CN109097335A - 正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肝干细胞恶性转化技术领域,公开了一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤;所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。本发明通过沉默TG737、过表达MiR‑10b、沉默miR‑200a和过表达CD44,实现了将正常肝干细胞向肝癌干细胞的恶性转化,从而利用本发明的诱导方法可以为肝癌的研究提供实验模型,利于肝癌疾病的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法。
背景技术
肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌类型,也是占全球癌症相关死亡原因的第三位。HCC是一个复杂、多步骤的过程与各种遗传因素改变的累积有关。HCC患者虽然可以经过手术切除、消融、化疗栓塞、索拉菲尼等方案治疗,但是由于肿瘤侵袭性高,肝内扩散及肝内转移频繁导致预后效果极差,5年内生存率低于5%。因此,提高对HCC复杂的分子机制的理解对于开发新的治疗策略至关重要。
肝干/祖细胞(liver stem/progenitor cells,LSPCs)具有很高的增殖潜能,可能是唯一能在积累一定突变后转化为启动HCC的细胞。LSPCs还可能维持这些突变并将它们传递给子代肝细胞,导致LSPCs的恶性转化为肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs),从而导致HCC启动。大多数癌症是通过基因中突变的积累来实现的,这些基因决定着细胞的增殖、细胞周期、细胞分化和侵袭。可以想象,改变调控细胞周期、细胞增殖、细胞分化和细胞侵袭的编码和非编码基因可能对LSPCs的恶性转化具有显著的影响。
有一小部分癌细胞构成了自我维持的细胞库,具有独特的自我更新和维持肿瘤增殖的能力,称为癌症干细胞(CSCs)。CSCs具有与相应正常干细胞相似的基因表达谱和与性质,同时在维持恶性肿瘤增殖、侵袭、转移和复发方面起着决定性作用。越来越多的科学研究表明,CSCs存在于各种人类肿瘤中包括HCC。此外,在某些病理过程中,CSCs可能来自正常干/祖细胞的恶性转化。
虽然HCC细胞的确切来源仍然未知,但是过去几年累积的数据表明,由LSCPs转化的LCSCs,很可能代表驱动癌症发展的细胞。因此,利用这种细胞做好相关研究有可能为开发更有效的癌症治疗开辟新的曙光,并可能为开发有效消灭癌症细胞提供机会。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题,本发明目的在于提供一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,具体地,涉及正常肝干细胞(WB-F344)向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法。
WB-F344细胞系购买自中国科学院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库。
本发明所采用的技术方案为:
一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤;所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。
进一步的,四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44。
进一步的,所述正常肝干细胞为WB-F344。
进一步的,所述诱导方法的具体步骤包括:
A、构建可诱导慢病毒载体系统,得到慢病毒载体;
A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统,转录因子为TG737和miR200a,得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体;
A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统,转录因子为miR10b和CD44,得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体;
B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞,挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养,通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆,得到肝癌干细胞。
进一步的,所述步骤B中,步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括:TG737、miR10b、miR200a和CD44。
进一步的,还包括步骤C、肝癌干细胞培养:
C1、培养:将步骤B的肝癌干细胞采用Williams's E培养基培养,得到培养后肝癌干细胞;
C2、转染:将培养后肝癌干细胞用加入了慢病毒载体的聚凝胺-基质培养基培养,得到转染肝癌干细胞;
C3、克隆:将转染肝癌干细胞用完全培养基依次进行培养,传代培养后,得到传代肝癌干细胞;
C4、药物筛选:从传代肝癌干细胞中药物筛选出肝癌干细胞。
进一步的,所述步骤C1的具体步骤是:步骤B的肝癌干细胞在12孔板中,以2×105个肝癌干细胞/孔,每孔加入1mL含有质量分数为10%的FBS的Williams's E培养基。
进一步的,所述步骤C2中培养后肝癌干细胞的密度为肝癌干细胞饱和密度的50-70%;所述步骤C2中慢病毒载体为步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带转录因子的慢病毒载体;慢病毒载体的加入量为10ug/孔;聚凝胺-基质培养基的加入量为1mL/孔,每空中聚凝胺的最终浓度为5ug/mL;所述步骤C2的培养时间为12h。
进一步的,所述步骤C3的培养的时间为12h;传代培养的时间为48h;传代培养转染肝癌干细胞的比例为1:3。
进一步的,所述药物筛选的药物为嘌呤霉素二盐酸盐,所述嘌呤霉素二盐酸盐在每孔中最终的浓度为10ug/mL。
本发明的有益效果为:本发明的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法通过沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44,实现了将正常肝干细胞向肝癌干细胞的恶性转化,从而利用本发明的诱导方法可以为肝癌的研究提供实验模型,利于肝癌疾病的研究。
附图说明
图1是本发明的转染组与非转染组细胞形态变化图。
图2是本发明的转染组与非转染组细胞通过Transwell迁移测定评估细胞的体外迁移能力图。
图3是本发明的转染组与非转染组细胞计数情况图。
图4是本发明的转染组与非转染组细胞在球体形成能力中的表示图。
图5是本发明的转染组与非转染组细胞通过qRT-PCR测量细胞中EpCAM,CD133,ABCG2,CK19,AFP,ALB和c-myc的表达癌症干细胞标志物图。
图6是本发明的转染组与非转染组细胞通过WB检测E-cadherin,N-cadherin,vimentin等间充质特性相关蛋白表达图。
图7是本发明的转染组与非转染组细胞异种移植物介导的致瘤性图。
图中:A表示非转染组;B表示转染组。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤;所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。
进一步的,四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44。
进一步的,所述正常肝干细胞为WB-F344。
进一步的,所述诱导方法的具体步骤包括:
A、构建可诱导慢病毒载体系统,得到慢病毒载体;
A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统,转录因子为TG737和miR200a,得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体;
A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统,转录因子为miR10b和CD44,得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体;
B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞,挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养,通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆,得到肝癌干细胞。
进一步的,所述步骤B中,步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括:TG737、miR10b、miR200a和CD44。
进一步的,还包括步骤C、肝癌干细胞培养:
C1、培养:将步骤B的肝癌干细胞采用Williams's E培养基培养,得到培养后肝癌干细胞;
C2、转染:将培养后肝癌干细胞用加入了慢病毒载体的聚凝胺-基质培养基培养,得到转染肝癌干细胞;
C3、克隆:将转染肝癌干细胞用完全培养基依次进行培养,传代培养后,得到传代肝癌干细胞;
C4、药物筛选:从传代肝癌干细胞中药物筛选出肝癌干细胞。
进一步的,所述步骤C1的具体步骤是:步骤B的肝癌干细胞在12孔板中,以2×105个肝癌干细胞/孔,每孔加入1mL含有质量分数为10%的FBS的Williams's E培养基。
进一步的,所述步骤C2中培养后肝癌干细胞的密度为肝癌干细胞饱和密度的50-70%;所述步骤C2中慢病毒载体为步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带转录因子的慢病毒载体;慢病毒载体的加入量为10ug/孔;聚凝胺-基质培养基的加入量为1mL/孔,每空中聚凝胺的最终浓度为5ug/mL;所述步骤C2的培养时间为12h。
进一步的,所述步骤C3的培养的时间为12h;传代培养的时间为48h;传代培养转染肝癌干细胞的比例为1:3。
进一步的,所述药物筛选的药物为嘌呤霉素二盐酸盐,所述嘌呤霉素二盐酸盐在每孔中最终的浓度为10ug/mL。
具体地,正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法包括步骤:
1、构建短发夹RNA(shRNA)可诱导慢病毒载体系统,所述转录因子选自:TG737;miR200a;
2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统,所述转录因子选自:miR10b;CD44;
3、所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染正常肝干细胞,挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养,通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆,得到肝癌干细胞。
4、所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括:TG737、miR10b、miR200a和CD44。
5、将细胞以2×105个细胞/孔培养在12孔板中,每孔加1ml Williams's E培养基,含10%的FBS。
6、细胞培养密度至50-70%时进行转染,此时,移去旧培养基,加入1ml聚凝胺-基质培养基(聚凝胺的最终浓度为5ug/ml)。
7、将可诱导慢病毒以10ug/孔加入到培养基中。
8、克隆的产生是在12小时以后,用1mL完全培养基(不含聚凝胺)代替之前培养基,再次培养12小时。
9、将细胞以1:3的比例进行传代培养,在完全培养基中培养48小时。
10、用嘌呤霉素二盐酸盐(最终浓度为10ug/mL)选择稳定的表达克隆(使用选择的青霉素以杀死未感染的细胞)。
肝癌干细胞的干细胞特性鉴定:
根据本发明的方法,所述步骤B获得的细胞进行肝癌干细胞特性鉴定包括:实时定量PCR对肿瘤干性基因和侵袭迁移相关基因的检测,如EpCAM,CD133,ABCG2,CK19,AFP,ALB和c-myc的表达;免疫蛋白印迹(western blot,WB)检测细胞间充质特性和迁移能力相关蛋白表达,如E-cadherin,N-cadherin,vimentin。
指标为:
1.细胞形态发生改变,更加修长。
2.肿瘤干细胞表面特异性标记EpCAM,CD133,ABCG2,CK19,AFP,ALB和c-myc的表达。
3.EMT过程侵袭、迁移性相关特异性标记E-cadherin,N-cadherin,vimentin。
4.细胞成球能力。
5.体外毒性抵抗能力。
6.筛选的细胞皮下注射先天性免疫缺陷小鼠后形成肿瘤。
实施例
以下实施例中用到的培养基:
WB-F344细胞:Williams's E培养基,具体组成:90%Williams's E培养基(购自HyClone,Logan,UT);10%的胎牛血清(购自Invitrogen,Carlsbad,CA);100U/ml青霉素;100U/ml链霉素。
以下实施例中所使用的原始慢病毒载体GV232-Puro,购自Genechem中国上海分公司。
以下实施例中通用的细胞培养产品均购自HyClone公司。
实施例
1、慢病毒载体的构建:包装好病毒质粒和空载质粒。
2、细胞培养:WB-F344细胞(购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库)的培养:传代时37℃下0.25%胰酶消化5min,使用10%FBS的Williams's E培养基终止反应,吹打后按1比3传代。
3、转染:按照Invitrogen公司转染试剂盒(Lipofectamine 2000)的说明书,使用转染试将包装好的病毒质粒和空载质粒分别转染WB-F344细胞。
具体步骤:转染实验前一天铺WB-F344细胞于24孔板中,使第二天细胞可生长至90%满,对于一个孔,加入10ug含可诱导基因的慢病毒,轻轻混匀后,放置于37℃细胞培养箱培养。在细胞培养基中加入嘌呤霉素二盐酸盐(1mg/mL,Sigma,St.Louis,MO)以进行抗性选择。当未转染可诱导基因的慢病毒的对照组中的细胞全部被杀死时,挑取嘌呤霉素抗性细胞克隆并在含有第一轮选择中在一半浓度嘌呤霉素(0.5mg/mL)的培养基中传代培养。
4、细胞形态检测:将转染组与非转染组放置于光学显微镜下观察,发现非转染组结构紧密,具有上皮样表型的椭圆形细胞,如图1左图所示。而转染组细胞部分呈梭形,类似于间充质细胞,如图1右图所示。
5、Transwell小室检测体外细胞侵袭能力:利用Transwell小室对细胞的迁移和侵袭能力进行实验。将细胞按照1*105的密度接种至小室内,加入不含FBS的培养基,在下层6孔板孔中加入含FBS的培养基。培养24小时后,对下层细胞进行结晶紫染色。Transwell实验结果显示,在相同的孵育条件下,转染组的细胞跨膜活性显著高于非转染组,如图2所示。表明转染以后的细胞的侵袭迁移能力得到了明显的增强。
6、细胞增殖能力的检测:已知具有干/祖细胞特性的肿瘤干细胞具有自我更新的能力,在此检测转染后的细胞自我更新能力和增殖能力情况,如图3所示,在相同时间,相同条件培养下转染组细胞数量明显多于非转染组,说明转染后能促进WB-F344细胞增殖生长,并呈时间依赖性的效果。
7、细胞球体形成能力检测:将转染组与非转染组细胞用胰酶消化成单细胞悬液,以2.0*103/孔的密度接种于24孔低粘附培养板(Corning,USA),每组3-6孔,细胞培养在无血清的Williams's E培养基、添加B27(l:50,Invitrogen,USA)、20ng/mL hEGF(Invitrogen,USA)、20ng/mL bFGF(R&D Systems,USA)、40U/mL肝素(Sigma,USA)、2mM谷氨酰胺(Sigma,USA)、100U/mL青霉素(Sigma,USA)、100U/mL链霉素(Sigma,USA)、5ug/mL胰岛素(Sigma,USA)和0.5ug/mL氢化可的松(Sigma,USA)。每天晃动培养板1-2次防止细胞粘连,每3天添加一次培养基,15-20天后在光镜下观察细胞球,拍照并计数每孔中细胞球数目。结果如图4所示,转染组成球数量多于非转染组,成球体积也明显更大。
8、qRT-PCR检测肝癌干细胞标志物的表达:为了进一步确定转染后细胞的特征,通过qRT-PCR检查预测的肝癌干细胞标志物的表达。如图5所示,在转录组细胞中EpCAM、CD133、ABCG2、CK19和AFP的表达比在非转录组细胞中高得多。表明转录可诱导病毒后的WB-F344细胞中的肝干细胞样样特征。
9、检测EMT相关标记蛋白:免疫印迹检测了上皮(E-cadherin)和间充质(N-cadherin,Vimentin)标志物的蛋白表达。如图6所示,在转染组细胞中检测到下调的E-cadherin和上调的N-cadherin以及Vimentin。基于实施例4中形态学变化以实施例5细胞中显示的生物学和生物化学行为,我们可以得出结论:转染组细胞获得更强的EMT表型。
10、转染组细胞成瘤能力的影响:BALB/c裸鼠,雌性,5-6周龄,购自成都达硕生物科技有限公司。分别将转染组细胞和非转染组细胞以2.0*106细胞接种到裸鼠皮下,每组6只。接种后每周观察肿瘤生长情况。当观察到明显肿瘤块出现时,切下肿瘤组织,测量肿瘤大小。结果如图7所示,非转染都出现肿瘤块,转染组中5只裸鼠出现明显的肿瘤块形成。
综上,本发明的诱导方法成功将正常肝干细胞向肝癌干细胞进行了恶性转化,达到了预期的效果。
本发明不局限于上述可选的实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制,本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准,并且说明书可以用于解释权利要求书。
Claims (10)
1.一种正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述诱导方法包括在正常肝干细胞中同时失调四种转录因子联合诱导出肝癌干细胞的步骤;所述四种转录因子分别为TG737、miR10b、miR200a和CD44。
2.根据权利要求1所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:四种转录因子的具体失调方式分别为沉默TG737、过表达MiR-10b、沉默miR-200a和过表达CD44。
3.根据权利要求2所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述正常肝干细胞为WB-F344。
4.根据权利要求3所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述诱导方法的具体步骤包括:
A、构建可诱导慢病毒载体系统,得到慢病毒载体;
A1、构建短发夹shRNA可诱导慢病毒载体系统,转录因子为TG737和miR200a,得到短发夹shRNA可诱导慢病毒载体;
A2、构建真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体系统,转录因子为miR10b和CD44,得到真核表达载体pcDNA3.1可诱导慢病毒载体;
B、将步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式感染正常肝干细胞,挑选形态类似肝癌干细胞的克隆传代培养,通过筛选符合肝癌干细胞特性的细胞克隆,得到肝癌干细胞。
5.根据权利要求4所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述步骤B中,步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括:TG737、miR10b、miR200a和CD44。
6.根据权利要求5所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:还包括步骤C、肝癌干细胞培养:
C1、培养:将步骤B的肝癌干细胞采用Williams's E培养基培养,得到培养后肝癌干细胞;
C2、转染:将培养后肝癌干细胞用加入了慢病毒载体的聚凝胺-基质培养基培养,得到转染肝癌干细胞;
C3、克隆:将转染肝癌干细胞用完全培养基依次进行培养,传代培养后,得到传代肝癌干细胞;
C4、药物筛选:从传代肝癌干细胞中药物筛选出肝癌干细胞。
7.根据权利要求6所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述步骤C1的具体步骤是:步骤B的肝癌干细胞在12孔板中,以2×105个肝癌干细胞/孔,每孔加入1mL含有质量分数为10%的FBS的Williams's E培养基。
8.根据权利要求7所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述步骤C2中培养后肝癌干细胞的密度为肝癌干细胞饱和密度的50-70%;所述步骤C2中慢病毒载体为步骤A1和A2得到的慢病毒载体以组合形式携带转录因子的慢病毒载体;慢病毒载体的加入量为10ug/孔;聚凝胺-基质培养基的加入量为1mL/孔,每空中聚凝胺的最终浓度为5ug/mL;所述步骤C2的培养时间为12h。
9.根据权利要求8所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述步骤C3的培养的时间为12h;传代培养的时间为48h;传代培养转染肝癌干细胞的比例为1:3。
10.根据权利要求9所述的正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法,其特征在于:所述药物筛选的药物为嘌呤霉素二盐酸盐,所述嘌呤霉素二盐酸盐在每孔中最终的浓度为10ug/mL。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006033769A2 (en) * | 2004-08-26 | 2006-03-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Assays and compositions for identification of cancer associated liver stem cells |
US20090028878A1 (en) * | 1997-09-18 | 2009-01-29 | Ivan Bergstein | Novel methods of cancer diagnosis and therapy targeted against a cancer stem line |
CN102181399A (zh) * | 2011-03-09 | 2011-09-14 | 上海市肿瘤研究所 | 一种cd133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法 |
CN103266084A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-28 | 刘卫辉 | 富集干细胞的三步分离法 |
CN103282498A (zh) * | 2010-11-02 | 2013-09-04 | 亥姆霍兹感染研究中心有限责任公司 | 用于细胞永生化的方法和载体 |
CN107513520A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-12-26 | 刘超 | 一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及相应细胞 |
-
2018
- 2018-08-29 CN CN201810998108.2A patent/CN109097335B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090028878A1 (en) * | 1997-09-18 | 2009-01-29 | Ivan Bergstein | Novel methods of cancer diagnosis and therapy targeted against a cancer stem line |
WO2006033769A2 (en) * | 2004-08-26 | 2006-03-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Assays and compositions for identification of cancer associated liver stem cells |
CN103282498A (zh) * | 2010-11-02 | 2013-09-04 | 亥姆霍兹感染研究中心有限责任公司 | 用于细胞永生化的方法和载体 |
CN102181399A (zh) * | 2011-03-09 | 2011-09-14 | 上海市肿瘤研究所 | 一种cd133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法 |
CN103266084A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-28 | 刘卫辉 | 富集干细胞的三步分离法 |
CN107513520A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-12-26 | 刘超 | 一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及相应细胞 |
Non-Patent Citations (11)
Title |
---|
SAKABE T等: "Prognostic relevance of miR-137 in patients with hepatocellular carcinoma", 《LIVER INT》 * |
WEI-HUI LIU等: "Stages based molecular mechanisms for generating cholangiocytes from liver stem/progenitor cells", 《WORLD JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY》 * |
刘卫辉: "大鼠肝干细胞和肝癌干细胞间生物学特性差异分析及相关分子调控机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)医药卫生科技辑》 * |
刘广欣等: "肝癌干细胞的研究进展", 《现代肿瘤医学》 * |
姜姗等: "肝癌干细胞标志物CD44在化学诱癌过程中的变化及意义", 《广东医学》 * |
尤楠: "抑癌基因Tg737在肝细胞癌发生发展中作用机制的研究", 《中国学位论文全文数据库》 * |
汤丽娟等: "肝癌干细胞调控机制及治疗靶点的研究进展", 《医学研究生学报》 * |
罗娅等: "肝细胞肝癌诱导分化治疗研究进展", 《世界华人消化杂志》 * |
谢渭芬等: "肝细胞癌的诱导分化治疗", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 * |
邵平等: "肝癌干细胞靶向治疗的研究进展", 《临床肝胆病杂志》 * |
陈武桂等: "RNA干扰Semaphorin 4D表达对乳腺癌细胞增殖、周期及迁移的影响", 《肿瘤》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109097335B (zh) | 2022-08-19 |
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