维细胞-人包皮(d1/d2)和人成体真皮成纤维细胞；人ost-人成骨细胞；chondro-人软骨细胞；人kera-人角质形成细胞(包皮d2/ad-成体d1)；ma-牛巨噬细胞；stro-人骨髓基质细胞(d1/d2/d3/d4/d5)；肺-肺上皮细胞(d1/d2)；成纤维细胞-鼠耳成纤维细胞；内皮细胞(幼体)-人脐带内皮细胞；endo细胞-人成体微血管内皮细胞；cor-人角膜上皮细胞。来自不同供体的细胞由d1、d2等表示。列表示被用于感染的基因。在建成永生细胞系之后分离基因组DNA(感染后至少30次群体加倍)。采用PCR分析来确定整合入永生化细胞系的基因。为了产生永生化的数字图谱，将检测基因标记为“1”，不存在的基因表示为“0”。灰色框代表未用于各感染的那些基因。

图4：专门化内皮细胞系的建立。所示为导致HUVEC细胞永生化的感染。列表示用于感染的基因。在建成永生细胞系之后分离基因组DNA(感染后至少30次群体加倍)。采用PCR分析来确定整合入永生化细胞系的基因。将通过PCR检测的基因表示为“1”，而不存在的基因表示为“0”。灰色框代表未用于各感染的那些基因。在第一轮感染中，采用所有基因或者至少10种不同基因的随机混合物。除永生化基因的PCR确定以外，还针对内皮特异性标志物的表达来对细胞系进行分析。在之后的感染轮中使用最合适的细胞系(和基因组合)以使缩窄负责永生化HUVEC的基因的组。除缩窄基因的组之外，针对内皮特异性标志物的表达对所建立的细胞系进行表征。在第三轮中，所有组合导致HUVEC永生化，并且给出具有期望表型的细胞系。作为实例，采用Myc、Id1、Fos的感染示于图6、7和8中。

图5：干扰素信号转导的分析。监测从转基因MxLuc2小鼠(Pulverer等，J Virol.2010年9月；84(17)：8626-38.)中分离的鼠耳成纤维细胞的干扰素信号转导。按照之前所述(May等，J Biotechnol.2005年10月17日；120(1)：99-110)分离耳成纤维细胞。通过常规方法(使用SV40大T抗原-TAg)以及通过本文所述的技术建立细胞系。为此，使用以下永生化组合(永生化基因组合物参见实施例：1-10＝Inf1；11-20＝Inf2；21-29＝Inf3；MBG＝Inf4；ALL＝Inf5)。在有或没有鼠干扰素(500U/ml)的条件下培养所建立的细胞系及原代细胞。24小时之后，收获细胞并针对萤光素酶的活性进行分析以监测干扰素信号转导。

图6：所建立的内皮细胞系的表征。针对内皮特异性表面标志物(Pecam-1-CD31、Tie1、Tie2、VEGFR2-CD309)的表达对所建立的HUVEC和HMVEC细胞系进行分析。所示为有代表性的细胞系的数据。通过用fos、Id1和Myc感染来建立HUVEC细胞系(ex.HUVEC)，并在大于90的累积群体加倍时进行分析。通过用Id1、Id2、Id3、Fos、TAg、E7、HoxA9、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2、Gli1感染来建立HMVEC细胞系(ex.HMVEC)，并在大于40的累积群体加倍时进行分析。在该分析中包括同批的原代HUVEC(prim.HUVEC)和原代HMVEC(prim.HMVEC)作为比较。通过流式细胞术确定各标志物蛋白质的表达。经染色细胞以深灰色表示，同工型(isotype)对照以浅灰色表示。

图7：活化内皮细胞(endothel)的表征。在有或没有TNFα(25ng/ml)的条件下活化所建立的HUVEC和HMVEC细胞系，并针对被活化的内皮细胞的标志物进行分析。TNFα活化内皮细胞，其可通过表面标志物CD54(ICAM1)、CD62E(E-选择素)和CD106(VCAM)的上调来测量。所示为有代表性的细胞系的数据。通过用fos、Id1和Myc感染来建立HUVEC细胞系(ex.HUVEC)，并在大于40的累积群体加倍时进行分析。通过用Id1、Id2、Id3、Fos、TAg、E7、HoxA9、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2、Gli1感染来建立HMVEC细胞系(ex.HMVEC)，并在大于40的累积群体加倍时进行分析。在该分析中包括同批的原代HUVEC(prim.HUVEC)和原代HMVEC(prim.HMVEC)作为比较。通过流式细胞术确定各标志物蛋白质的表达。未受刺激的细胞以浅灰色表示，受刺激的细胞以深灰色表示，同工型对照以虚线表示。

图8：内皮细胞功能的表征。针对内皮特异性功能对所建立的HUVEC和HMVEC细胞系以及原代HMVEC进行分析。部分该分析是确定产生第二信使一氧化氮(eNOS)的eNos合酶的活性、乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)的摄取以及确定血管生成能力(其通过matrigel测定(管形成)来分析)。所示为有代表性的细胞系的数据。通过用fos、Id1和Myc感染来建立HUVEC细胞系(ex.HUVEC)，并在大于40的累积群体加倍时进行分析。通过用Id1、Id2、Id3、Fos、TAg、E7、HoxA9、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2、Gli1感染来建立HMVEC细胞系(ex.HMVEC)，并在大于40的累积群体加倍时进行分析。在该分析中包括原代HMVEC(prim.HMVEC)作为比较。通过流式细胞术使用eNOS底物(DAF-2DA)来确定eNos合酶的活性。该底物是非荧光底物并且在通过eNOS合酶转化之后变为荧光的。因此，可以通过流式细胞术(eNos行-浅灰色细胞未被染色；深灰色-用DAF-2DA孵育的细胞)来确定该转化。可通过流式细胞仪使用荧光标记的acLDL来确定acLDL的摄取。随着细胞对acLDL的累积，摄取acLDL的细胞变为荧光的(acLDL行-浅灰色细胞未被染色；深灰色-用荧光标记的acLDL孵育的细胞)。可通过matrigel包被上管的形式来测量细胞的血管生成能力。为此，用matrigel包被细胞培养皿。基于该涂层，添加单细胞溶液。如果细胞具有血管生成潜能(管形成行)，则它们装配为管样结构。

图9：采用细胞类型特异性启动子的细胞特异性永生化。从肝分离鼠细胞，并用慢病毒的混合物感染。这些自失活的慢病毒驱动33个永生化基因由组成型但普遍的SV40启动子表达。相反，编码增强的绿色荧光蛋白的自失活慢病毒通过肝细胞特异性白蛋白启动子驱动转基因表达(A)。感染之后，原代细胞扩增，记录累积群体加倍，表明细胞系被永生化的。所示为用c-myc和Klf4(正方形)及Fos、E7、Klf4、Lmo2(三角形)建立的细胞系的累积群体加倍(B)。进一步针对eGFP表达对所建立的细胞系进行分析以确定所建立的细胞系是否为肝细胞来源。为此，进行明场图像(C；F)、荧光图像(D；G)和流式细胞术(E；H)分析。通过c-myc和Klf4(C；D；E)建立的细胞系示出同源的eGFP荧光信号。这证实该细胞系来自原代肝细胞，并示出肝细胞功能。通过Fos、E7、Klf4和Lmo2(F；G；H)建立的细胞系示出异源的eGFP信号，这表明该细胞系来自肝细胞和另一细胞类型。

实施例

下述实施例仅出于说明的目的，并且不以任何方式限制上述发明。

实施例1：永生化基因的鉴定

本发明技术的目的是不限数目地提供生物相关哺乳动物细胞。为了解决现有细胞系建立过程中的限制，我们鉴定了可诱导哺乳动物细胞永生化的33个不同基因。在该基因的组中包括病毒癌基因、哺乳动物癌基因、在肿瘤细胞中过表达的基因和抑制分化的基因。所使用的永生化基因列于表1中，其中给出了在本说明书中所使用的简写。另外，提供了得自NCBI数据库的官方基因名称、基因ID和基因符号以及基因所来自的物种/生物体。所使用的细胞基因来自人或者来自小鼠。但是，本发明还可使用来自其它物种的同源物。

表1所使用基因的汇总

^＊就丙型肝炎病毒的核心蛋白而言，不存在基因ld。HCV核心蛋白是从由多个基因构成的mRNA切割的并且所使用的基因对应于NCBI参考序列NP_751919.1。

实施例2：原代细胞中永生化基因的重组表达

为了实现原代细胞的永生化，需要在原代哺乳动物细胞中重组表达永生化基因。为此，可以采用允许永生化基因重组表达的任何基因或蛋白质转导方法。此外，可以采用任何能够诱导永生化基因表达的基因表达盒(整合入或者不整合入宿主细胞基因组中)。

在下述实施例中，使用慢病毒颗粒转导原代细胞，并使用SV40启动子驱动永生化基因的表达。所使用的慢病毒载体是第三代自失活的慢病毒载体。在这些慢病毒质粒中，已接连地减少病毒序列。在该载体代中，不仅缺失了附属基因vpr、nev、rev和gag/pol，还修饰了病毒LTR使得缺失了病毒启动子/增强子序列。此外，在5′LTR中，包括RSV启动子而非wtHIV启动子。为了提高滴度，将额外的元件(1)中央聚嘌呤道(cppt)和(2)乙型肝炎病毒的翻译后调解元件(PRE)包含进慢病毒载体中。将这些元件布置在表达盒的5′(cppt)和3′(PRE)。

表达盒包含SV40启动子和单独的永生化基因(无选择盒)或与选择标志物新霉素组合(有选择盒)。在后者的情况下，新霉素的转录通过内部核糖体进入位点(Polio-IRES)起始。将乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)置于表达盒的3’。所使用的不同载体设置的示意于图1中。

在没有选择盒的条件下转导以下基因：PymT、HoxA9、Bmi1、Id3、Myb、core、Klf4、Oct3/4、Rex1、Bcl2。

在有选择盒的条件下转导以下基因：Myc、β-cat、Id1、TAg、Fos、E2f1、Jun、Ns1、Sox2、Id2、Lmo2、Nanog、Nfe212、Yap1、E7、E6、Gli1、Suzl2、Ezh2、Zfp217、RhoA、v-Myc、Id4。

还将编码肝细胞特异性白蛋白启动子的表达盒整合入自失活慢病毒骨架中。表达盒包含鼠白蛋白增强子和启动子区，其后为报告基因增强的绿色荧光蛋白及土拔鼠肝炎病毒(WPRE)的翻译后调节元件。

就病毒颗粒的产生而言，采用基于四种不同质粒的磷酸钙沉淀的瞬时转染方法。在具有来自ViraPowerTM慢病毒表达系统(Invitrogen)的慢病毒辅助质粒的HEK293T细胞中进行慢病毒颗粒的产生。在转染前一天，将HEK293T细胞以约20000个细胞/cm²的细胞密度铺板。就磷酸钙沉淀而言，将编码辅助功能gag/pol(pLPl)、rev(pLP2)和VSVg(pVSVg)表面蛋白的四个质粒与转移质粒(参见表达构建体的上述列表)之一混合。就面积为140cm²的培养皿的转染而言，使用的下述量的不同质粒：14μgpLP1(gag/pol)、4，6μg pLP2(rev)；7，8μg pLP/VSVg(VSVg)、20μg转移质粒(具有永生化基因的表达构建体或白蛋白报告构建体)。

将不同质粒重悬于500μl的250mM CaCl₂溶液中，然后在连续涡旋的条件下将该混合物逐滴加入500μl的HEBS溶液中，然后，在室温下保持10分钟用于沉淀。将该悬液加入HEK293T细胞的培养基中。在接下来的一天，吸出培养基，并添加15ml新鲜培养基。24小时后，收集包含慢病毒颗粒的上清液。对于再生产，再向生产细胞添加15ml新鲜培养基，24小时后，收集包含慢病毒颗粒的上清液。用0.45μm滤器过滤包含慢病毒的上清液以除去细胞碎片，并在-70℃下保存直至使用。

使用NiH3T3细胞评价各慢病毒的滴度。在12孔板上进行滴定。为此，在感染前一天，铺板50.000个细胞。在感染当天，吸出培养基，向细胞添加包含病毒的上清液，保持12小时。感染的总体积为400μl，使用四种不同浓度的包含病毒的上清液(1μl；4μl；40μl；400μl)。另外，将聚凝胺加入感染物，终浓度为8μg/ml。取决于表达构建体，针对G418抗性(有选择盒)或者通过PCR针对转导/整合(无选择盒)对受感染的NiH3T3细胞进行滴定。

在感染后两天开始使用含1mg/ml G418的培养基针对G418抗性进行滴定。在选择两周之后，记录细胞的汇合度。在其它实验中，只使用那些在400μl、40μl和4μ1的HEK293细胞培养物上清液稀释液中产生汇合的板的病毒储液。通过受感染NiH3T3细胞的基因组DNA的PCR针对没有选择盒的表达构建体的转导/整合进行滴定。为此，在感染后两天分离受感染NiH3T3细胞的基因组DNA，并通过PCR测定永生化基因的整合。在下文中给出了DNA分离和PCR的细节。在其它实验中，只使用那些在1μ1的HEK293细胞培养物上清液的稀释液中示出永生化基因的整合的病毒储液。

就哺乳动物细胞系统的建立而言，混合具有不同永生化基因的慢病毒。为此，预混合具有足够滴度的病毒储液。将这些总混合物在-70℃下贮存于1ml等份中直至使用。如果未另外指明，则制备下述总混合物并用于感染：

All-包括全部永生化基因(如表1中所列)；

MBG-除TAg、E6、E7和Myc以外的全部永生化基因(如表1中所列)；

1-10-Id2、Fos、NS1、Jun、E2F1、βCat、Myb、Id3、Bcl2、HoxA9；

11-20-Bmi1、PymT、Core、Oct3、Klf4、Id1、Lmo2、Nfe2L2、Yap1、Nanog；

21-29-Sox2、RhoA、Ezh2、Gli1、v-Myc、Suz12、ZFP217、Id4、Rex。

实施例3：哺乳动物细胞系统的建立

所述技术允许建立不依赖于供体的物种、细胞类型、基因型或者供体的年龄的新哺乳动物细胞系。为此，可以用整个的33个永生化基因的组或者用永生化基因的合适的较小一部分转导目的原代细胞。在下述实施例中，使用来自不同物种(鼠、牛、人)、不同细胞类型(成纤维细胞、骨髓基质细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、角质形成细胞、肺上皮细胞、角膜上皮细胞、肝细胞)、不同基因型(成纤维细胞、骨髓基质细胞)以及来自年轻个体(人脐带内皮细胞和角质形成细胞)和成熟个体(人成体角质形成细胞、人成体微血管内皮细胞)的新哺乳动物细胞系的建立证实该技术的用途。但是，本发明技术不限于所述实施例，而是可适用于任何细胞类型和任何哺乳动物物种的细胞。同样，也可使用功能等同于所测试的那些基因的不同基因。

将所有原代细胞或细胞系在37℃下维持在具有5％CO₂的潮湿气氛中。使用下述原代细胞类型来进行永生化过程：原代人包皮成纤维细胞FS4(Gupta等，Proc Natl Acad Sci USA.1979年10月；76(10)：4817-21.)和hDP(Mujaj S等，Tissue Eng Part A.2010年4月，16(4)：1407-20中的分离细节)；人成体真皮成纤维细胞(Promocell GmbH)；用MxLuc2bac转基因的小鼠成体耳成纤维细胞(Pulverer等，J Virol.2010年9月，84(17)：8626-38；May等，2005年10月17日，120(1)：99-110中的分离细节)；人脐静脉内皮细胞(HUVEC-来自Pro Vitro GmbH)，人真皮微血管内皮细胞(HMVEC-来自Pro Vitro GmbH)；人表皮成体角质形成细胞(来自Pro Vitro GmbH)和来自包皮的人角质形成细胞(Aasen和Belmonte，Nat Protoc.2010；5(2)：371-82中所述的分离)；牛巨噬细胞(Werling等，Immunology.2004年1月；111(1)：41-52.中所述的分离)；成人成骨细胞(Hernandez等，Arthritis Rheum.2008年6月；58(6)：1696-700中的分离细节)；成人软骨细胞(Fay等，Arthritis Res Ther.2006；8(6)：R189中的分离细节)；成人肺上皮细胞(Elbert等，1999，PharmRes.1999年5月，16(5)：601-8中的分离细节)，成人骨髓基质细胞(Zhang等，Ann Hematol.1999年7月；78(7)：305-14中的分离细节)，角膜上皮细胞(来自Cell Systems GmbH)，成体鼠肝细胞(Haridass等.Am J Pathol.2009年10月；175(4)：1483-92中的分离细节)。

在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和100U青霉素、100μg/ml链霉素的IMDM中培养成纤维细胞、骨髓基质细胞、牛巨噬细胞和成骨细胞。在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM基础培养基中培养肝细胞。在HamF12和DMEM基础培养基的1∶1的混合物中培养软骨细胞和角膜上皮细胞。该混合物补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和100U青霉素、100μg/ml链霉素。在补充有SAGM SingleQuot试剂盒(Lonza)的SABM基础培养基中培养成体肺上皮细胞。在包含DermaLife^TM基础培养基和补料(LifeFactors K，CellSystems GmbH)的DermaLife K细胞培养基试剂盒中培养角质形成细胞。在补充有EGM-MV single quots(Lonza)的内皮细胞基础培养基EBM(Lonza)中培养HUVEC。在补充有EGM-2MV singlequots(Lonza)的内皮细胞基础培养基EBM-2(Lonza)中培养HMVEC。在包被有明胶的组织培养瓶中培养内皮细胞。为此，在37℃下，将细胞培养板用0.1％(HUVEC)或1％(HMVEC)明胶溶液包被30分钟。吸出明胶并将内皮细胞铺板。在常规组织培养瓶或包被有胶原蛋白I的瓶中培养角质形成细胞。

就永生化而言，将原代细胞接种在6孔培养板上，并用各病毒(总混合物或限定感染物)的组合进行感染。将细胞铺板以在感染当天达到80％的汇合。就感染而言，吸出培养基，向细胞添加1ml的慢病毒总混合物以及200μl的各培养基。在用少于10个永生化基因感染的情况下，使用100μl的每种慢病毒储液，用各培养基将感染体积设置为1ml。在肝细胞的情况下，感染混合物由以下组成：500μl的慢病毒永生化总混合物和500μl的白蛋白eGFP报告慢病毒以及200μl的培养基。所有感染物补充有终浓度为8μg/ml的聚凝胺。将原代细胞在37℃下于加湿气氛中感染8至12小时。在所有情况下，包括进未感染对照以确定原代细胞进入转折点(crisis)的时间点。

就细胞系的建立而言，采用了两种策略：用0.4mg/ml G418选择受感染细胞或者根据因永生化基因的表达而产生的其生长优势来对它们进行选择。就FS4细胞而言，比较两种策略，并在所建立细胞系的增殖方式和整合的永生化基因的方式方面得出了类似的结果。因此，如果判定原代细胞强增殖(例如，成纤维细胞、内皮细胞)，则应用选择策略，而如果原代细胞并非如此或者仅微弱地增殖(例如，角膜上皮细胞、成体真皮角质形成细胞)，则不应用选择压力。就细胞系的建立而言，合并集落并不依赖于G418抗性或增殖优势地进一步扩增。就细胞系的建立而言，当细胞达到汇合时，将细胞传代。在永生化过程开始时，细胞以1∶3的比例分开。细胞适于强增殖行为(表示它们在铺板后3天之内达到汇合)之后，根据细胞类型，分开比调节为1比5或1比10。不同人原代细胞的永生化结果示于图2中。感染并扩增所述人原代细胞。所示为一些所建立细胞系的累积群体加倍。

实施例4：鉴定负责永生化的基因

下一步骤是鉴定负责原代细胞永生化的基因。为此，开发用以检测存在于永生化细胞系的基因组中的基因的PCR策略。因为永生化基因或更佳的基因的组合赋予受感染的细胞的选择优势，所以在分离基因组DNA之前选择长扩增期(＞30个累积群体加倍)。这应确保所检测的基因的确负责永生化。

用以下方法分离基因组DNA。用PBS将细胞洗涤2次，每孔加入500μl(6孔)的裂解缓冲液(10mM Tris，pH7.5，10mM EDTA，10mM NaCl，0.5％十二烷基磺酸钠和1mg/ml蛋白酶(新鲜加入))。将所裂解的细胞转移到1.5ml塑料管中并在60℃下孵育过夜。次日，加入75mM醋酸钠(在乙醇中)(1ml)。将管在室温下孵育2小时，然后缓慢翻转以使得基因组DNA沉淀可见。然后，将DNA溶液在台式离心机中以5000rpm离心5分钟。然后，弃去上清液，用70％乙醇将沉淀洗涤两次。在最终洗涤之后，使沉淀干燥并溶解于30至50μl TE(10mM Tris，pH7.5，10mMEDTA)中，或者可替选地溶解在H₂O中，并在4℃下储存。

用于检测永生化基因的PCR策略的示意性汇总示于图1中。两种引物结合由慢病毒盒转导的表达盒。5’引物位于SV40启动子中，而3’引物对各永生化基因特异(表2)。

表2：用干检测永生化基因的引物列表

使用Mango-Taq聚合酶试剂盒(Bioline)进行PCR。退火温度为58℃，延伸时间为30秒。之后PCR在94℃下进行1分钟的变性步骤并重复30个循环。使用受感染细胞的0.1μg基因组DNA作为模板。用分开的PCR分析各基因。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR，将基因评分为不存在或存在。

将这些分析的结果编制成热图谱(图3)中。在该永生化热图谱中，描述引起所示细胞类型永生化的感染。列表示用于感染的基因。在建立永久细胞系(感染后至少30个群体加倍)之后，分离基因组DNA。采用PCR分析来确定整合于永生化细胞系中的基因。为了产生永生化数字图谱，将所检测的基因标记为“1”，不存在的基因表示为“0”。灰色框代表未用于各感染的那些基因。

就该分析而言，使用不同细胞类型、来自不同物种的细胞、来自不同供体的细胞和幼体细胞及成体细胞(图3)。从鼠源和人源建立成纤维细胞系。就人细胞而言，使用包皮(幼体)和真皮成纤维细胞(成体)。另外，使用来自两个不同供体(d1和d2)的包皮成纤维细胞。由人脐静脉内皮细胞(内皮细胞-幼体)以及由人微血管内皮细胞(内皮细胞-成体)建立人内皮细胞系。此外，建立了人角膜上皮细胞(cor)、成体(ad)和幼体(来自包皮)的人角质形成细胞(人kera)、来自5个不同供体的人骨髓基质细胞(stro)、人肺上皮细胞(肺)、牛巨噬细胞(ma)、人成骨细胞(人ost)和人软骨细胞(chondro)。

由热图谱的结果计算了各基因的频率。进行计算以对不同永生化基因进行分级。为此，用其中使用某基因的感染数目除以检测数。针对所有细胞类型并且还分别地仅针对成纤维细胞的感染进行该分级。用条纹加重的那些基因示出0.5或更大的频率(表3)。

表3：所建立细胞系中基因的频率

¹inf.＝感染；²det.＝检测到的；³fre＝频率。

该分级鉴定出(i)特别适于建立新哺乳动物细胞系的基因的组。这些基因是Id2、Fos、βcat、TAg、Myb、Id3、E7、E6、Bcl2、HoxA9、Bmi1、core、Klf4、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog、Sox2、RhoA、Ezh2、Gli1、Suz12、ZFP217，Id4、Rex，其中a)Id1、Id2和Id3是Id基因家族的成员，b)Nanog、Sox2和Klf4是参与维持多能性的基因，和c)E7、Fos、Myc、βcat、RhoA、Myb、Core、Lmo2、E6、SV40大T抗原、Yap1、Gli1、Suz12、Ezh2、Bmi1和Rex是促进细胞周期进展的基因；可以合理推测的是可以用相同类别的其它基因(即，在这些列表中未提到的那些，例如来自其它物种的同源物或来自相同基因家族的其它基因)替代这些基因；(ii)永生化基因的核心组，其示出0.5或更大的频率并且因此参与多于50％的感染中的永生化。重要地，该核心组的基因可根据细胞类型而变化。当将成纤维细胞和肝细胞永生化与所有永生化的分级进行比较时其变得明显。核心组的基因是Id2、Fos、TAg、Id3、E7、core、Id1、Myc、Lmo2、Nanog、Ezh2、Rex。

该技术的一个重要特征是其高效性。由不同原代细胞建立的所有细胞系均通过第一试验建立并且只用了一个感染周期。重要的是注意各细胞系的产生所需的时间取决于细胞类型。从该数据可以总结出，更幼的细胞(例如，HUVEC)或具有更大内在增殖能力的细胞(例如，成骨细胞、成纤维细胞)在60天内达到30个累积群体加倍，而从成熟个体分离的细胞(例如，HMVEC)或者从高度分化的细胞(例如，角膜上皮细胞)分离的细胞需要更长的时间(约80至90天)来达到30倍的累积群体加倍(表4)。

表4：产生新细胞系所需的时间

另一重要方面是有不止一个单一的用于永生化各细胞系的可能基因组合，而是鉴定出用于原代细胞的永生化多种不同组合。这些组合的一些实例列于表5中。

表5：赋予永生化的基因的组合

从表5明显的是，作为一般规律，适于细胞永生化的基因组合各自主要包含Id基因家族成员、参与维持多能性的基因和促进细胞周期进展的基因。因此，设想不是某些个体基因而是来自这些类别的基因为细胞永生化所需。因此，基因可被相同类别的其它基因取代。Id基因家族的合适基因是Id1、Id2、Id3和Id4，参与维持多能性的合适的基因是Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Lin28、miR290簇、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4、Utf1、Tcl1、Dppa3，以及促进细胞周期进展的合适的基因是E7、Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、β-联蛋白、Core、Lmo2、Ela、Elb、E6、Sv40大T抗原、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白b、细胞周期蛋白d、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7和Rex。

不落入任何这些类别的用于永生化的基因是Bcl-2、Bcl-X1、HoxB4、Tlx1、vGPCR、HoxA9、Hoxb8、Stat3、ZFP217。这些基因可用于补充基因类别的前述组合。

该技术的特征可用于建立设计者细胞系。这是因为永生化基因的每个组合为各细胞系赋予稍微不同的特征。该特征可用于建立这样的细胞系，例如被优化以用于在特殊表面涂层上增殖，或者被优化以用于在特殊培养基中增殖。对于内皮细胞而言，使用所述技术的特征来鉴定基因组合并因而建立保留内皮细胞的所有功能和特征的细胞系(数据参见图6、7、8)。为了鉴定各基因，使用所述技术来鉴定在第一轮感染中赋予永生化的基因。在第二轮感染中，这些基因或一部分基因用于永生化。重要地，分析所得细胞系的内皮特异性功能和特征。从最有希望的细胞系，在第三轮感染中使用永生化基因的组合以再次永生化HUVEC(参见图4，永生化基因不同组合的汇总)。来自该轮感染的所有组合示出期望特性，其中实例示于图6、7和8中。

实施例5：确定所建立细胞系的生物相关性

细胞系最重要的特性是其生理学，其应尽可能地类似于细胞在体内所显示出的生理学。因此，测试所建立细胞系的生物相关性。已知永生化常常干扰细胞信号转导通路。

作为实例，研究干扰素信号转导通路。I型干扰素(例如不同的干扰素α或干扰素β)是应答于病原体(例如病毒、细菌或寄生物)而诱导的分泌蛋白。I型干扰素以自分泌方式(对于分泌细胞)或旁分泌方式(对于邻近细胞)起作用。干扰素结合干扰素受体通过由Stat1/Stat2和IRF9构成的三聚复合物诱导下游信号转导。该复合物易位至核并与干扰素可诱导基因的启动子结合，从而活化其表达。迄今为止，鉴定了大约2000个干扰素可诱导基因。一个良好表征的干扰素可诱导基因是MX2基因。因此，可通过使用驱动报告基因萤光素酶表达的由Mx2启动子构成的报告系统间接测量干扰素信号转导的活化。

使用这样的基因报告构建体产生报告小鼠。该小鼠示出应答于干扰素以及不同病毒的萤光素酶报告基因的强诱导。重要地，在不存在诱导因子时，几乎检测不到报告蛋白的表达(Pulverer等，2010，J Virol.2010年9月；84(17)：8626-38)。当从小鼠分离原代细胞并用或不用干扰素处理时，观察到相同的诱导谱。但是，当通过常规方法(例如用SV40大T抗原进行永生化)建立来自这些原代细胞的细胞系时，表达特征受到强烈影响(图5)。用SV40大T抗原永生化的细胞系在不存在诱导因子干扰素时示出报告萤光素酶的较高基础表达。添加干扰素后，萤光素酶的表达增加。但是，与原代细胞相比，诱导因子小得多(图5)。这表明常规永生化强烈干扰干扰素信号转导。

因此，我们应用了本文所述的技术来建立示出特性可比得上体内情况的新细胞系。我们检测了在存在和不存在干扰素的情况下所产生的不同细胞系的报告基因萤光素酶的表达。建立的若干细胞系示出与体内情况相类似的干扰素系统的诱导特征，其特征在于在没有干扰素条件下的低萤光素酶表达，在干扰素处理后为强的可诱导表达(图5)。不同细胞系和原代细胞的诱导因子的比较表明，通过传统永生化(使用SV40大T抗原)建立的细胞系中干扰素信号转导发生改变，而原代细胞和使用本文所述的技术所产生的细胞系不受影响(图5)。

内皮细胞是与构成血管的专门化细胞。可借助于标志物蛋白(例如表面标志物CD31、CD309、Tie1或Tie2)来综合地表征内皮细胞。针对这些标志物的表达对使用本文所述的技术建立的内皮细胞系进行分析。在该分析中，还包括原代细胞以确定所建立的细胞系是否示出各标志物的类似的表达方式(图6)。结果表明，所建立的内皮细胞系类似于原代细胞，即体内情况。

内皮细胞的功能为控制血压、凝血和炎性过程等。这主要是通过其限制物质、小分子、细菌以及免疫细胞转运的屏障功能来介导的。从感染或炎症位点，分泌活化内皮的促炎性细胞因子，例如TNFα。该活化引起某些表面分子上调，其促进结合并最终还促进免疫细胞迁移通过内皮细胞层。参与该过程的表面分子是CD54(ICAM1)、CD62E(E-选择素)和CD106(VCAM)。因此，在不存在和存在TNFα的情况下，针对这些表面分子的表达对所建立的内皮细胞系进行分析。将原代细胞包括进该分析中作为比较。该分析披露没有促炎性细胞因子时，几乎检测不到表面分子，用TNFα刺激引起各表面分子增加(图7)。将得自原代细胞的结果与得自所建立细胞系的结果进行比较披露两种细胞系统类似地运行，因为整个细胞群体并非一致地应答于TNFα，而代替的是一部分内皮细胞变为活化的(图7)。

此外，可通过体外测定来确定内皮细胞的其它功能，例如新血管的产生(称为血管生成的过程)、第二信使一氧化氮的产生或乙酰化低密度脂蛋白的摄取。针对所建立的内皮细胞系以及原代细胞进行这些测定。不同测定表明，所建立的内皮细胞系保留正常内皮的全部功能(图8)。

就表面标志物的分析而言，用胰蛋白酶/EDTA解聚内皮细胞，然后用对内皮细胞标志物特异的单克隆抗体进行孵育：CD31、Tie1、Tie2、CD309、CD54、CD62e、CD106。在室温下，将细胞在PBS中2％胎牛血清中用荧光标记的一抗(CD31、CD309、CD54、CD62e、CD106)孵育30分钟。根据制造商的说明书使用抗体浓度。就未标记的一抗(Tie1、Tie2)而言，在第一孵育(在室温下30分钟)之后用PBS洗涤细胞，然后在室温下再用荧光标记的二抗孵育30分钟。随后，用PBS中的2％胎牛血清洗涤细胞，离心并最终将细胞沉淀重悬于PBS中的2％胎牛血清中，然后通过流式细胞仪进行分析。

就acLDL的摄取而言，在37℃下用4μg/ml acLDL(标记有BodipyFITC，分子探针)将细胞培养4小时。孵育之后，用PBS将细胞洗涤两次，用胰蛋白酶/EDTA解聚并离心。重悬细胞沉淀并通过流式细胞术进行分析。对于eNOs合酶活性的确定而言，在室温下，用DAF-2DA(1μM)将细胞孵育30分钟。随后，用PBS将细胞洗涤两次，用胰蛋白酶/EDTA解聚并离心。重悬细胞沉淀并通过流式细胞术分析。就通过流式细胞术分析而言，应用SSC/FSC斑点印迹来排除细胞碎片(FSC＜200)。针对各荧光信号对剩余的门控细胞进行分析并绘制为柱状图。

通过标准matrigel测定监测体外血管形成。matrigel是Engelbert-Holm-Swarm肿瘤细胞的基质富含产物(其主要成分为层粘连蛋白)。对于matrigel测定而言，在37℃下，用matrigel将96孔包被30分钟。向每孔接种4＊10⁴个细胞，并培养过夜。通过显微镜分析来评价管结构形成。

从由不同细胞类型构成的组织中分离原代细胞。从而，对于细胞类型，原代细胞的新鲜分离的培养物极经常是异源的。如果期望特定细胞类型的永生化，则这样的细胞类型混合物使得难以永生化。这是因为不同细胞类型具有不同增殖潜能的事实。另外，不同细胞类型之间的永生化和转导效率显著不同。因此，对直接从组织分离的原代细胞进行的永生化优先建立易于转导并且示出最强增殖的来源细胞的细胞系。对于大多数组织而言，该细胞类型是成纤维细胞。为了促进来自细胞类型混合物的特定细胞类型的永生化，本文所述的技术可以与驱动报告基因表达的细胞类型特异性启动子组合。

为此，如Haridass等.Am J Pathol.2009年10月；175(4)：1483-92中所详细示出的，从肝组织分离原代鼠肝细胞。在分离之后进行感染之前，将该细胞类型混合物培养过夜。除慢病毒永生化混合物以外，还包含由肝细胞特异性的白蛋白启动子驱动报告基因eGFP的表达的慢病毒。如实施例3中所述建立细胞系。重要地，白蛋白驱动eGFP使得在整个实验中区分肝细胞系和非肝细胞系。为此，通过荧光显微镜或者通过流式细胞仪分析各细胞系。

就流式细胞仪分析而言，用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶/EDTA解聚，离心，之后重悬细胞沉淀。就通过流式细胞仪进行分析而言，应用SSC/FSC斑点印迹来排除细胞碎片(FSC＜200)。针对eGFP荧光信号分析剩余的门控细胞，并绘制为柱状图。就荧光显微镜分析而言，将细胞铺板在组织培养板上，并用装配有来自OmegaOptical的过滤组件以进行eGEP可视化的荧光显微镜(Zeiss Axiovert135TV)进行分析。

Claims

1.用于使具有有限寿命的细胞永生化的方法，其包括以下步骤：

(i)提供具有有限寿命的细胞，

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或基因产物或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或基因产物或其功能替换，

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述促进BMP信号转导活化的基因或基因产物是DNA结合抑制因子(Id)家族的成员，优选地，所述Id家族成员选自：Id1、Id2、Id3和Id4。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述参与维持多能性的基因或基因产物是其靶基因参与维持多能性的转录调节因子，优选地选自：Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4和Utf1。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述参与维持多能性的基因或基因产物选自：Lin28、miR290簇、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Tcl1和Dppa3。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述促进细胞周期进展的基因通过失活至少一个以下的肿瘤抑制因子起作用：p53、p21、pRB、p16Ink4a、p19ARF、p14ARF或p27。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述促进细胞周期进展的基因是细胞或病毒来源的。

7.根据权利要求6中任一项所述的方法，其中细胞来源的所述促进细胞周期进展的基因选择自：Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、β-联蛋白、Lmo2、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白b、细胞周期蛋白d、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7和Rex，并且其中所述选择优选包括：Fos、Myc、RhoA、Myb、β-联蛋白、Lmo2、Yap1、Suz12、Ezh2、Bmi1和/或Rex，更优选Fos、Myc和/或Ezh2。

8.根据权利要求6中任一项所述的方法，其中细胞来源的所述促进细胞周期进展的基因选择自：E7、Core、E1a、E1b、E6、vGPCR和/或Sv40大T抗原，其中所述选择优选包括：E7、Core、E6和/或Sv40大T抗原，更优选E7和core。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞中表达一种或更多种选择自Bcl-2、Bcl-X1、HoxB4、Tlx1、HoxA9、Hoxb8、Stat3和ZFP217的其它基因，其中所述选择优选包括Bcl-2、HoxA9和/或ZFP217。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述促进细胞周期进展的基因或基因产物选自：Fos、E7、core、Ezh2和Myc，其中所述参与维持多能性的基因或基因产物选自Nanog和Klf4，并且其中所述Id家族成员选自Id1、Id2、Id3和Id4。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述具有有限寿命的细胞来自具有特定遗传背景的个体或个体组，其中所述特定遗传背景优选与野生型相差至少一个突变、缺失、重复、SNP相关变异和/或染色体畸变。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其还在步骤(ii)之后包括在所述永生化细胞中终止或减慢增殖、诱导衰老和/或诱导分化的任选步骤(iii)。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述基因的所述提供是细胞类型特异性的和/或可调节的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述基因或基因产物仅在步骤(i)的一部分所述具有有限寿命的细胞中提供，和/或其中所述基因仅在一部分所述细胞中表达。

15.使用权利要求1至14中任一项所述的方法可产生的细胞或细胞系。

16.包含至少一个表达盒的载体，所述表达盒包含与至少一种基因有效连接的表达控制序列，或者各包含至少一个表达盒的载体组合，所述表达盒包含与至少一种基因有效连接的表达控制序列，其中所述载体或载体组合指导各自选自以下类别之一的至少两种基因以及任选地促进选择已转导细胞的一种或更多种基因或基因产物的表达：

(a)促进BMP信号转导活化的基因或基因产物或其功能替换，

(b)参与维持多能性的基因或其功能替换，或者

(c)促进细胞周期进展的基因或其功能替换。

17.根据权利要求16所述的载体或载体组合，其中所述促进细胞周期进展的基因选择自：E7、Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、β-联蛋白、Core、Lmo2、E1a、E1b、E6、vGPCR、Sv40大T抗原、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白b、细胞周期蛋白d、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7和Rex，并且其中所述选择优选包括E7、Fos、Myc、RhoA、Myb、β-联蛋白、Core、Lmo2、E6、Sv40大T抗原、Yap1、Suz12、Ezh2、Bmi1和/或Rex，更优选Fos、Core、Myc、E7和/或Ezh2；其中所述参与维持多能性的基因选择自：Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Lin28、miR290簇、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4、Utf1、Tcl1和Dppa3，其中所述选择优选包括Nanog、Klf4、Sox2，更优选Nanog和/或Klf4，和/或其中所述促进BMP信号转导活化的Id基因或基因产物选择自：Id1、Id2、Id3和Id4，并且任选地包括选择自Bcl-2、Bcl-X1、HoxB4、Tlx1、vGPCR、HoxA9、Hoxb8、Stat3和ZFP217的一个或更多个其它基因，其中所述选择优选包括Bcl-2、HoxA9和/或ZFP217。

18.根据权利要求15所述的细胞或细胞系或者根据权利要求16至17所述的载体或载体组合在细胞测定、3d细胞培养模型的建立、组织工程、与一种或更多种不同细胞系的细胞共培养和/或细胞包封中的用途。

19.根据权利要求15所述的细胞或细胞系或者根据权利要求16至17所述的载体或载体组合在治疗或预防退行性疾病、器官或细胞的损伤/功能失常、与免疫系统相关的病症、癌症、心理病症或代谢疾病如肥胖症中的用途。